一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的引物组、试剂盒及方法

1.本发明涉及农作物病害检测和鉴定技术领域，尤其涉及一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的引物组、试剂盒及方法。


背景技术：

2.甘蔗褐条病(sugarcane brown stripe disease)是蔗区常见的重要流行性真菌病害，在多雨高湿环境及感病品种大面积种植情况下易暴发流行。狗尾草平脐蠕孢菌(bipolaris setariae)是甘蔗褐条病病原菌，引起我国多个甘蔗主栽品种和新品种感病，该病原菌对蔗糖产业的健康发展造成了潜在的威胁。它通过影响甘蔗叶片光合作用，从而影响糖分积累，发病严重时全株叶片受感染，叶片光合作用严重下降，使得植株矮小，且严重感病发病率高达80％以上，一般使得甘蔗减产18％～35％，重的可达40％以上，蔗糖分降低15％～30％。目前，该病害在我国各蔗区普遍发生，给蔗糖产业带来不同程度经济损失，已发展成为严重影响我国甘蔗产业高质量发展的重要常见病害。
3.狗尾草平脐蠕孢菌引起的甘蔗褐条病病斑首先出现在幼叶上，最初症状为褪绿、椭圆形和水浸状小斑点，随着病害的发展，这些斑点沿主脉平行扩展为红色条纹，随后变长拉宽变为红褐色条纹，有些病变周围有黄色晕圈；成熟的条纹一般长5～25mm，也可长达50～75mm，宽2～4mm。发病严重时，病斑合并连接形成宽带长条状红褐色病斑，最后病叶提早干枯。甘蔗褐条病与甘蔗眼斑病(sugarcane eye spot disease)、甘蔗锈病(sugarcane rust)、甘蔗褐斑病(sugarcane brown spot)和甘蔗轮斑病(sugarcane ring spot disease)等病害发病初期症状相似，极易混淆。传统分离培养、形态学鉴定技术对人员的专业和经验要求较高，且分离培养过程易污染从而难以得到病原菌，且无法准确鉴定病原菌种类。甘蔗褐条病是暴发流行性真菌病害，早期精准监测是病害及早防控的重要基础。目前，尚无特异性检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的快速分子检测方法。因此，迫切需要在dna水平上对甘蔗褐条病进行快速准确的鉴定和检测，以建立高效、快速、准确、实用的病原菌检测技术，这对甘蔗褐条病的早期监测、诊断和及时防控，防止甘蔗褐条病的扩展蔓延具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决传统的形态学特征鉴定甘蔗褐条病菌周期长、经验性强、难以做到病害发生的实时监测等问题，提供了一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的引物组、试剂盒及方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供了一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.进一步地，所述引物组是根据狗尾草平脐蠕孢菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计的。
8.第二方面，本发明还提供了一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的试剂盒，包括第一方面所述的引物组和检测试剂。
9.进一步地，所述检测试剂包括2
×
easy taq pcr supermix和灭菌去离子水。
10.进一步地，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度分别为8μm～20μm。
11.进一步地，所述引物组中上游引物和下游引物的使用最优浓度为10μm。
12.第三方面，本发明还提供一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的方法，所述方法利用第二方面任一项所述的试剂盒进行检测，所述方法包括以下步骤：
13.s1、基因组dna的提取：提取待测样品的基因组dna；
14.s2、提供引物组：采用第一方面所述的引物组；
15.s3、pcr扩增：采用预设pcr反应体系和预设pcr扩增程序，以所述引物组对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
