一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物及其制备方法与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物及其制备方法。


背景技术：

2.二裂酵母(双歧杆菌)是人体肠道菌群之一，肠道黏附性强，定植于肠道的能力强，并具有激活巨噬细胞、刺激免疫因子释放、维持肠道菌群平衡、抗肿瘤、促进微量元素吸收、控制内毒素的产生等重要的生理保健功能，因此二裂酵母的应用价值极高。二裂酵母发酵产物溶胞物是一种应用广泛的天然活性化妆品原料，该原料经菌种培养、灭活及分解得到代谢产物、细胞质片段、细胞壁组分及多糖复合体；该原料具有很强的抗免疫抑制活性并能促进dna修复，可有效保护皮肤，不受紫外线引起的损伤，用于乳化、水基及水醇体系的护肤、防晒及晒后护理产品，帮助预防表皮及真皮的光老化；另外可以加强角质层的代谢，还能捕获自由基，抑制脂质的过氧化，具有美白、抗皱的功能；其中富含的营养物质，有滋养皮肤的功能。
3.目前，现有二裂酵母生产菌种有限，发酵形式单一，抗自由基和抗皱的功效受限，无法和植物提取物的作用相连接，如中国专利文献cn 202110114687.1。此外，基于现有技术中生产工艺的限制，生产得到的微生物护肤原料，其自由基清除率较低，导致护肤功效受限。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物及其制备方法。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
6.第一方面，本发明提供了一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将发酵菌的种子液接种至发酵培养基中发酵培养；得发酵液；
8.所述发酵培养基包括黑莓和黑豆；
9.(2)将所得发酵液进行破碎处理，即得共生发酵二裂酵母溶胞物。
10.黑莓(blackberry)也称露莓，是蔷薇科悬钩子属植物，属于实心莓亚属。黑莓含有植物sod，花青素，原花青素，水杨酸，vc、ve、vb族等多种维生素，富含锌、硒等多种矿物质、人体必需的18种氨基酸等，且花色苷和总酚含量高。黑莓含有丰富的花色苷、黑莓多酚、维生素e，其中花色苷通过其酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应。
11.黑豆是指黑豆种子，富含钙、磷、铁、钾等矿物质及多种维生素，具有解表祛暑、清热利湿之功效。黑豆还包括γ-氨基丁酸(gaba)、黄酮、多酚等主要活性成分。黑豆中的异黄
酮具有独特的抗氧化、抗胆固醇、抗高血脂、预防骨质疏松，预防心血管疾病、抗菌消炎等作用。
12.本发明采用黑豆和黑莓作为发酵培养基组分，黑莓和黑豆协同发酵的抗氧化和紧致抗皱效果均优于单一植物发酵的效果，提升产品中的多酚和黄酮含量，以实现提升抗氧化和紧致抗皱的功效的目的。
13.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵菌种为双歧杆菌。
14.进一步的，所述双歧杆菌包括长双歧杆菌(如bifidobacterium longum hgcw-18，cctcc no:m 20221015)、短双歧杆菌(如lactobacillus brevis，cicc 20269)、动物双歧杆菌(如bifidobacterium animalis subsp，atcc 700541)、两歧双歧杆菌(如bifidobacterium bifidum，cgmcc 1.5029)中的至少一种。优选为长双歧杆菌(如bifidobacterium longum hgcw-18，cctcc no:m20221015)。
15.本发明采用了双歧杆菌(尤其是长双歧杆菌hgcw-18)作为发酵菌种，该菌种在细胞代谢产物、胞质片段、多糖、蛋白质与多肽等产物产量较高，具有调节平衡肌肤、调节免疫机能的功效，也同样是人类皮肤细胞的重要组成成分及营养分子；多糖、维生素等分子及双歧杆菌胞质代谢物具有一定的保释、抗氧化、紧致抗皱作用，并能够防止紫外线等外源刺激的损害，促进损伤dna的修复。与发酵培养基中黑莓和黑豆协同发酵的进一步提升抗氧化和紧致抗皱效果。
