一种用于降解苯胺类物质的复合菌群及其应用的制作方法

1.本发明涉及苯胺生物降解技术领域，尤其涉及一种用于降解苯胺类物质的复合菌群及其应用。


背景技术：

2.苯胺是染料工业的重要中间体之一，同时也是农药、医药、橡胶和塑料工业的重要原料。在苯胺类化合物的工业生产和使用过程中，会产生大量废水，这类废水存在极大的潜在环境风险，是公认的高毒性难降解废水，其中含有的苯胺类物质化学性质稳定、难降解、易富集，易持久滞留在环境和生物体内，是一种严重污染环境和危害人体健康的污染物。
3.目前，苯胺类废水的处理方法主要集中在物理、化学和生物法上。物理法如吸附法、萃取法和膜分离法，存在成本高、易造成二次污染、膜被污染后难以清理或分离效果差的问题。化学法主要包括电化学催化法和氧化分解法，往往存在能耗大、成本高、设备复杂等问题。生物法利用微生物作用分解苯胺类物质，具有能耗小、成本低、操作简单、无二次污染的优点，相较于物理和化学方法而言更加经济环保。但由于苯胺类废水存在毒性强、可生化性差的特点，菌体在苯胺类废水中的生长繁殖易受到较大的抑制，造成其对苯胺类物质的降解速度慢、降解率低，限制了生物法处理苯胺类废水的发展。因此，开发对苯胺类物质具有高耐受性和降解能力的菌剂，对于苯胺类物质的生物法处理具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了解决苯胺类物质可生化性差、难以被微生物高效降解的技术问题，本发明提供了一种用于降解苯胺类物质的复合菌群及其应用。该复合菌群中，陶厄氏菌、极端嗜高温菌、短小芽孢杆菌之间能发挥较好的协同作用，赋予复合菌群较好的苯胺类物质耐受能力和降解能力，同时，该复合菌群还具有较好的耐盐性能。
5.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种用于降解苯胺类物质的复合菌群，包括陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌；所述陶厄氏菌命名为baa19，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24299，微生物分类命名为thauera humireducens。
6.本发明的复合菌群中，陶厄氏菌baa19经鉴定属于陶厄氏属(thauera)内的菌种thauera humireducens(该菌种目前尚无中文译名)。该菌株对苯胺类物质(包括苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺)具有较高的耐受性，能够高效降解苯胺类物质，同时还能适应较高的盐度和较宽的ph范围，在高盐和较强的酸碱性下仍能有效降解苯胺，这能降低对应用环境的要求，当用于废水处理时能简化预处理中水质调节的流程。而在现有技术中，尚未报道过thauera humireducens这一菌种内有菌株具备降解苯胺类物质的能力。
7.在复合菌群中，各菌株之间会存在复杂的相互作用关系，影响各菌的生长和代谢，进而表现出协同或拮抗效果。本发明发现，陶厄氏菌baa19与极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌
之间均能产生协同作用，相较于三种菌的单菌而言，将其复配构成复合菌群能够有效提高对苯胺类物质的降解效果，且该复合菌群具有较好的耐盐性能，在高盐和高苯胺浓度下对苯胺的降解效果明显优于陶厄氏菌baa19单菌。
8.作为优选，所述极端嗜高温菌命名为gw-2，已在2019年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18012，微生物分类命名为chelativorans composti(该菌种目前尚无中文译名)。
9.作为优选，所述短小芽孢杆菌命名为ad 0599，已在2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.17611，微生物分类命名为bacillus pumilus。
10.作为优选，所述复合菌群中，陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌的活菌数之比为1:0.2～1.5:0.2～2.8。
11.进一步地，所述复合菌群中，陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌的活菌数之比为1:0.5:0.7。
12.第二方面，本发明提供了一种用于降解苯胺类物质的复合菌剂，包括所述复合菌群。
13.作为优选，所述复合菌剂为菌液或固体菌剂，包括所述复合菌群和适合所述复合菌剂生长的培养基。
14.第三方面，本发明提供了一种用于降解苯胺类物质的生物制剂，所述生物制剂为由所述复合菌群或者所述复合菌剂制得的全发酵液或胞内物质提取物。
15.第四方面，本发明提供了所述复合菌群或者所述复合菌剂或者所述生物制剂在降解苯胺类物质中的应用，所述苯胺类物质包括苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺中的一种或多种。
