A+多肽/蛋白质及其应用

本发明属于生物医药和护肤品，具体涉及一系列氨基酸序列，包含所述氨基酸序列的多肽，蛋白和组合物，编码所述氨基酸序列、多肽、蛋白和组合物的核酸序列，以及包含所述氨基酸序列，多肽，蛋白，组合物或核酸序列的产品在皮肤病预防和治疗领域的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、皮肤是人体最外在的器官，可反映机体的健康和衰老状况。皮肤衰老的发生被认为是内在和外在因素共同作用的结果。皮肤衰老往往表现为表皮变薄，真皮皱缩，厚度减少，胶原纤维变细甚至排列紊乱、断裂。在衰老过程中，细胞增殖能力下降是衰老的重要特征，衰老的细胞由于蛋白质合成能力下降、免疫系统相关基因表达失调等，往往表现为增殖能力下降的趋势。

2、皮脂膜为覆盖于皮肤表面的一层透明薄膜，主要由皮脂腺分泌的皮脂、角质层细胞崩解产生的脂质与汗腺分泌的汗液乳化形成，呈弱酸性，其主要成分角鲨烯、亚油酸、亚麻酸及脂质成分，具有锁住水分及一定的抗炎作用。皮肤屏障由皮脂膜、角质层角蛋白、脂质、"三明治"结构、砖墙结构、真皮粘多糖类、粘多糖类等共同构成，抵御外界有害、刺激物、日光进入，同时具有保湿及调节抗炎作用。皮肤屏障受损将引起皮肤干燥，皮肤老化、色素沉着、皮炎等。组织修复包括伤口愈合、皮肤屏障功能的修复等。皮肤屏障功能的恢复也有利于防治皮肤局部细菌感染，辅助治疗急慢性皮肤炎症，防止皮肤炎症的反复发作，包括脂溢性皮炎、糖激素依赖性皮炎、湿疹、特异性皮炎和银屑病等。

3、斑秃(alopecia areata，aa)是一种非瘢痕性脱发，我国流行病学调查显示男性雄激素性脱发患病率为21.3％，女性为6.0％。斑秃通常情况下表现为突发的脱发斑，严重时可累及整个头皮，此时称为全秃(alopecia totalis，at)，当累及包括腋毛、阴毛在内的全身所有毛发时，称为普秃(alopecia universalis，au)，容易给患者的容貌和心理带来严重的影响。自身免疫功能异常或不稳定、神经精神因素被认为是重要相关因素。斑秃越早介入治疗，治愈几率越高。米诺地尔可促进皮肤血管扩张、改善局部血液循环、促进毛发生长，是一种治疗斑秃常见的外用药物。严重斑秃常用糖皮质激素，主要包括泼尼松龙、复方倍他米松等等，可以口服、外用或皮内注射。对于不适用糖皮质激素类药物的患者，可采用免疫抑制剂治疗，常见的药物有环孢素、甲氨蝶呤。糖皮质激素和免疫抑制剂副作用多。

4、雄性激素源性脱发(androgenetic alopecia，aga)，又名雄激素性脱发，脂溢性脱发(seborrheic alopecia，sa)，男性脱发或遗传性脱发，是一种雄激素依赖性的遗传性毛发脱落，男性脱发多呈马蹄形外观。脱发处皮肤光亮，毛孔缩小或残留少许细软毳毛。脱发的速度、范围和严重程度，受遗传和个体影响。女性多为发生于头顶的弥漫性脱发。雄激素性脱发的病因及发病机制尚不明确，一般认为雄激素及其受体在本病的发生中起关键作用。正常生理状态下，雄激素在体内对毛发的生长发育起一定的刺激促进作用，但在某些特定部位能诱导毛发脱失；睾酮是体内主要的雄激素，它经5α-还原酶转化为二氢睾酮，后者可引起终毛向毳毛转变，最终导致脱发。雄激素源性秃发是脱发性疾病难治的类型，该病的动物模型通常作为脱发性疾病的代表模型。米诺地尔是一种非特异性治疗脱发的药物，是fda批准用于治疗脱发的一线外用药物，但使用过程中可能引起面部和四肢多毛症，停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺是一种ⅱ型5α-还原酶选择性抑制剂，fda批准口服非那雄胺用于治疗雄激素性脱发，可持续改善头发的生长情况，但非那雄胺存在引起性功能异常，精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应，在动物实验中发现有致畸作用，故不宜用于小儿和育龄妇女。西咪替丁需连服5个月或更久，副作用为男性乳房发育、阳痿、性欲降低等。口服避孕药：主要有的索高诺酮、左炔诺孕酮(左旋甲基炔诺孕酮)、炔诺孕酮、炔诺酮、诺孕酯(肟炔诺酯)、双酯炔诺醇和醋炔诺酮等，常用来治疗女性aga，治疗6～12个月后头发会有所改善。

5、抗肿瘤药物引起的脱发是最常见的生长期秃发，抗肿瘤药物在消除迅速分裂的癌细胞的同时，也攻击毛囊四周迅速分裂的细胞引起脱发。以上脱发治疗较困难，容易反复。因此，需要寻找更多安全、有效的治疗脱发的产品。