16.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述黑莓在所述发酵培养基中的质量百分比为0.1％～1％；优选为0.2％～0.5％；所述黑豆在所述发酵培养基中的质量百分比为0.1％～1％；优选为0.2％～0.5％；所述黑莓和黑豆的质量比为1:2～2:1。
17.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵培养基还包括氮源、碳源、无机盐和水。
18.进一步的，所述氮源包括大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、硫酸铵中的至少一种；所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、果葡糖浆、麦芽糖、乳糖、糊精中的至少一种；所述无机盐包括磷酸盐和/或硫酸盐；优选为na2hpo4、nah2po4、k2hpo4、kh2po4、mgso4、na2so4中的至少一种；更优选为k2hpo4。
19.进一步的，所述氮源在所述发酵培养基中的质量百分比为1％～3％；所述碳源在所述发酵培养基中的质量百分比为0.05％～0.5％；所述无机盐在所述发酵培养基中的质量百分比为0.05％～0.2％。
20.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述种子液的接种量为0.5％～3％。
21.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述种子液的制备方法包括以下步骤：
22.s1一级扩培：挑取发酵菌种菌落接种至mrs液体培养基中，30℃～40℃培养24h～72h，得到发酵菌种的一级种子液；
23.s2二级扩培：按0.5％～1.5％体积百分比的接种量将所发酵菌种的一级种子液转移至mrs液体培养基中，30℃～40℃培养20h～28h，得到发酵菌种的二级种子液，即成。
24.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述破碎处理采用高压均质机在60mpa～100mpa下处理。
25.作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述破碎处理后，还包括进行过滤处理或灭菌处理。
26.进一步的，所述过滤处理为将所述破碎处理后的产物讲过过滤膜或硅藻土过滤器处理；所述过滤膜为2.5μm～10μm的聚丙烯微滤膜；所述灭菌的压力为400mpa～800mpa，温度为20℃～60℃，时间为15min～30min。
27.第二方面，本发明提供了一种具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物，由上述的制备方法制得。
28.第三方面，本发明将所述的共生发酵二裂酵母溶胞物在化妆品中的应用。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.本发明采用了双歧杆菌(尤其是长双歧杆菌hgcw-18)作为发酵菌种，该菌种在细胞代谢产物、胞质片段、多糖、蛋白质与多肽等产物产量较高，具有调节平衡肌肤、调节免疫机能的功效，也同样是人类皮肤细胞的重要组成成分及营养分子；多糖、维生素等分子及双歧杆菌胞质代谢物具有一定的保释、抗氧化、紧致抗皱作用，并能够防止紫外线等外源刺激的损害，促进损伤dna的修复。与发酵培养基中黑莓和黑豆协同发酵，提升产品中的多酚和黄酮含量，进一步提升抗氧化和紧致抗皱效果。适用于化妆品领域。
附图说明
31.图1为分离得到长双歧杆菌hgcw-18的菌落形态图；
32.图2为显微镜下长双歧杆菌hgcw-18的革兰氏染色图；
33.图3为长双歧杆菌hgcw-18的16s rdna pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
34.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；实施例中所提及的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。
36.实施例1：长双歧杆菌hgcw-18的分离和鉴定
37.1、分离纯化和形态鉴定
38.采集奶酪制品做样品，用tpy固体培养基分离奶酪制品中的微生物。将分离的微生物于工作站中37℃培养48h，挑取平板上的优势菌落划线分离得到纯菌落，通过革兰氏染色进行形态学观察，并将纯菌落接种于tpy固体培养基中37℃厌氧培养48h，培养结束后置于4℃保藏。得到单个菌株hgcw-18。