16.第五方面，本发明提供了所述复合菌群或者所述复合菌剂或者所述生物制剂在废水生物处理中的应用，所述废水中含有苯胺类物质；所述苯胺类物质包括苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺中的一种或多种。
17.与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)在本发明的复合菌群中，陶厄氏菌baa19能够高效降解苯胺类物质，且对应用环境的要求较低，在较高的盐度和较宽的ph范围内，均能实现苯胺的高效降解，而目前在关于同一菌种(thauera humireducens)的研究中，尚未报道过其中存在能够降解苯胺类物质的菌株；(2)在本发明的复合菌群中，陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌之间能发挥较好的协同作用，有效提高对苯胺类物质的降解能力，且具有较高的耐盐性能。
具体实施方式
18.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
19.总实施例一种用于降解苯胺类物质的复合菌群，包括陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌；所述陶厄氏菌命名为baa19，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24299，微生物分类命名为thauera humireducens。
20.作为一种具体实施方式，所述极端嗜高温菌命名为gw-2，已在2019年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18012，微生物分类命名为chelativorans composti。
21.作为一种具体实施方式，所述短小芽孢杆菌命名为ad 0599，已在2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.17611，微生物分类命名为bacillus pumilus。
22.作为一种具体实施方式，所述复合菌群中，陶厄氏菌、极端嗜高温菌和短小芽孢杆菌的活菌数之比为1:0.2～1.5:0.2～2.8，进一步优选为1:0.5:0.7。
23.一种用于降解苯胺类物质的复合菌剂，包括所述复合菌群。
24.作为一种具体实施方式，所述复合菌剂为菌液或固体菌剂，包括所述复合菌群和适合所述复合菌剂生长的培养基。
25.一种用于降解苯胺类物质的生物制剂，所述生物制剂为由所述复合菌群或者所述复合菌剂制得的全发酵液或胞内物质提取物。
26.所述复合菌群或者所述复合菌剂或者所述生物制剂在降解苯胺类物质中的应用，所述苯胺类物质包括苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺中的一种或多种。
27.所述复合菌群或者所述复合菌剂或者所述生物制剂在废水生物处理中的应用，所述废水中含有苯胺类物质；所述苯胺类物质包括苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺中的一种或多种。
28.实施例1：陶厄氏菌baa19的获得(1)培养基的配制：按照以下配方，配制lb培养基：蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl 10.0g/l；ph＝7。固体培养基加入质量分数2％的琼脂粉。
29.按照以下配方，配制驯化培养基：苯胺2000mg/l，kh2po
4 3g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso4.7h2o 0.2g/l，nacl 0.5g/l，微量元素液1ml/l；ph＝7。固体培养基加入质量分数2％的琼脂粉。
30.上述微量元素液的配方如下：feso4·
7h2o 3.6g/l，znso4·
7h2o 0.3g/l，mnso4·
h2o0.02g/l，cuso4·
5h2o 0.25g/l，cocl2·
6h2o 0.1g/l，溶剂为水。
31.(2)驯化步骤：医药化工活性污泥
→
玻璃珠打散
→
驯化培养基(含苯胺2000mg/l)中
→
30℃、150r/min摇床震荡培养一段时间
→
直至体系明显浑浊、cod明显下降、nh
3-n明显上升
→
多批次驯化
→
直至有机氮氨化率》80％，视为驯化结束。
32.(3)高通量测序和单菌分离：驯化结束后，对体系进行高通量测序，相对丰度大于1％的属见表1。从表1可以看出：陶厄氏属(thauera)占比最大，占比66.8％。
33.表1属相对丰度(％)thauera66.8chryseobacterium7.75unclassified_comamonadaceae2.97
taibaiella2.66proteiniphilum2.02unclassified_microbacteriaceae1.56sedimentibacter1.37unclassified_porphyromonadaceae1.22采用lb培养基对驯化结束后体系中的菌株进行分离培养，获得菌株baa19。
