转基因免疫细胞及其构建方法和应用与流程

本发明涉及cart，尤其是涉及转基因免疫细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，简称cart技术，是通过体外改造病人的t细胞，使病人的t细胞具备识别肿瘤细胞的能力，体外扩大培养后回输到病人体内进行治疗的一种方法。目前，以cd19为靶点的cart在治疗b细胞血液肿瘤方面取得了巨大的成果，但根据临床研究结果来看，cd19 cart在治疗b细胞淋巴瘤方面的疗效远远不及在治疗b细胞急性淋巴细胞白血病方面的疗效，这可能是因为b细胞淋巴瘤是实体肿瘤，cart细胞难以大量到达并浸润到肿瘤内部。对于浸润到肿瘤内部的cart细胞，实体瘤细胞能够通过表面过表达大量的pd-l1分子，从而逃避cart细胞的杀伤，同时，cart细胞与实体瘤细胞的不充分接触还显著影响了cart细胞的增殖和持久性，加快了cart细胞在体内的耗竭速度。

2、因此，与血液瘤的治疗相比，使用实体瘤的治疗对cart细胞提出了更高的要求，需要cart细胞具有抵抗，甚至破坏实体瘤微环境的能力，持续深入实体瘤内部发挥治疗作用。

3、细胞因子是由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。白细胞介素是其中重要分类之一，具有免疫调节、造血以及炎症调控等多种作用，目前已报道的白细胞介素已多达三十余种，其中il-21由cd4 t细胞和nkt细胞产生，刺激cd8 t细胞和nk细胞的成熟并增强其细胞毒性，同时具备促进记忆性cd8t细胞的分化等功能。il-21的诸多效能使其成为免疫治疗的潜在靶点，但由于il-21r广泛表达包括t细胞、b细胞、nk细胞和骨髓细胞。

4、趋化因子(chemokines)，是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白。由于它们具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，因而命名为趋化细胞因子。趋化性细胞因子根据其氨基端(n端)半胱氨酸的排列方式，可分为cxc、cc、c和cx3c四个亚族，其中cc趋化因子亚族的ccl19和ccl21是ccr7的配体，t细胞表达ccr7蛋白，所以ccl19和ccl21趋化因子能够趋化t细胞迁移。

5、上述细胞因子和趋化因子均有利于对抗和改善实体瘤微环境，为免疫细胞提供持久的杀伤环境。

技术实现思路

1、如何对在现有免疫细胞的基础上，整合多种功能分子共同对抗实体瘤微环境，显著有效地改善免疫细胞的治疗效果是目前亟需解决的问题。

2、本发明的目的在于，针对实体瘤微环境提供一种多功能免疫细胞，期望不仅能够对抗实体瘤在发展过程中逐渐形成的、对其稳定和扩散有利的微环境，同时还能够趋化自身免疫细胞，更大限度激活机体自身免疫系统，提高机体自身与实体瘤的对抗强度。

3、为了解决上述问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供了含有三个编码区的基因，其中，编码区(ⅰ)编码嵌合抗原受体，嵌合抗原受体含有特异性识别肿瘤抗原的胞外区；

5、编码区(ⅱ)编码融合蛋白，融合蛋白包括免疫检查点抗体和细胞因子；

6、编码区(ⅲ)编码趋化因子。

7、可选实施方式中，肿瘤抗原选自msln、gd2、gpc3、cd19、egfr viii、gucy2c、her2、muc16或claudin 18.2中的至少一种。

8、可选实施方式中，胞外区含有抗msln抗体。

9、可选实施方式中，胞外区含抗gucy2c抗体；可选实施方式中，嵌合抗原受体包含抗gucy2c单链抗体；

10、优选地，抗msln抗体的氨基酸序列为(a)如seq id no:1所示的氨基酸序列，或者(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且编码的蛋白质具有特异性识别msln抗原活性的衍生氨基酸序列。

11、可选实施方式中，免疫检查点选自pd1、pd-l1、tigit、lag3、ctla4、btla或tim3中至少一种。

12、可选实施方式中，免疫检查点抗体为抗pd1抗体。

13、优选地，抗pd1抗体的氨基酸序列为(c)如seq id no:2所示的氨基酸序列，或者(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且编辑的蛋白质具有靶向pd1功能的衍生氨基酸序列。