39.菌株hgcw-18纯化后在tpy固体培养基中形成单菌落，其形态如图1所示，菌落形态几乎一致，大多数呈圆形，白色，表面粗糙较为干燥。在30℃～45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产h2s及明胶液化试验均为阴性，
40.通过革兰氏染色结果如图2所示，在显微镜下观察到紫色杆状细胞形态，判定为乳酸杆菌中的一种。
41.2、薄层层析法检测鉴定
42.乳酸杆菌属糖酵解过程产生以乳酸、乙酸为主的短链脂肪酸，利用此特性，通过采用薄层层析法检测不同糖源糖酵解过程中有机酸的产生来对菌株hgcw-18进行鉴定。
43.将上述步骤中分离的菌株hgcw-18在含不同糖源的培养基中37℃培养24h，于5000rpm离心20min，收集上清液，以溶于70％酒精中的甲基化和溴酚蓝混合溶液为指示剂，进行薄层层析法检测。
44.结果如表1所示。
45.表1菌株hgcw-18的薄层层析法检测结果
46.检测项目检测结果阿拉伯糖+核糖+乳糖+纤维二糖+松三糖+棉二糖+山梨醇+木糖+甘露糖－果糖+蔗糖+麦芽糖+海藻糖－蜜二糖+甘露醇+菊酚－水杨苷－
47.3、16s rdna鉴定
48.细菌的16s rdna序列在不同的物种间是高度保守的，不同物种间16srdna序列不同。因此，通过对16s rdna序列进行pcr扩增、测序，与genbank中的已知序列进行比对后，可判定细菌种类，将其划分到特定的属或种。16srdna(16s rrna为核糖体的rna的一个亚基，16s rdna是编码16s rrna的基因)鉴定是指用利用细菌16s rdna序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
49.采用细菌基因组dna提取试剂盒提取纯化菌株hgcw-18的dna，将提取的基因组dna作为16s rdna-pcr模板进行扩增。
50.引物信息如表2所示。
51.表2通用引物
[0052][0053]
扩增体系各组分如表3所示。
[0054]
表3pcr扩增体系
[0055]1×
tse101金牌mix45μlf(10p)2μlr(10p)2μldna模板1μl
[0056]
以上扩增体系按表4所示的扩增程序扩增。
[0057]
表4pcr扩增程序
[0058][0059]
将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300v电压下12分钟，获取鉴定胶图。电泳图如图3所示。
[0060]
将pcr产物进行一代测序(测序引物为27f/1492r)，将测序结果通过blast程序与genbank基因库进行同源性比对。16s rdna同源性分析结果显示，菌株与genbank数据库中已知长双歧杆菌的同源性达100％。
[0061]
结合形态学鉴定、薄层层析法检测鉴定和16s rdna同源性分析，将分离的乳酸杆菌鉴定为长双歧杆菌bifidobacterium longum，于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 20221015，其分类命名为长双歧杆菌hgcw-18，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
[0062]
实施例2：制备共生发酵二裂酵母溶胞物
[0063]
共生发酵二裂酵母溶胞物的制备方法具体包括以下步骤：
[0064]
(1)制备种子液
[0065]
挑取一环实施例1的长双歧乳杆菌hgcw-18接种于100ml mrs液体培养基中，于37℃条件培养48h，制备得到长双歧乳杆菌一级种子液；吸取10ml一级种子菌液转移至装有1000ml mrs液体培养基中，于37℃培养24h,得到长双歧乳杆菌二级种子液；
[0066]
(2)制备发酵培养基
[0067]
将0.3kg干燥黑莓用组织破碎机进行破碎，备用；
[0068]
将粉碎后的黑莓(质量分数为0.3％)、0.3kg黑豆(质量分数为0.3％)、0.25kg蔗糖(质量分数为0.25％)、2kg大豆蛋白胨(质量分数为2％)、0.1kg k2hpo4(质量分数为1％)和97.05kg水(余量水)，混合均匀，于115℃灭菌30min，制备得到发酵培养基。
[0069]
(3)接种发酵
[0070]