34.(4)菌种鉴定：菌株baa19的形态学和生理生化特征如下：革兰氏阴性菌，可在厌氧条件下生长。在lb固体平板上培养3d，菌落呈1.0～1.2mm大小、边缘光滑、凸起、不透明。细胞具有单个鞭毛。温度生长范围为10～45℃(最适25～35℃)，ph生长范围为6.0～10.0(最适7.5～8.0)，nacl生长范围为0～6％(最适0～1％)，(g+c)含量为65.8mol％，呼吸醌为q-8。
35.菌株baa19的16s rrna基因序列如seq id no:1所示，具体如下：no:1所示，具体如下：
将baa19的16s rrna基因序列在ezbiocloud数据库中比对，最相似菌种为thauerahumireducens dsm 100429
t
，相似度为99.77％。
36.综上，菌株baa19鉴定为thauera humireducens。该菌株已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24299，微生物分类命名为thauera humireducens。
37.实施例2：陶厄氏菌baa19降解苯胺的能力(1)种子液的制备：菌株baa19在lb固体培养基(同实施例1)上30℃培养3d，挑取单菌落。将单菌落接种至lb液体培养基(同实施例1)中，150r/min、30℃下培养至od
600
＝1.0后，作为种子液。
38.(2)ph对苯胺降解的影响：取ph分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的驯化培养基(除ph外其余成分均同实施例1，含苯胺2000mg/l)100ml于250ml锥形瓶内，将种子液按照20％的接种量接种于驯化培养基中，混匀后置于摇床150r/min、30℃下震荡培养3d后，离心分离出上清液，检测上清液中的cod和有机氮含量，并计算cod和有机氮去除率(即有机氮氨化率)，结果见表2。
39.表2ph6.06.57.07.58.09.010.0cod去除率(％)73.287.689.679.557.948.520.4有机氮去除率(％)83.998.098.492.775.340.18.7结果显示，菌株baa19降解苯胺的最适ph为6.5～7.0。当ph在6.0～8.0范围内时，菌株baa19具有较高的苯胺降解能力，能实现50％以上的cod去除率和70％以上的有机氮去除率。
40.(3)温度对苯胺降解的影响：取驯化培养基(同实施例1，含苯胺2000mg/l)100ml于250ml锥形瓶内，将种子液按照20％的接种量接种于驯化培养基中，混匀后置于摇床150r/min、不同温度(分别为10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)下震荡培养3d后，离心分离出上清液，检测上清液中的cod和有机氮含量，并计算cod和有机氮去除率，结果见表3。
41.表3温度(℃)10202530354045cod去除率(％)38.361.078.289.689.058.423.5有机氮去除率(％)12.975.790.398.498.274.711.2结果显示，菌株baa19降解苯胺的最适温度为30～35℃。
42.(4)盐度对苯胺降解的影响：取nacl含量分别为0.5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l(即盐度分别为0.05％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％)的驯化培养基(除nacl外其余成分均同实施例1，含苯胺2000mg/l)100ml于250ml锥形瓶内，将种子液按照20％的接种量接种于驯化培养基中，混匀后置于摇床150r/min、30℃下震荡培养3d后，离心分离出上清液，检测上清液中的cod和有机氮含量，并计算cod和有机氮去除率，结果见表4。
43.表4盐度(％)0.051.02.03.04.05.0
cod去除率(％)89.688.870.654.750.221.3有机氮去除率(％)98.499.182.573.641.610.5结果显示，菌株baa19降解苯胺的最适盐度为0.05％～1.0％。当盐度升高到2.0％时，菌株baa19对苯胺的降解能力有所下降，但仍能实现苯胺的高效降解，能够使cod和有机氮去除率分别达到70.6％和82.5％；当盐度为3.0％时，仍能维持50％以上的cod去除率和70％以上的有机氮去除率；当盐度升高至4.0％时，cod去除率可达50％，而有机氨去除率有明显下降；当盐度升高至5.0％时，可能是由于菌株生长受到了较大的抑制，其对苯胺的降解效果较差。
44.(5)时间对苯胺降解的影响：取驯化培养基(同实施例1，含苯胺2000mg/l)100ml于250ml锥形瓶内，将种子液按照20％的接种量接种于驯化培养基中，混匀后置于摇床150r/min、30℃下震荡培养不同时间(分别为2d、3d)后，离心分离出上清液，检测上清液中的cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量，并计算cod和有机氮去除率，结果见表5。