16.s4、结果判定：对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果中是否含有193bp的条带，判断待测样品中是否含有狗尾草平脐蠕孢菌；
17.若电泳结果中含有193bp的条带，则判定待测样品中含有狗尾草平脐蠕孢菌。
18.进一步地，所述检测方法能够检测的所述基因组dna的最小值浓度为20pg/μl。
19.本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：：
20.1.特异性强：本发明以甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌(bipolaris setariae)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)基因序列为靶标设计了引物组，对狗尾草平脐蠕孢菌具有很强的特异性，能够快速准确完成狗尾草平脐蠕孢菌的检测。检测准确度高，既确定了与狗尾草平脐蠕孢菌相邻物种[玉米生平脐蠕孢(bipolaris zeicola)、bipolaris secalis、双色平脐蠕孢(bipolaris bicolor)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilum rostratum)]等无交叉反应，也确定了与发病症状相似的其他甘蔗病原菌[甘蔗眼斑病菌(甘蔗平脐蠕孢菌，bipolaris sacchari)、甘蔗褐锈病菌(黑顶柄锈菌，puccinia melanocephala)、甘蔗褐斑病菌(尾孢霉菌，cercospora longipes)、甘蔗轮斑病菌(甘蔗小球腔菌，leptosphaeria sacchari)]以及常见甘蔗病原菌[甘蔗梢腐病菌(拟轮枝镰孢菌，fusarium verticillioides)、甘蔗梢腐病菌(层出镰孢菌，fusarium proliferatum)、甘蔗赤腐病菌(镰孢炭疽菌，colletotrichum falcatum)、甘蔗叶枯病菌(细极链格孢菌，alternaria tenuissima)]等均无交叉反应。
[0021]
2.灵敏度高：本发明设计的特异性引物组对狗尾草平脐蠕孢菌的检测灵敏度在dna水平上可达20pg/μl。
[0022]
3.简便快捷、适用性广、实用性好：本发明既可以对狗尾草平脐蠕孢菌株进行检测，也能对田间感染狗尾草平脐蠕孢菌的甘蔗进行检测。可实现在不用分离病原菌的前提下进行快速检测和鉴定，与传统的鉴定方法相比，极大缩短了检测时间，简便快捷，省时省工，可用于甘蔗褐条病的早期监测，为确定病害的最佳防治时期和防治策略提供更科学的依据，因此，本发明适用性广、实用性好。
sacchari)等菌株均由云南省农业科学院甘蔗研究所分离、保存。
[0032]
本发明实施例提供了一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的引物组，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体核苷酸序列如下：
[0033]
上游引物(seq id no.1)：5
’‑
tccctcaacccagaacctttcac-3’；
[0034]
下游引物(seq id no.2)：5
’‑
gatggtcttgccgttgacggtt-3’。
[0035]
在一些可选的实施方式中，所述引物组是根据狗尾草平脐蠕孢菌的gapdh基因，并通过引物设计软件设计获得的。
[0036]
基于一个总的发明构思，本发明实施例还提供了一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的试剂盒，包括所述引物组和检测试剂。
[0037]
在一些可选的实施方式中，所述检测试剂包括2
×
easy taq pcr supermix和灭菌去离子水。
[0038]
在一些可选的实施方式中，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度分别为8μm～20μm。
[0039]
在一些可选的实施方式中，所述上游引物和所述下游引物的使用最优浓度为10μm。
[0040]
如图1所示，基于一个总的发明构思，本发明实施例还提供一种用于检测甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌的方法，所述方法利用所述试剂盒进行检测，所述方法包括以下步骤：
[0041]