待发酵培养基冷却至37℃时，将1kg长双歧乳杆菌二级种子液接种至100kg的发酵培养基中(接种量为1％)，进行厌氧发酵，发酵温度37℃，自然ph，发酵48h，得到发酵液。
[0071]
(4)破碎处理
[0072]
发酵结束后，用高压均质机以80mpa的压力对发酵液中菌体进行破碎处理，得到裂解液。
[0073]
(5)过滤处理和灭菌处理
[0074]
用硅藻土过滤机将裂解液进行过滤，得到滤液。
[0075]
(6)灭菌处理
[0076]
用高压灭菌设备在600mpa在50℃下对步骤(5)的滤液进行灭菌，得到具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物。
[0077]
实施例3～7：制备共生发酵二裂酵母溶胞物
[0078]
与实施例2不同之处在于：发酵过程中选用的菌株、黑莓的加入量和黑豆的加入量不同，具体参数如表5所示。
[0079]
表5实施例3～7的不同参数
[0080][0081]
实施例8：制备共生发酵二裂酵母溶胞物
[0082]
共生发酵二裂酵母溶胞物的制备方法具体包括以下步骤：
[0083]
(1)制备种子液
[0084]
挑取一环实施例1的长双歧乳杆菌hgcw-18接种于100ml mrs液体培养基中，置于37℃条件培养48h，制备得到长双歧乳杆菌一级种子液；吸取20ml一级种子菌液转移至装有2000mlmrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到长双歧乳杆菌二级种子液；
[0085]
(2)制备发酵培养基
[0086]
将0.2kg干燥黑莓用组织破碎机进行破碎，备用；
[0087]
将粉碎后的黑莓(质量分数为0.2％)、0.2kg黑豆(质量分数为0.2％)、0.5kg葡萄糖(质量分数为0.5％)、1kg胰蛋白胨(质量分数为1％)、0.05kg mgso4(质量分数为0.05％)和98.05kg水(余量水)，混合均匀，121℃灭菌20min，制备得到发酵培养基。
[0088]
(3)接种发酵
[0089]
待发酵培养基冷却至37℃时，将2kg长双歧乳杆菌二级种子液接种至100kg的发酵培养基中(接种量为2％)，进行厌氧发酵，发酵温度36℃，自然ph，厌氧发酵50h，得到发酵液。
[0090]
(4)破碎处理
[0091]
发酵结束后，用高压均质机以60mpa的压力对发酵液中菌体进行破碎处理，得到裂解液。
[0092]
(5)过滤处理和灭菌处理
[0093]
将裂解液依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到滤液。
[0094]
(6)灭菌处理
[0095]
用高压灭菌设备在800mpa在40℃下对步骤(5)的滤液进行灭菌，得到具有紧致抗皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物。
[0096]
实施例9：制备共生发酵二裂酵母溶胞物
[0097]
共生发酵二裂酵母溶胞物的制备方法具体包括以下步骤：
[0098]
(1)制备种子液
[0099]
挑取两环实施例1的长双歧乳杆菌hgcw-18接种于200ml mrs液体培养基中，置于35℃条件培养48h，制备得到长双歧乳杆菌一级种子液；吸取20ml一级种子菌液转移至装有2000ml mrs液体培养基中，于35℃培养40h,得到长双歧乳杆菌二级种子液；
[0100]
(2)制备发酵培养基
[0101]
将0.5kg干燥黑莓用组织破碎机进行破碎，备用；
[0102]
将粉碎后的黑莓(质量分数为0.5％)、0.5kg黑豆(质量分数为0.5％)、0.3kg果葡糖浆(质量分数为0.3％)、3kg牛肉膏(质量分数为3％)、0.2kg nah2po4(质量分数为0.2％)和95.5kg水(余量水)，混合均匀，118℃灭菌25min，制备得到发酵培养基。
[0103]
(3)接种发酵
[0104]
待发酵培养基冷却至37℃时，将1.5kg长双歧乳杆菌二级种子液接种至100kg的发酵培养基中(接种量为1.5％)，进行厌氧发酵，发酵温度38℃，自然ph，厌氧发酵40h，得到发酵液。
[0105]
(4)破碎处理
[0106]
发酵结束后，用高压均质机以100mpa的压力对发酵液中菌体进行破碎处理，得到裂解液。
[0107]
(5)过滤处理和灭菌处理
[0108]
用硅藻土过滤机将裂解液进行过滤，得到滤液。
[0109]
(6)灭菌处理
[0110]
用高压灭菌设备在800mpa在25℃下对步骤(5)的滤液进行灭菌，得到具有紧致抗
