一种高卢蜜环菌多糖的提取方法及应用

1.本技术涉及食用菌多糖提取技术领域，尤其涉及一种高卢蜜环菌多糖的制备方法及应用。


背景技术：

2.高卢蜜环菌(armillaria gallica)属伞菌目泡头菌科，在世界各地区分布广泛，是为数不多的由营养菌丝聚集形成菌索的几个菌物属之一。高卢蜜环菌的菌索顶端具有较强的分生能力，可使细胞保持不断的分裂，能在活树、朽木上浸染和吸收营养，并能分化出侧枝，以形成完整的菌索。近年来，高卢蜜环菌的药用价值受到了广泛关注，被认为具有利肺、清目、镇静、抗惊厥、益肠胃、扩张血管、降血压等功效。目前现食用菌多糖提取技术中对于香菇、猴头菇、黑木耳、灵芝、银耳、桑黄、桦褐孔菌、羊肚菌中的多糖提取，已有先例，但对高卢蜜环菌中多糖的提取并未见报导。
3.多糖是由许多单糖分子以苷键结合而成的大分子化合物，其中，食用菌多糖被称为
″
生物反应调节物
″
，简称
″
brm
″
，经研究表明，多糖具有生物反应调节物的特征，可做为免疫增强剂和免疫激活剂，这些活性多糖具有一个的结构，即主链由β-d(1-73)连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着同β-d(1-73)边接的葡萄糖基呈梳状结构。
4.它还具有抗细菌、抗病毒和抗凝聚的作用，提高肝功能和解毒力，提高动物耐缺氧能力和氧的利用率，降低血液的粘稠度，增加心肌收缩力，改善心律，降血糖、镇静、镇痛、平喘、止咳、化痰的功效。
5.食用菌多糖提取技术已有相关人员进行了一系列的研究，其提取方法目前常采用热水浸提法、酶解法、微波提取法等。热水浸提法是通过食用菌细胞与浸出液作用，使食用菌细胞基质、细胞壁充分吸水胀破，致使食用菌多糖游离浸出；酶解法是通过添加某种特质的酶，利用酶作用机理的不同，对食用菌不同位置的结构进行破坏，打破细胞壁、细胞膜、细胞内容物的结构，使食用菌细胞内的多糖及营养物质释放并溶解，从而提取出食用菌中的多糖成分；微波提取法是对于细胞进行破壁，进而使多糖等有效成分更加容易析出。但是上述方法均存在多糖提取量的不足，同时多糖的提取效率较低的问题。因此，食用菌多糖的提取方法的进一步的改进和优化是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本技术提供了一种高卢蜜环菌多糖的提取方法，以解决热水浸提法、酶解法、微波提取法的局限性，通过冻融法预处理结合超声微波萃取破壁对于食用菌多糖的提取方法进一步的改进和优化，从而提高食用菌多糖的提取率。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种高卢蜜环菌多糖的提取方法，包括以下步骤：
9.(1)选取高卢蜜环菌新鲜子实体，清洁后采用冻融法进行初步处理，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥36-48h，再进行粉碎，过筛，得到预处理粉末；
10.(2)将预处理粉末中加入去离子水，搅拌混合均匀，使用超声破壁处理60-90min，然后离心分离得到滤渣a和溶液a；
11.(3)在滤渣a中加入10-15倍质量的去离子水，超声破壁处理30-60min，离心分离得到溶液b；
12.(4)将溶液a和溶液b合并，然后进行浓缩处理，得到浓缩液；
13.(5)在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，静置取沉淀物，得到粗高卢蜜环菌多糖；
14.(6)在粗高卢蜜环菌多糖中加入2～3倍质量的去离子水搅拌均匀得到粗高卢蜜环菌多糖水溶液，再加入10～15倍质量的sevag试剂混合均匀后，震荡离心提取多糖水溶液，得到高卢蜜环菌多糖水溶液；
15.(7)将高卢蜜环菌多糖水溶液放置于透析袋中，透析3-4次，每次透析8～16小时，得到透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液；
16.(8)将透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液浓缩，经过真空冷冻干燥得到高卢蜜环菌多糖粉末。
17.进一步的，步骤1中所述冻融法具体为：在-20℃～-30℃条件下冷冻24～48小时，然后在20℃～30℃条件下解冻24～48小时，反复处理3～5次。
18.上述方案的有益效果为：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂，使得细胞壁初步破碎，利于细胞中的多糖成分析出，同时可以杀灭高卢蜜环菌中的病菌及虫卵等，在清洗阶段不添加化学杀菌成分，保障了产品的安全。
19.进一步的，步骤(1)中所述冷冻干燥的温度为-15～-30℃；所述过筛为过200～300目筛。
20.进一步的，步骤(2)中所述去离子水的加入量为步骤(1)中预处理粉末的质量的10～20倍。
21.进一步的，步骤(2)和步骤(3)中的超声破壁处理时控制水温在20℃～40℃，超声功率为200-800w，频率为20-30khz。
22.上述方案的有益效果为：超声破壁处理与冻融法相结合，采用纯物理破壁法，保障了高卢蜜环菌多糖的生物活性。