s1、基因组dna的提取：提取待测样品的基因组dna，于-20℃冰箱保存备用；
[0042]
s2、提供引物组：采用所述引物组；
[0043]
s3、pcr扩增：采用预设pcr反应体系和预设pcr扩增程序，以所述引物组对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0044]
s4、结果判定：对所述扩增产物利用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据电泳结果中是否含有193bp的条带，判断待测样品中是否含有狗尾草平脐蠕孢菌；
[0045]
若电泳结果中含有193bp的条带，则判定待测样品中含有狗尾草平脐蠕孢菌；
[0046]
若电泳结果中不含193bp的条带，则判定待测样品中不存在狗尾草平脐蠕孢菌。
[0047]
在一些可选的实施方式中，所述检测方法能够检测的所述基因组dna的最小浓度为20pg/μl。
[0048]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明保护范围的限定。
[0049]
实施例1
[0050]
本实施例提供了狗尾草平脐蠕孢检测引物有效性的验证方法，具体步骤如下：
[0051]
采用真菌基因组dna提取试剂盒按说明书提取狗尾草平脐蠕孢菌株bs1(来源于云南省农业科学院甘蔗研究所)的基因组dna为检测样本，采用植物基因组dna提取试剂盒按照说明书提取健康甘蔗叶片基因组dna为对照样本，后置于-20℃冰箱保存。
[0052]
用上述提取dna作为模板进行引物有效性验证，用健康甘蔗叶片基因组dna作为阴性对照，用无菌ddh2o作为空白对照。
[0053]
利用本发明引物组进行pcr扩增，其中，上游引物序列为5
’‑
tccctcaacccagaacctttcac-3’(seq id no.1)，下游引物序列为5
’‑
gatggtcttgccgttgacggtt-3’(seq id no.2)，所述引物组根据狗尾草平脐蠕孢的gapdh基因设计。
[0054]
pcr反应体系如下：包括2
×
easy taq pcr supermix 12.5μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，检测样本或对照样本的基因组dna 2μl，灭菌去离子水补足至总体积为25μl。
[0055]
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃最终延伸7min。
[0056]
扩增结果如图2所示，以狗尾草平脐蠕孢菌基因组dna为模板能扩增出193bp的目的条带，阴性对照和空白对照无条带。
[0057]
实施例2
[0058]
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
[0059]
本实施例提供了狗尾草平脐蠕孢菌检测引物灵敏度试验方法，具体步骤如下：
[0060]
狗尾草平脐蠕孢菌基因组dna提取后测定浓度，然后用无菌ddh2o将dna模板进行十倍梯度稀释，分别为20ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、2pg/μl、0.2pg/μl，以上述各浓度的dna为模板，进行pcr扩增，具体扩增体系和扩增程序同实施例1，用健康甘蔗叶片基因组dna作为阴性对照，用无菌ddh2o作为空白对照。
[0061]
结果如图3所示，该引物组具有良好的灵敏度，以20ng/μl、2ng/μl、200pg/μl和20pg/μl的狗尾草平脐蠕孢菌基因组dna为模板均能扩增出清晰的条带，条带大小为193bp左右，说明该引物组可以检出目标基因组dna的最低浓度为20pg/μl。
[0062]
实施例3
[0063]
将实施例3和实施例1进行对比，实施例3和实施例1的区别在于：
[0064]
本实施例提供了狗尾草平脐蠕孢菌特异性检测方法，具体步骤如下：
[0065]