皱、抗氧化和修护功效的共生发酵二裂酵母溶胞物。
[0111]
对比例1～6：共生发酵二裂酵母溶胞物
[0112]
与实施例2不同之处在于：发酵菌株、黑莓的加入量和黑豆的加入量不同，具体参数如表6所示。
[0113]
表6对比例1～6的不同参数
[0114][0115]
测试例1：抗氧化性能测试
[0116]
1、dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法
[0117]
(1)dpph浓度0.2mm(无水乙醇配制)：称取0.007875g dpph粉末溶于100ml无水乙醇中配置成0.2mm dpph。
[0118]
(2)样品的配制：
[0119]
将上述实施例2～9和对比例1～6的共生发酵二裂酵母溶胞物用去离子水依次稀释为1mg/ml(浓度为0.1％)、5mg/ml(浓度为0.5％)、10mg/ml(浓度为1％)，置于棕色瓶中备用。
[0120]
(3)按表7依次加样：
[0121]
表7样品加液要求
[0122][0123]
将各支试管反应溶液混匀后，避光常温反应30min，在517nm检测各组吸光度，记录数据。
[0124]
(4)数据分析
[0125]
清除率计算公式为：
[0126][0127]
式中：t为样品管吸光值，即样品与dpph反应后溶液吸光值；t0为样品本底ob值，即样品溶液吸光值；c为dpph管吸光值，即未加样品时dpph溶液吸光值；c0为空白管吸光值，即溶剂吸光值。
[0128]
实验结果如表8所示：
[0129]
表8共生发酵二裂酵母溶胞物对dpph的抑制率(％)
[0130][0131][0132]
测试结果表明，实施例2～9的共生发酵二裂酵母溶胞物具有很好的清除dpph的效果。其中，实施例2～9的清除dpph的效果优于对比例1和2，说明黑莓和黑豆协同发酵的抗氧
化效果优于单一植物发酵的抗氧化效果。将实施例2、6、7和对比例4相比，黑莓和黑豆的加入比例影响了共生发酵二裂酵母溶胞物清除dpph的效果，黑莓和黑豆的加入比例1～2：1～2为佳，更优选为1:1。将实施例2～5和对比例5、6相比可知，发酵选用的菌种影响最终产品清除dpph的效果，发酵菌种优选为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌，更优选为长双歧杆菌(cctcc no:m 20221015)。
[0133]
2、邻苯三酚法
[0134]
参考方法《程超,薛峰,李伟,汪兴平.3种处理方式对葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基能力的影响[j].食品科学,2014,35(13):26-31.》。
[0135]
(1)0.1mol/l tris-hcl溶液配制：精准称取tris颗粒2.4228g，加入100ml去离子水搅拌混匀溶解得0.2mol/l的tris溶液。取1.67ml浓盐酸加入98.33ml去离子水稀释得到0.2mol/l hcl溶液。取100ml tris溶液和44.76ml0.2mol/l hcl溶液混合，调整ph＝8.2，加入去离子水定容至200ml。
[0136]
(2)10mmol/l hcl溶液配制：取0.83ml浓盐酸，加入去离子水定容至100ml。
[0137]
(3)45mmol/l邻苯三酚溶液配制：精准称取0.2837g邻苯三酚粉末，加入50ml 10mmol/l hcl溶液溶解混匀。
[0138]
(4)分别将上述实施例2～9和对比例1～6的共生发酵二裂酵母溶胞物去离子水依次稀释为2％、1％、0.5％(质量百分比)。
[0139]
(5)按照表9依次加样：
[0140]
表9样品加液要求
[0141][0142][0143]
(6)先将各支试管反应溶液混匀后，避光25℃孵育20min，移入4cm比色皿中，再加入已25℃预热20min的邻苯三酚溶液启动反应。在420nm检测吸光度，每30s记一次吸光度，持续3min，计算出斜率，保存并记录。
[0144]
超氧阴离子自由基的清除率计算公式为：
[0145][0146]
式中，t为样品管吸光值，即样品与邻苯三酚反应后溶液斜率；t0为样品本底斜率；c为空白管吸光值，即未加样品时邻苯三酚溶液斜率；c0为溶剂本底斜率。
[0147]
实验结果如表10所示：
[0148]
表10共生发酵二裂酵母溶胞物对超氧自由基的抑制率(％)
[0149]