6、痤疮(acne)俗称青春豆，是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，发病率约9.4％，于青春期多见。临床表现主要有粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等，愈合时间长，给患者的容貌和心理带来严重的影响。痤疮与多个发病机制相关，毛囊口角化异常是本病发病的重要基础，炎症和感染是痤疮的发病因素。痤疮患者的皮脂腺较大，皮脂腺分泌增加，皮脂中亚油酸水平相对减少，影响脂肪的合成，导致滤泡上皮缺乏脂肪酸，从而诱导滤泡过度角化，使上皮细胞不能正常脱落，毛囊皮脂腺口过度变小，皮脂不能顺畅排出，形成粉刺，继发感染形成丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等。

7、目前人们已经发现和分离出一百多种存在于人体的肽和蛋白，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用，被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。但是对上诉问题效果好、安全的产品很少，已有的产品远不能满足临床需求，因此需要寻找更多疗效好、副作用少、价格便宜的新产品来控制疾病进展，减少复发和并发症。

8、人体内含有多种胶原蛋白，占人体蛋白质总量的1/3，负责人体机能的正常运转。皮肤是人体最大的器官，其中真皮层里80％都是胶原蛋白，主要是i型和ⅲ型胶原蛋白。随着年龄增加胶原总量呈下降趋势，现代医学证明，衰老本质是柔软富有弹性的ⅲ型胶原蛋白持续加速流失，且成年后无法自体再生。因此皮肤弹性下降、松弛、修复效果降低、是人皮肤衰老的原因之一。三型胶原蛋白具有促进细胞增生、增加细胞活性、帮助机体修复老化受损皮肤，起到抗衰老、修复创口的作用。ⅲ型重组人源胶原蛋白为非动物源、有三级结构、是具高活性的胶原蛋白，具备全人源、水溶性强、高生物活性、透皮吸收率高等特点，通过利用其网状高聚结构和亲水特性，可有效补充真皮层缺损的胶原蛋白，填补修复皮肤屏障，修复肌肤内受损的弹性纤维，促进组织细胞再生，同时屏蔽外来有害物质的作用，实现深度肌肤屏障修复。

技术实现思路

1、针对所述问题，本发明披露了具有多种功效的氨基酸序列，利用dna重组技术结合生物合成技术生产的多肽或重组胶原蛋白，很好保证了多肽/蛋白的生物活性，同时增强了多方面的功效。不仅保障医学应用安全，而且在生物相容性、生物吸收性、细胞黏附性上具有更稳定的表现。

2、为实现所述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种氨基酸序列，所述氨基酸序列为含有第一序列的氨基酸序列、片段或或其突变体。

4、进一步地，所述第一序列包括seq id no.1或与seq id no.1至少70％同源的且功能相同或相似的延伸序列。

5、进一步地，所述seq id no.1为aveypykhsgyyhr。

6、进一步地，所述同源是指在原序列基础上增加、减少或改变至少一个氨基酸。

7、进一步地，所述延伸序列包括seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq idno.5、seq id no.6、seq id no.7、seq idno.8、seq id no.9、seq id no.10或者与前述任意一个延伸序列至少70％同源的且功能相同或相似的序列、片段或突变体，

8、seq id no.2：avefpfkwsgyyhr；

9、seq id no.3：eypykhsgyyhra；

10、seq id no.4：aveytyngagyyhr；

11、seq id no.5：eytykgsgyyhrav；

12、seq id no.6：aveytyigagyyhr；

13、seq id no.7：aveypwkgsgyyhrp；

14、seq id no.8：aveytfkhsgyyhrp；

15、seq id no.9：aveypydysgyyhrp；

16、seq id no.10：aveytyegagyyhrp。

17、进一步地，所述突变体具有与所述氨基酸序列(例如，seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seqid no.9或seq idno.10)或其片段具有至少70％同源，例如该突变体为与所述氨基酸序列至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或至少99％同源的氨基酸序列。

18、第二方面，本发明提出一种产品。

19、进一步地，所述产品包括所述任意一个氨基酸序列，例如，seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq idno.10。

20、进一步地，所述产品为多肽或蛋白质。

21、进一步地，所述多肽为a+多肽，所述蛋白为a+多肽重组人源ⅲ型胶原蛋白。

22、进一步地，在多肽包含氨基酸序列(例如seq id no.1、seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10)的情况中，其可包含超出参照序列的在其n和/或c端的额外氨基酸，例如多肽可以包含在其n端的额外氨基酸。同样地，在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列的片段、突变体或衍生物的情况中，其可包含在其n和/或c端的额外氨基酸。

23、进一步地，所述多肽可以包含依照参照序列的氨基酸序列的突变体或所述突变体的片段或由所述突变体或所述突变体的片段组成，而此类突变体可以是非天然存在的。

24、进一步地，所述多肽或蛋白质还包含免疫球蛋白。

25、第三方面，本发明提出一种核酸序列。

26、进一步地，所述核酸序列编码seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6、seq idno.7、seq id no.8、seq id no.9及seq id no.10中任意一项所述的氨基酸序列，或编码所述多肽或蛋白质。