以狗尾草平脐蠕孢菌相邻物种[玉米生平脐蠕孢(bipolaris zeicola)、bipolaris secalis、双色平脐蠕孢(bipolaris bicolor)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilum rostratum)]等，发病症状相似的其他甘蔗病原菌[甘蔗眼斑病菌(甘蔗平脐蠕孢菌，bipolaris sacchari)、甘蔗褐锈病菌(黑顶柄锈菌，puccinia melanocephala)、甘蔗褐斑病菌(尾孢霉菌，cercospora longipes)、甘蔗轮斑病菌(甘蔗小球腔菌，leptosphaeria sacchari)]等，以及常见甘蔗病原菌[甘蔗梢腐病菌(拟轮枝镰孢菌，fusarium verticillioides)、甘蔗梢腐病菌(层出镰孢菌，fusarium proliferatum)、甘蔗赤腐病菌(镰孢炭疽菌，colletotrichum falcatum)、甘蔗叶枯病菌(细极链格孢菌，alternaria tenuissima)]等基因组dna为模板；以狗尾草平脐蠕孢菌(bipolaris setariae)基因组dna为阳性对照；以健康甘蔗叶片基因组dna为阴性对照，以无菌ddh2o为空白对照。供试样品信息见表1。
[0066]
表1供试样品信息
[0067][0068]
[0069]
按照实施例1的pcr扩增的反应体系和反应程序进行，结果如图4所示，该引物组仅能扩增出狗尾草平脐蠕孢菌，且目的条带大小为193bp左右(详见图4中泳道13)，其他菌株均未扩增出目的条带，表明该引物组的特异性较好。
[0070]
实施例4
[0071]
将实施例4和实施例1进行对比，实施例4和实施例1的区别在于：
[0072]
本实施例提供了田间甘蔗褐条病样品中狗尾草平脐蠕孢菌的检测方法，具体步骤如下：
[0073]
以1份温室人工接种狗尾草平脐蠕孢菌感病甘蔗褐条病叶和9份田间自然感病甘蔗褐条病样基因组dna为模板；以确定感染狗尾草平脐蠕孢菌甘蔗叶片基因组dna为阳性对照；以健康甘蔗叶片基因组dna为阴性对照，以无菌ddh2o为空白对照。甘蔗供试样品信息见表2。
[0074]
表2供试样品信息
[0075][0076][0077]
按照实施例1的pcr的反应体系和反应程序进行，结果如图5所示，该引物能扩增出人工接种和田间自然感染狗尾草平脐蠕孢菌的甘蔗褐条病样品，目的条带大小为193bp左右(详见图5中泳道1-10)，表明该引物组可用于田间甘蔗褐条病样品检测。
[0078]
本技术实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
[0079]
例如：(1)本技术实施例提供的一种用于检测狗尾草平脐蠕孢菌的引物组，以甘蔗褐条病病原菌狗尾草平脐蠕孢菌(bipolaris setariae)的gapdh基因序列为靶标设计了一对特异性引物，对狗尾草平脐蠕孢菌进行特异性识别，特异性强，能够快速准确完成狗尾草平脐蠕孢菌的检测；同时，检测准确度高，既确定了与狗尾草平脐蠕孢菌相邻物种，如玉米生平脐蠕孢(bipolaris zeicola)、bipolaris secalis、双色平脐蠕孢(bipolaris bicolor)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilum rostratum)等无交叉反应，也确定了与发病症状相
似的其他甘蔗病原菌，如甘蔗眼斑病菌(甘蔗平脐蠕孢菌，bipolaris sacchari)、甘蔗褐锈病菌(黑顶柄锈菌，puccinia melanocephala)、甘蔗褐斑病菌(尾孢霉菌，cercospora longipes)、甘蔗轮斑病菌(甘蔗小球腔菌，leptosphaeria sacchari)，以及常见甘蔗病原菌，如甘蔗梢腐病菌(拟轮枝镰孢菌，fusarium verticillioides)、甘蔗梢腐病菌(层出镰孢菌，fusarium proliferatum)、甘蔗赤腐病菌(镰孢炭疽菌，colletotrichum falcatum)、甘蔗叶枯病菌(细极链格孢菌，alternaria tenuissima)等均无交叉反应。
[0080]
(2)本技术实施例提供的一种用于检测狗尾草平脐蠕孢菌的试剂盒，其对狗尾草平脐蠕孢菌的检测灵敏度高，检测下限为20pg/μl。
[0081]
(3)本技术实施例提供的一种用于检测狗尾草平脐蠕孢菌的方法，既可以对狗尾草平脐蠕孢菌株进行检测，也能对田间感染狗尾草平脐蠕孢菌的甘蔗进行检测，同时可实现在不用分离病原菌的前提下进行快速检测和鉴定，与传统的鉴定方法相比，极大缩短了检测时间，简便快捷，省时省工，还可用于甘蔗褐条病的早期监测，为确定病害的最佳防治时期和防治策略提供更科学的依据，因此，本发明适用性广、实用性好。
[0082]
以上所述仅是本技术的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本技术。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。