45.表5 0d2d3d3d去除率cod4810mg/l1957mg/l500mg/l89.6％nh
3-n10mg/l142mg/l246mg/l-有机氮253mg/l118mg/l4mg/l98.4％tn263mg/l260mg/l250mg/l4.9％综上，在摇瓶静态体系中的试验表明，菌株baa19能高效降解苯胺，且能适应ph 6.0～8.0的酸碱度、20～40℃的温度和0.05％～3.0％的盐度，在该条件下，三天内能实现50％以上cod去除率和70％以上有机氮去除率。菌株baa19降解苯胺的最适条件为：ph 6.5～7.0、温度30～35℃、nacl盐度0.05％～1.0％，在最适条件下，三天内cod去除率可达85％以上，最高可达89％以上，有机氮去除率可达98％以上，最高可达99％以上。
46.实施例3：陶厄氏菌baa19在低盐度和高盐度下对高浓度苯胺的降解能力(1)种子液的制备：同实施例2。
47.(2)模拟废水的配制：按照以下配方，配制低盐度模拟废水：苯胺10000mg/l，kh2po
4 3g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso4.7h2o 0.2g/l，nacl 0.5g/l，微量元素1ml/l；ph＝7。
48.按照以下配方，配制高盐度模拟废水：苯胺10000mg/l，kh2po
4 3g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso4.7h2o 0.2g/l，nacl 20g/l，微量元素液(配方同实施例1)1ml/l；ph＝7。
49.(3)低盐度苯胺废水模拟试验：试验装置为连续进出水装置，包括依次相连的进水池、菌种处理处和出水池。每个池体有效容积3l，进水池用以投加营养物质以调节水质，容纳进水，底部安装有搅拌系统；菌种处理池为菌种生化处理池，底部安装曝气系统；进水池内废水用蠕动泵提升至菌种处理池；出水池用于收集处理后废水。
50.起初为清水启动，在清水中补充kh2po4和(nh4)2so4作为p源和无机n源以辅助菌种生长。向菌种处理池中投加填料至池体容积的1/3以截留菌种，减少流失。将种子液按照
20％的接种量接种到低盐度模拟废水中，搅拌均匀后，通入试验装置中，控制菌种处理池中溶解氧含量(do)为2～4mg/l，ph为6.5～7.0，温度为30～35℃，水力停留时间(hrt)为5天。在连续进出水装置中，对各池加盖以减少挥发。每天对出水进行基本水质检测，待出水水质达到稳定，计算稳定后2周的出水中cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量的平均值，结果见表6。
51.表6 进水出水去除率cod24230mg/l4100mg/l83.1％nh
3-n0mg/l500mg/l-有机氮1230mg/l40mg/l96.7％tn1230mg/l540mg/l56.1％结果显示，菌株baa19对高浓度(10000mg/l)苯胺具有较好的耐受性和降解效果，5天内对cod的去除率可达83.1％，有机氮去除率可达96.7％，总氮去除率可达56.1％。
52.(4)高盐度苯胺废水模拟试验：将低盐度模拟废水换成高盐度模拟废水，按照相同的方法进行模拟试验。每天对出水进行基本水质检测，待出水水质达到稳定，计算稳定后2周的出水中cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量的平均值，结果见表7。
53.表7 进水出水去除率cod24230mg/l6500mg/l73.2％nh
3-n0mg/l685mg/l-有机氮1230mg/l115mg/l90.7％tn1230mg/l800mg/l35.0％结果显示，相较于低盐度(0.05％)而言，菌株baa19在高盐度(2％)下对高浓度(10000mg/l)苯胺的降解效果有所下降，但仍能实现苯胺的高效降解，5天内对cod的去除率可达73.2％，有机氮去除率可达90.7％，总氮去除率可达35.0％。
54.实施例4：陶厄氏菌baa19降解苯胺衍生物的能力(1)废水来源：浙江某苯胺废水，其中所含苯胺类物质为邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺，废水水质见表8。
55.表8codnh
3-ntpno
2-‑
nno
3-‑
n有机氮tnphtds30000mg/l672mg/l3mg/l0mg/l0mg/l1702mg/l1967mg/l102.3％(2)废水营养调配：向废水原水中补充kh2po
4 0.5g/l、微量元素液(配方同实施例1)1ml/l，调节ph至7.0，完成废水营养调配，获得调配废水。
56.(3)种子液的制备：同实施例2。
57.(4)废水处理试验：