23.进一步的，步骤(4)中所述的浓缩处理为浓缩至原体积的10％～15％。
24.进一步的，步骤(5)中所述加入无水乙醇的量为浓缩液体积的3-4倍；所述静置沉淀的温度为0～4℃，时间为30～60min。
25.优选的，步骤(6)中所述震荡离心提取多糖水溶液需反复操作3～5次；所述sevag试剂为氯仿与正丁醇混合液，体积比为(4-5)∶1。
26.上述方案的有益效果为：利用高卢蜜环菌多糖溶于水不溶于有机溶剂的特性，进一步纯化多糖成分，提高多糖的纯度。
27.进一步的，步骤(8)中所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，真空度为10-30pa。
28.另一方面，本发明提供了上述高卢蜜环菌多糖在保健品、食品饮料等领域的应用。
29.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30.1、采用冻融法与超声破壁相结合，采用纯物理方法破坏细胞壁，不仅使得其中的有效成分能够更快更多的析出，还能够充分保障多糖成分的活性，从而避免热水浸提、酶解
等方法对于多糖成分的破坏。
31.2、方法步骤中的反复冻融能够有效灭杀子实体中的细菌，提升产品的质量标准，降低了产品的安全隐患，与当前食品安全发展趋势和消费者的要求相符合。
32.3、通过冻融与超声破壁，结合浓缩、醇提、透析等步骤的协同作用，提高了多糖的得率。
具体实施方式
33.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.一种高卢蜜环菌多糖的提取方法，包括以下步骤：
36.(1)选取高卢蜜环菌新鲜子实体，清洁后采用冻融法进行初步处理，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h，再进行粉碎，过筛，得到预处理粉末；
37.(2)将预处理粉末中加入去离子水，搅拌混合均匀，使用超声破壁处理90min，然后离心分离得到滤渣a和溶液a；
38.(3)在滤渣a中加入15倍质量的去离子水，超声破壁处理60min，离心分离得到溶液b；
39.(4)将溶液a和溶液b合并，然后进行浓缩处理，得到浓缩液；
40.(5)在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，静置取沉淀物，得到粗高卢蜜环菌多糖；
41.(6)在粗高卢蜜环菌多糖中加入3倍质量的去离子水搅拌均匀得到粗高卢蜜环菌多糖水溶液，再加入15倍质量的sevag试剂混合均匀后，震荡离心提取多糖水溶液，得到高卢蜜环菌多糖水溶液；
42.(7)将高卢蜜环菌多糖水溶液放置于透析袋中，透析4次，每次透析16小时，得到透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液；
43.(8)将透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液浓缩，经过真空冷冻干燥得到高卢蜜环菌多糖粉末。
44.步骤1中冻融法具体为：在-30℃条件下冷冻48小时，然后20℃～30℃条件下解冻48小时，反复处理5次。
45.步骤(1)中冷冻干燥的温度为-30℃；过筛为过300目筛。
46.步骤(2)中去离子水的加入量为步骤(1)中预处理粉末的质量的20倍。
47.步骤(2)和步骤(3)中的超声破壁处理时控制水温在40℃，超声功率为800w，频率为30khz。
48.步骤(4)中的浓缩处理为浓缩至原体积的15％。
49.步骤(5)中加入无水乙醇的量为浓缩液体积的4倍；静置沉淀的温度为4℃，时间为60min。
50.步骤(6)中震荡离心提取多糖水溶液需反复操作5次；sevag试剂为氯仿与正丁醇混合液，体积比为5∶1。
51.步骤(8)中真空冷冻干燥的温度为-60℃，真空度为30pa。
52.实施例2
53.一种高卢蜜环菌多糖的提取方法，包括以下步骤：
54.(1)选取高卢蜜环菌新鲜子实体，清洁后采用冻融法进行初步处理，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥42h，再进行粉碎，过筛，得到预处理粉末；
55.(2)将预处理粉末中加入去离子水，搅拌混合均匀，使用超声破壁处理75min，然后离心分离得到滤渣a和溶液a；
56.(3)在滤渣a中加入13倍质量的去离子水，超声破壁处理45min，离心分离得到溶液b；
57.(4)将溶液a和溶液b合并，然后进行浓缩处理，得到浓缩液；
58.(5)在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，静置取沉淀物，得到粗高卢蜜环菌多糖；
59.(6)在粗高卢蜜环菌多糖中加入2.5倍质量的去离子水搅拌均匀得到粗高卢蜜环菌多糖水溶液，再加入13倍质量的sevag试剂混合均匀后，震荡离心提取多糖水溶液，得到高卢蜜环菌多糖水溶液；
60.(7)将高卢蜜环菌多糖水溶液放置于透析袋中，透析3次，每次透析10小时，得到透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液；
