胆汁cfDNA中的HDR信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用的制作方法

本发明属于生物医学检测，具体涉及胆汁cfdna中的hdr信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用。

背景技术：

1、胆管癌(cholangiocarcinoma，cca)是第二大最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占所有胃肠道癌症的3％，特别是在中国、泰国和韩国等地区，每10万居民中cca发病率＞6例。由于其早期症状不明显或无特异性临床表征，患者往往在cca的晚期才被确诊，晚期患者已不适合手术，导致预后较差，5年生存率为7％-20％，即使部分患者能够通过手术干预治疗，肿瘤切除后也很容易复发。肿瘤tnm分期高、切缘阳性、淋巴结转移等是影响胆管癌术后生存的高危因素，但这些指标需要影像学或组织标本才能确认。血清癌胚抗原(cea)和糖类抗原19-9(ca19-9)也被用于胆管癌的术后监测，但敏感性和特异性较低。尤其是，临床中尚缺乏用于胆管癌预后预测的生物标志物及其检测手段。因此，找到可靠的预后生物标志物对cca的诊疗具有重要的临床应用价值。

2、目前影像学、活体刷检、穿刺活检和血清肿瘤标志物检测是诊断胆管癌的主要方法。其中影像学方法主要包括超声检查、ct(计算机断层扫描)、mri(核磁共振成像)、pct(经皮肝穿刺胆道造影)、ercp(内镜下逆行胰胆管造影)等。超声检查是胆管癌的首选检测方法，但是不能区分恶性肿瘤的分期。ct和mri是胆管癌诊断和分期的主要方式，mri更能显示肝、胆管的解剖及肿瘤受累范围，但是检测直径小于5mm的肿瘤时效果不佳。ercp的刷检脱落细胞检查是胆管癌首选的病理学诊断方法，但刷检的敏感性较低，当刷检结果阴性或不能确定时，可以考虑ercp或超声内镜引导的细针穿刺活检，但容易导致腹腔的感染和肿瘤的扩散转移，目前临床指南不推荐该技术用于胆管癌首次诊断。cea和ca19-9在胆管癌的诊断、疗效、转移复发监测有一定的意义，与超声检查相结合可以作为高危人群的初步检查手段，但是敏感度和特异度均比较低。

3、液体活检基于其微创或无创的取样方式、样本用量少、可重复采集等优势，被用于肿瘤疾病的辅助诊断、疗效评估、术后监测、指导临床用药等。血液是液体活检中应用最为广泛的体液类型，但是对于胆管癌来说，胆汁经肝细胞分泌后由胆管转入胆囊内浓缩储存参与整个肝肠循环，能够与肝胆和消化系统直接接触，是比血液更优的体液类型。有研究显示胆道癌患者胆汁cfdna检测体细胞基因突变的敏感性要显著性优于血液cfdna(pmid：34653800)。对胆汁cfdna进行靶向深度测序，与肿瘤组织的结果对比发现胆汁cfdna检测的敏感性和特异性均大于90％(pmid：31173267)。然而，关于胆汁cfdna全基因组测序的研究是及其缺乏的，限制了从基因组图谱角度揭示cca疾病进展、早期诊断、术后监测等方面的应用。因此，迫切需要胆汁cfdna全基因组测序的研究数据，助力cca在早期诊断、疗效评估、术后检测等生物标志物的临床转化。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供胆汁cfdna中的hdr信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用。提供用于cca预后的液体活检生物标志物，助力cca的术后治疗，延长cca患者的存活时间和生存质量。

2、本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

3、检测胆汁cfdna中hdr信号通路突变的试剂在制备胆管癌预后评估产品中的应用。

4、作为优选实施方案，胆汁cfdna中hdr信号通路突变的标志物选自smc5、rad51d、brca2、tp53bp1、rtel1中的一种或多种。

5、作为优选实施方案，所述检测胆汁cfdna中hdr信号通路突变的试剂包括胆汁cfdna抽提试剂、胆汁cfdna文库构建试剂、靶向测序试剂。关于胆汁cfdna抽提试剂，本发明采用上海思路迪生物医学科技有限公司建立的适用于胆汁cfdna的抽提方法3d-bcf，还可采用其他商品化的体液cfdna抽提试剂盒。关于胆汁cfdna文库构建试剂，本发明实施例中采用truseq nano dna library prep kit进行胆汁cfdna全基因组文库构建，另外还可采用：a.scale ssdna-seq lib prer kit for illumina(rk20222,abclonal)；b.ultratmii dna library prep kit for illumina(#e7645s/#e7103s,neb)；c.kapa dna hyperprep kit(kk8504，roche,switzerland)。靶向测序试剂是针对hdr信号通路的基因进行靶向测序，然后通过与参考序列进行比对，对突变基因进行筛选。常用的靶向测序平台及试剂为：illumina miseqdx仪器搭配miseq reagent kit v2(ms-102-2003)；thermofisher scientific ion genestudio s5system测序仪器搭配ion 540chip kit(a27766)；华大基因mgiseq-2000测序仪器搭配mgiseq-2000rs高通量测序试剂套装(1000013857)。

6、本发明还提供一种胆管癌预后评估试剂盒，该试剂盒包括检测胆汁cfdna中hdr信号通路突变的试剂。

7、作为优选实施方案，所述试剂盒包括cfdna抽提试剂、胆汁cfdna文库构建试剂、靶向测序试剂。

8、作为优选实施方案，所述试剂盒还包括胆汁样本采集试剂，用于采集待测样本的胆汁并进行保存。

9、作为优选实施方案，所述cfdna抽提试剂包括胆汁样本前处理试剂、胆汁cfdna提取试剂。胆汁样本前处理试剂对胆汁样本进行前处理的方法为：将胆汁在4℃条件下1,600g离心10min去除细胞碎片，离心完成后转移胆汁上清至新的1.5ml的离心管中。胆汁上清再次在4℃条件下16,000g离心15min，最后转移上清液，按每管1ml分装于1.5ml离心管中置于-80℃冰箱中保存。

10、本发明中涉及的英文缩写注释如下：

11、cfdna：游离于细胞外的部分降解了的机体内源性dna

12、cca：胆管癌

13、hdr：同源重组(homologous dependent recombination，hdr)通路

14、smc5：编码染色体结构维持蛋白smc5/6复合体中smc5蛋白的基因

15、rad51d：编码dna修复蛋白rad51蛋白家族成员的基因

16、brca2：人乳腺癌易感基因2(breast cancer 2,early onset)

17、tp53bp1：编码肿瘤蛋白p53结合蛋白1的基因

18、rtel1：编码dna解旋酶rtel1的基因

19、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

20、1，本发明基于恶性胆管肿瘤患者胆汁为研究样本，抽提胆汁cfdna，采用whole-genome sequence二代测序技术检测胆汁cfdna的单核苷酸变异(snv)和插入缺失突变(indel)，通过将体细胞突变与来自外部队列(n＝239)的肿瘤组织全外显子组测序结果进行比较，分析胆汁cfdna突变特征与临床预后的相关性，发现hdr信号通路突变是可用于cca预后评估的液体活检检测手段。

21、2，本发明利用illumina novaseq 6000测序平台对胆汁cfdna文库进行测序，然后先通过与人类参考基因组序列进行比对再以自身白细胞的基因图谱做标椎化，最后对突变基因进行筛选。首次发现胆管癌患者胆汁cfdna中smc5、rad51d、brca2、tp53bp1和rtel1这5个hdr信号通路突变基因可作为cca预后评估的液体活检生物标志物。