为模拟工程情况，优化静态试验处理效果、探究最优微生物菌群处理能力，采用连续进出水动态实验。试验过程同实施例3，进水为调配废水。每天对出水进行基本水质检测，待出水水质达到稳定，计算稳定后2周的出水中cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量的平均值，结果见表9。
58.表9 进水出水去除率cod30000mg/l3800mg/l87.33％nh
3-n672mg/l930mg/l-有机氮1295mg/l370mg/l71.43％tn1967mg/l1300mg/l33.91％结果显示，菌株baa19对苯胺类废水具有较好的处理效果，能够有效降解邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺(这类苯胺衍生物相较于苯胺而言更难降解)。
59.实施例5：复合菌群的构建和对苯胺废水的处理能力(1)废水来源：浙江某苯胺废水，其中所含苯胺类物质为苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺，废水水质见表10。
60.表10codnh
3-ntpno
2-‑
nno
3-‑
n有机氮tnphtds47230mg/l836mg/l18mg/l0mg/l0mg/l1927mg/l2604mg/l9.810.3％(2)废水调配：向废水原水中补充kh2po
4 0.5g/l、微量元素液(配方同实施例1)1ml/l，调节ph至7.0，完成废水营养调配，获得调配废水。
61.(3)种子液的制备：将陶厄氏菌baa19、极端嗜高温菌gw-2和短小芽孢杆菌ad 0599分别在lb固体培养基(同实施例1)上30℃培养3d，挑取单菌落。将三个菌株的单菌落分别接种至lb液体培养基(同实施例1)中，150r/min、30℃下培养至对数期，获得各菌株的种子液。
62.(4)菌株之间的协同作用：将陶厄氏菌baa19的种子液按照1:1的体积比分别与极端嗜高温菌gw-2a、短小芽孢杆菌ad 0599混合，获得两种混合菌液。取两种混合菌液和三种菌株的单菌液，按照一定的接种量分别接种到调配废水中，使菌体初始终浓度均为od
600
＝0.5，30℃培养5天后，对废水中的cod和有机氮含量进行检测，计算cod和有机氮去除率，结果见表11。
63.表11
结果显示，陶厄氏菌baa19分别与极端嗜高温菌gw-2a和短小芽孢杆菌ad 0599两两组合后，cod和有机氮去除率均高于相应的单菌，说明陶厄氏菌baa19与极端嗜高温菌gw-2a和短小芽孢杆菌ad 0599之间具有协同作用。
64.(5)复合菌群的组成比例优化：将三个菌株的种子液按照表12中的不同体积比混合后，按照一定的接种量接种到调配废水中，使菌体初始终浓度均为od
600
＝0.5，30℃培养5天后，对废水中的cod和有机氮含量进行检测，计算cod和有机氮去除率，结果见表12。
65.表12结果显示，当三株菌的种子液体积比在1:0.2～1.5:0.2～2.0范围内时，cod和有机氮去除率高于单菌，表明三株菌能发挥较好的协同作用，提高对苯胺类废水的处理效果，其中，当三株菌的种子液体积比在1:0.5:0.5(活菌数之比为1:0.5:0.7)范围内时，cod和有机氮去除率最高。
66.实施例6：复合菌群在高盐度和低盐度下对高浓度苯胺的降解能力(1)复合菌群种子液的制备：按照实施例5中的方法，分别制备陶厄氏菌baa19、极端嗜高温菌gw-2a和短小芽孢杆菌ad 0599的种子液。将三株菌的种子液按照1:0.5:0.5的体积比混合，获得复合菌群种子液。
67.(2)模拟废水的配制：同实施例3。
68.(3)低盐度苯胺废水模拟试验：试验过程同实施例3。每天对出水进行基本水质检测，待出水水质达到稳定，计算稳定后2周的出水中cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量的平均值，结果见表13。
69.表13 进水出水去除率cod24230mg/l2824mg/l88.3％
nh
3-n0mg/l509mg/l-有机氮1230mg/l20mg/l98.4％tn1230mg/l529mg/l57.0％结果显示，复合菌群对高浓度(10000mg/l)苯胺具有较好的耐受性和降解效果。
70.(4)高盐度苯胺废水模拟试验：试验过程同实施例3。每天对出水进行基本水质检测，待出水水质达到稳定，计算稳定后2周的出水中cod、nh
3-n、有机氮和总氮(tn)含量的平均值，结果见表14。
71.表14 进水出水去除率cod24230mg/l4970mg/l79.5％nh
3-n0mg/l535mg/l-有机氮1230mg/l86mg/l93.0％tn1230mg/l621mg/l49.5％结果显示，相较于低盐度(0.05％)而言，复合菌群在高盐度(2％)下对高浓度(10000mg/l)苯胺的降解效果有所下降，但仍能实现苯胺的高效降解，且相较于陶厄氏菌baa19单菌而言降解效果有明显提升。
72.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
73.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。