61.(8)将透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液浓缩，经过真空冷冻干燥得到高卢蜜环菌多糖粉末。
62.步骤1中冻融法具体为：在-25℃条件下冷冻36小时，然后在25℃条件下解冻36小时，反复处理4次。
63.步骤(1)中冷冻干燥的温度为-25℃；过筛为过250目筛。
64.步骤(2)中去离子水的加入量为步骤(1)中预处理粉末的质量的15倍。
65.步骤(2)和步骤(3)中的超声破壁处理时控制水温在30℃，超声功率为500w，频率为25khz。
66.步骤(4)中浓缩处理为浓缩至原体积的12％。
67.步骤(5)中加入无水乙醇的量为浓缩液体积的3.5倍；静置沉淀的温度为2℃，时间为45min。
68.步骤(6)中震荡离心提取多糖水溶液需反复操作4次；sevag试剂为氯仿与正丁醇混合液，体积比为4.5∶1。
69.步骤(8)中真空冷冻干燥的温度为-50℃，真空度为20pa。
70.实施例3
71.一种高卢蜜环菌多糖的提取方法，包括以下步骤：
72.(1)选取高卢蜜环菌新鲜子实体，清洁后采用冻融法进行初步处理，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥36h，再进行粉碎，过筛，得到预处理粉末；
73.(2)将预处理粉末中加入去离子水，搅拌混合均匀，使用超声破壁处理60min，然后离心分离得到滤渣a和溶液a；
74.(3)在滤渣a中加入10倍质量的去离子水，超声破壁处理30min，离心分离得到溶液b；
75.(4)将溶液a和溶液b合并，然后进行浓缩处理，得到浓缩液；
76.(5)在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，静置取沉淀物，得到粗高卢蜜环菌多糖；
77.(6)在粗高卢蜜环菌多糖中加入2倍质量的去离子水搅拌均匀得到粗高卢蜜环菌多糖水溶液，再加入10倍质量的sevag试剂混合均匀后，震荡离心提取多糖水溶液，得到高卢蜜环菌多糖水溶液；
78.(7)将高卢蜜环菌多糖水溶液放置于透析袋中，透析3次，每次透析8小时，得到透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液；
79.(8)将透析后的高卢蜜环菌多糖水溶液浓缩，经过真空冷冻干燥得到高卢蜜环菌多糖粉末。
80.步骤1中冻融法具体为：在-20条件下冷冻24小时，然后在20℃条件下解冻24小时，反复处理3次。
81.步骤(1)中冷冻干燥的温度为-15℃；过筛为过200目筛。
82.步骤(2)中去离子水的加入量为步骤(1)中预处理粉末的质量的10倍。
83.步骤(2)和步骤(3)中的超声破壁处理时控制水温在20℃，超声功率为200w，频率为20khz。
84.步骤(4)中浓缩处理为浓缩至原体积的10％％。
85.步骤(5)中加入无水乙醇的量为浓缩液体积的3倍；静置沉淀的温度为0℃，时间为30min。
86.步骤(6)中震荡离心提取多糖水溶液需反复操作3次；sevag试剂为氯仿与正丁醇混合液，体积比为4∶1。
87.步骤(8)中真空冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为10pa。
88.对比例1
89.采用热水浸提法提取高卢蜜环菌多糖。
90.对比例2
91.采用酶解法提取高卢蜜环菌多糖。
92.对比例3
93.采用微波提取法提取高卢蜜环菌多糖。
94.数据表征
95.高卢蜜环菌多糖得率的测定
96.分别称量高卢蜜环菌100g，分别采用实施例1-3及对比例1-3的方法进行高卢蜜环菌多糖提取，称量最终制备得到的高卢蜜环菌多糖粉末重量计算得率，结果如下表所示：
[0097][0098][0099]
由上表可以看出实施例1-3的提取方法相对于对比例1-3的提取方法多糖得率提升明显。
[0100]
高卢蜜环菌多糖功能的测定
[0101]
选取实施例1-3及对比例1-3制备得到的高卢蜜环菌多糖进行对比实验。
[0102]
采用腹腔注射环磷酰胺的方法制造小鼠免疫功能低下模型，其中对于免疫功能低下的小鼠分为a\b\c三组，a组分为a1、a2、a3分别选用对比例1-3制备得到的高卢蜜环菌多糖，b组分为b1、b2、b3分别选用实施例1-3制备得到的高卢蜜环菌多糖，通过灌胃给予相同剂量的多糖，连续5天，c组作为空白对照组。
[0103]
由于免疫力低下的小鼠溶血素值下降，因此对于血清溶血素测定来判断高卢蜜环菌多糖是否具有免疫调节作用，血清溶血素测定采用免疫溶血法。
[0104][0105]
由上表中的溶血素相对值可以看出，a组与b组相对于c组的均有提升，可以得知，高卢蜜环菌多糖具有免疫调节作用。而b组值提升明显高于a组，可知，b组的多糖中有效活性成分高于a组。
[0106]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0107]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。