浓度0.5％1％2％实施例211.5432.1275.32实施例311.0228.6973.16实施例410.5327.8571.38实施例511.1228.5472.85实施例69.4727.3571.68实施例710.3730.0673.24实施例810.3229.5772.28实施例911.1429.4873.31对比例12.465.7715.30对比例25.528.8320.12对比例30.651.583.83对比例48.1622.4864.73对比例57.6918.4456.91对比例63.476.6211.38
[0150]
测试结果表明，实施例2～9的共生发酵二裂酵母溶胞物具有很好的清除超氧自由基的效果。其中，实施例2～9的清除超氧自由基的效果优于对比例1和2，说明黑莓和黑豆协同发酵的抗氧化效果优于单一植物发酵的抗氧化效果。将实施例2、6、7和对比例4的结果对比可知，黑莓和黑豆的加入比例影响了共生发酵二裂酵母溶胞物清除超氧自由基的效果，当黑莓和黑豆的加入比例1～2：1～2为佳，更优选为1:1。将实施例2～5和对比例5、6的结果对比可知，发酵选用的菌种影响最终产品清除超氧自由基的效果，发酵菌种优选为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌，更优选为长双歧杆菌(cctcc no:m 20221015)。
[0151]
测试例2：紧致抗皱性能测试
[0152]
1、collagen i的合成能力测试
[0153]
i型胶原蛋白(collagen i)是皮肤中含量最多的胶原蛋白，通过检测共生发酵二裂酵母溶胞物刺激collagen i的合成是紧致抗皱测试的重要指标。
[0154]
实验试剂：dmem(gibco)，胎牛血清(中乔新舟)，collagen i elisa试剂盒(武汉华美)，实施例2～9、对比例1～6制备的共生发酵二裂酵母溶胞物。
[0155]
实验步骤如下：
[0156]
(1)细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，每孔细胞数为5000个，培养24h；
[0157]
(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入0.1ml不同浓度的共生发酵二裂酵母溶胞物(共生发酵二裂酵母溶胞物的质量浓度依次为0.5％、1％、2％)，空白对照中加入等量的新培养液，培养箱孵育24h；
[0158]
(3)收集样品：离心取上清后新鲜使用或储存于-20℃备用；
[0159]
(4)elisa测试：在酶标仪450nm波长处测定吸收值，通过标准曲线法计算样品中collagen i的含量。
ph 8.0tris-hcl缓冲液配制成100u/ml弹性蛋白酶溶液，临用配制；
[0171]
底物溶液：称取1.8057mg n-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺，溶于10ml ph 8.0tris-hcl缓冲液；
[0172]
样品：实施例2～9和对比例1～6的共生发酵二裂酵母溶胞物，用去离子水依次稀释为2％、1％、0.5％(质量百分比)。
[0173]
(2)试剂添加如表12所示。
[0174]
表12反应液组成(μl)
[0175]
组别样品酶溶液底物缓冲液空白/5010050空白对照/50/150样品5050100/样品对照5050/100
[0176]
室温孵育60min，用酶标仪在410nm检测吸光度，记录并保存数据。
[0177]
(3)数据分析
[0178]
弹性蛋白酶抑制率(％)计算公式：
[0179]
弹性蛋白酶抑制率(％)＝[1-(od
a-odb)]/(od
c-odd)
×
100％；
[0180]
上式中：oda为样品组(含酶含底物)的吸光度值；odb为样品对照组(含酶不含底物)的吸光度值；odc为空白组(含酶含底物不含样品)的吸光度值；odd为空白对照组(含酶不含底物不含样品)的吸光度值。
[0181]
实验结果如表13所示：
[0182]
表13弹性蛋白酶抑制率(％)
[0183][0184]
测试结果表明，实施例2～9的共生发酵二裂酵母溶胞物可以抑制弹性蛋白酶的活性。其中，实施例2～9的抑制能力强于对比例1和2，说明黑莓和黑豆协同发酵的紧致抗皱功效优于单一植物发酵的紧致抗皱功效。将实施例2、6、7和对比例4的结果对比可知，黑莓和