27、第四方面，本发明提出一种组合物。

28、进一步地，所述组合物包括如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6、seq idno.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示的氨基酸序列，所述多肽，所述蛋白质，所述核酸序列，所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列的衍生物或其可药用盐。

29、进一步地，所述衍生物为对于多肽中的氢原子、羟基、羧基、亚氨基用能够取代的公知的取代基取代而成。作为可用盐，没有特别限定，可列举出例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性、中性或酸性氨基酸的盐等。

30、本发明所述的多肽或蛋白质制备方法可以采用现有技术常用的方法，如公知的化学合成法或生物合成法或遗传工程学的合成法等。优选地，本发明所述多肽或蛋白质的合成方法属于基于基因工程技术的生物合成法，包括在适于表达编码所述多肽的核酸的条件下的原核或真核的宿主细胞，由宿主细胞回收所述多肽或蛋白质，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。

31、进一步地，所述组合物以所述氨基酸序列seq id no.1、seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10，所述多肽，所述蛋白质，所述核酸序列，所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列突变体、所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列融合物、所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列衍生物或其可药用盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

32、进一步地，所述药学上可接受的载体选自水、生理盐水、生理上可匹配的缓冲液、生理上可匹配的溶液和生理上可匹配的悬浮液中的至少一种。

33、进一步地，所述多肽的“突变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸的取代。保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中公知的。

34、进一步地，所述的多肽或蛋白质或组合物可制备为溶液、酊剂、醑剂、搽剂、喷雾剂、乳剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、水剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂、注射剂或其他药用剂型。

35、进一步地，所述的多肽或蛋白质或组合物可单独使用，也可与一种或多种产品组合使用。

36、第五方面，本发明提出一种制备所述多肽或蛋白质的方法。

37、进一步地，所述方法包括：培养宿主细胞，后从所述宿主细胞回收所述多肽或蛋白质，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。

38、第六方面，本发明提出所述氨基酸序列，多肽，蛋白质，核酸序列及组合物在制备皮肤类产品中的应用。

39、进一步地，所述产品包括但不限于药品、医疗器械、保健品或护肤品。

40、进一步地，所述产品的用途包括但不限于抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘产品。

41、本发明所述的多肽或蛋白质或组合物可制备为药学上允许的任何剂型，例如为适于皮肤外用、口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内任意给药方式的制剂。

42、在一种优选的实施方式中，本发明所述多肽或蛋白质或组合物的剂型为溶液、酊剂、醑剂、搽剂、喷雾剂、乳剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、水剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂或注射剂。

43、第七方面，本发明提出一种用于治疗或预防皮肤病的方法。

44、进一步地，所述方法包括施用治疗有效量的包含所述氨基酸序列，多肽，蛋白或组合物的产品。

45、进一步地，所述皮肤病包括但不限于皮肤衰老、皮肤炎症、皮肤损伤、脱发、斑秃和痤疮。

46、进一步地，所述产品的施用对象是人。

47、本发明所指的a+多肽，是指包含但不限于如seq id no.1、seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4、seq id no.5、seq idno.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示的氨基酸序列，其片段或其突变体的多肽。

48、本发明所指的a+多肽重组人源ⅲ型胶原蛋白，是指包含但不限于如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seqid no.8、seq idno.9或seq id no.10所示的氨基酸序列，其片段或其突变体的重组人源ⅲ型胶原蛋白。

49、与现有技术相对比，本技术具有以下优点：

50、(1)本发明所述的氨基酸序列或其突变体，能显著修复皮肤屏障，在抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等方面效果显著，且安全、副作用小。

51、(2)包括该氨基酸序列的系列a+多肽生物活性高，同时具有较好的抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等多种功效，优于目前所知的绝大多数多肽/蛋白产品，安全、稳定、生物相容性好、生产成本不高，尤其适用于功效性护肤品原料领域，适合生产出多种功效性护肤品，可以长期使用。

52、(3)重组蛋白显著提高功效：a+多肽与人胶原蛋白合成体系相融，采用基因工程技术，通过生物法合成的a+重组ⅲ型胶原蛋白能够明显增强系列a+多肽的功效，包括但不限于抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等，a+重组人ⅲ型胶原蛋白增加了较好的抗炎和生发功能(迄今未见其他重组人胶原蛋白报道有此功效)，达到了1+1＞2的效果，而且安全性好。

53、(4)质量可控：重组人源ⅲ型胶原蛋白的纯化方法通过在温度为65～75℃条件下热处理，由具有表达出重组人源ⅲ型胶原蛋白能力的重组酵母菌发酵得到的发酵液,有效地防止了发酵液中的重组人源ⅲ型胶原蛋白降解成小分子肽,并降低发酵液中内毒素的产生,大大提高了重组人源ⅲ型胶原蛋白纯度。基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，批次之间重复性好，而从动物提取的胶原蛋白通常为不同种类胶原蛋白的混合产物，批次之间差异大，不利于质量控制；化学合成不能保证多肽/蛋白的生物活性。

54、(5)较低的排异反应：类人胶原蛋白以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。