14、可选实施方式中，细胞因子为(a)或(b)；

15、(a)选自il-21、il-23、il-2、il-7、il-9、il-12、il-15或il-18中至少一种；

16、(b)为具有调节免疫细胞活性的由(a)衍生的蛋白质。

17、可选实施方式中，细胞因子为il-21。

18、优选地，il-21具有如seq id no:3所示的氨基酸序列。

19、可选实施方式中，趋化因子为(c)或(d)；

20、(c)选自cxc趋化因子、cc趋化因子、cx3c趋化因子或xc趋化因子中的至少一种；

21、(d)为具有诱导免疫细胞定向迁移功能的由(c)衍生的蛋白质。

22、优选地，cxc趋化因子为cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16或cxcl17中的至少一种。

23、优选地，cc趋化因子为ccl1、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9、ccl10、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27或ccl28中的至少一种。

24、优选地，cx3c趋化因子为cx3cl1。

25、优选地，xc趋化因子为xcl1。

26、可选实施方式中，趋化因子为ccl19或ccl21。

27、优选地，ccl19具有如seq id no:4所示的氨基酸序列；

28、优选地，ccl21具有如seq id no:5所示的氨基酸序列。

29、第二方面，本发明提供了重组核酸，重组核酸包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，第一核酸分子含有前述任一实施方式的编码区(ⅰ)，第二核酸分子含有前述任一实施方式的编码区(ⅱ)，第三核酸分子含有前述任一实施方式的编码区(ⅲ)。

30、可选实施方式中，第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子之间通过2a肽的核酸序列相连。

31、优选地，2a肽选自p2a、t2a、f2a或e2a中的至少一种。

32、可选实施方式中，第一核酸分子通过2a肽的核酸序列与第二核酸分子相连，第二核酸分子通过2a肽的核酸序列和第三核酸分子相连。

33、第三方面，本发明提供了生物材料，生物材料包括以下任一项：

34、(ⅰ)重组载体，重组载体含有前述任一实施方式基因，或者含有前述任一实施方式的重组核酸；

35、(ⅱ)构建体，构建体包括非致病性病毒，非致病性病毒含有前述任一实施方式的基因、重组核酸或(ⅰ)重组载体。

36、可选实施方式中，非致病性病毒包括反转录病毒、慢病毒或腺病毒。

37、第四方面，本发明提供了转基因免疫效应细胞，转基因免疫效应细胞含有前述任一实施方式基因、重组核酸或生物材料。

38、可选实施方式中，转基因免疫效应细胞的构建方法包括，将前述任一实施方式基因、重组核酸或生物材料导入免疫效应细胞中，获得转基因免疫效应细胞；

39、免疫效应细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞或cik细胞中的至少一种。

40、优选地，免疫效应细胞为t细胞。

41、第五方面，本发明提供了前述任一实施方式基因、重组核酸、生物材料、转基因免疫效应细胞或构建方法构建得到的转基因免疫效应细胞在制备抗肿瘤产品中的应用。

42、优选地，肿瘤包括实体瘤。

43、第六方面，本发明提供了抗肿瘤药物，药物包括前述任一实施方式基因、重组核酸、生物材料或转基因免疫效应细胞中的至少一种。

44、优选地，肿瘤包括实体瘤。

45、第七方面，本发明提供了治疗肿瘤的方法，方法包括向受试者施用治疗有效量的如前任一基因、重组核酸、生物材料或转基因免疫效应细胞中的至少一种。优选地，肿瘤包括实体瘤。

46、第八方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括如前任一基因、重组核酸、生物材料或转基因免疫效应细胞中的至少一种，以及药学上可接受的载体。

47、本发明提供的基因、重组核酸、生物材料和转基因免疫效应细胞均能够编码三种蛋白，三种蛋白的表达使得免疫效应细胞同时具有了多种功能，包括特异性识别肿瘤抗原和靶向免疫检查点，以及趋化并调节免疫细胞活性，从而在实现降低实体瘤微环境对免疫效应细胞抑制作用的同时，延长免疫效应细胞的杀伤作用时间；同时趋化因子的表达能够招募和趋化机体自身的t细胞到达肿瘤部位，在细胞因子的调节作用下共同杀伤肿瘤细胞，增强免疫效应细胞抗肿瘤疗效。