黑豆的加入比例影响了共生发酵二裂酵母溶胞物的抑制弹性蛋白酶的活性，当黑莓和黑豆的加入比例1～2：1～2为佳，更优选为1:1。将实施例2～5和对比例4、5的结果对比可知，发酵选用的菌种影响最终产品的紧致抗皱功效，发酵菌种优选为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌，更优选为长双歧杆菌(cctcc no:m 20221015)。
[0185]
3、紧致抗皱人体功效测试
[0186]
实验方法：筛选出面部有皱纹的人群(30～45岁)140名作为紧致抗皱功效测试志愿者(每10个志愿者使用同一款样品)。志愿者半脸使用实施例2～9和对比例1～6的共生发酵二裂酵母溶胞物(配置成质量分数为5％的水溶液)，约2ml，每次，另一半脸不使用作为对照组，分别在使用第0周和第2周测其皮肤紧致程度r0、皮肤弹性r2的变化率，用于评价共生发酵二裂酵母溶胞物减少皮肤皱纹的效果。
[0187]
测试仪器：皮肤弹性测试仪mpa580(由德国ck公司生产)。
[0188]
皮肤紧致程度r0值越高，说明皮肤越紧致；皮肤弹性r2值越高，说明皮肤的弹性越好。
[0189]
皮肤紧致程度r0变化率＝(使用2周后皮肤紧致程度r0值-使用前皮肤紧致程度r0值)/使用前皮肤紧致程度r0值
×
100％。
[0190]
皮肤弹性r2变化率＝(使用2周后皮肤弹性r2值-使用前皮肤弹性r2值)/使用前皮肤弹性r2值
×
100％。
[0191]
测试结果如表14所示。
[0192]
表14紧致抗皱性能测试结果
[0193][0194][0195]
测试结果表明，实施例2～9的共生发酵二裂酵母溶胞物具有很好的紧致抗皱效果。其中，实施例2～9的紧致抗皱效果优于对比例1和2，说明黑莓和黑豆协同发酵的紧致抗皱效果优于单一植物发酵的紧致抗皱效果。将实施例2、6、7和对比例4的结果对比可知，黑
莓和黑豆的加入比例影响了共生发酵二裂酵母溶胞物的紧致抗皱效果，黑莓和黑豆的加入比例1～2：1～2为佳，更优选为1:1。将实施例2～5和对比例4、5的结果对比可知，发酵选用的菌种影响最终产品的紧致抗皱效果，发酵菌种优选为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌，更优选为长双歧杆菌(cctcc no:m 20221015)。
[0196]
测试例3：修护性能测试
[0197]
志愿者筛选：筛选出敏感皮肤人群(25～45岁)150名作为修护性能测试志愿者(每10个志愿者使用同一款样品)。
[0198]
测试步骤：在志愿者鼻唇沟部位进行试验，将10％乳酸溶液50ul滴在直径为0.8cm的单层滤纸上，分别在0.5min、2min询问受试者刺痛感，按4分法进行评分(0分为没有刺痛，1分为轻度刺痛，2分为中度刺痛，3分为重度刺痛)，若受试者在试验内任意时间达到3分即终止试验。
[0199]
样品使用：志愿者在全脸使用实施例2～9和对比例1～6的共生发酵二裂酵母溶胞物(配置成质量分数为5％的水溶液，空白对照组中志愿者以去离子水为样品)。志愿者按要求每天早晚2次进行产品涂抹，约1ml，连续试用2周，使用两周后重复上述测试步骤。
[0200]
记录志愿者使用前和使用2周后的乳酸刺痛评分，计算志愿者的乳酸刺痛改善率。其中，乳酸刺痛改善率(％)＝(使用前乳酸刺痛评分平均值-使用2周后乳酸刺痛评分平均值)/使用前乳酸刺痛评分平均值
×
100％；乳酸刺痛评分平均值＝0.5min的刺痛评分平均值+2min的刺痛评分平均值。
[0201]
乳酸刺痛改善率越高，则说明样品的修护效果越好。
[0202]
表15乳酸刺痛改善率
[0203][0204]
测试结果表明，实施例2～9的共生发酵二裂酵母溶胞物乳酸刺痛改善率高，具有很好的修护效果。其中，实施例2～9的修护效果优于对比例1和2，说明黑莓和黑豆协同发酵的修护效果优于单一植物发酵的修护效果。将实施例2、6、7和对比例4的结果对比可知，黑
莓和黑豆的加入比例影响了共生发酵二裂酵母溶胞物的修护效果，黑莓和黑豆的加入比例1～2：1～2为佳，更优选为1:1。将实施例2～5和对比例4、5的结果对比可知，发酵选用的菌种影响最终产品的修护效果，发酵菌种优选为长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌，更优选为长双歧杆菌(cctcc no:m 20221015)。
[0205]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。