检测CECR1基因的多位点碱基突变的引物及其应用的制作方法

本发明属生命科学和生物，特别涉及检测cecr1基因位点突变的引物，采用pcr扩增结合sanger测序技术，可用于快速检测遗传性血管炎患者体内cecr1基因位点的突变情况。

背景技术：

1、血管炎是一种具有血管炎症和坏死的临床病理过程的疾病，组织病理上表现为血管内皮细胞肿胀，血管壁及血管周围炎性细胞浸润，或肉芽肿性增生血管炎。临床表现多样，只有少数病因较明确，如药物变态反应及感染所致。根据血管炎好发部位及严重程度进行分类，常见的有变应性白细胞破碎性(坏死性)血管炎、结节性多动脉炎、血栓形成性血管炎、肉芽肿性血管炎及淋巴细胞性血管炎等。各类血管炎继发性组织缺血可影响包括皮肤、肌肉骨骼系统、肾脏、胃肠道、心血管和神经系统在内的多器官病变。

2、血管炎性病变临床表现多样，病因复杂。新近研究发现，部分血管炎性病变可能与猫眼综合征染色体候选基因1(cat eye syndrome chromosome region，candidate 1，cecr1)突变导致cecr1基因编码的腺苷脱氨酶2(adenosine deaminase 2，ada2)功能缺陷相关。ada2功能缺陷症是2014年由zhou等首次提出的一种常染色体隐性遗传病，也是第一个被发现的血管炎相关的单基因遗传病。本病是由cecr1突变导致该基因编码的ada2功能缺陷，ada2为内皮细胞、白细胞发育及分化的生长因子，该酶的缺陷可能损伤内皮细胞完整性，使巨噬细胞和单核细胞亚群向促炎细胞分化，从而导致血管病变和炎症的恶性循环。ada2缺乏症导致该酶催化活性和生长因子活性受损。多项研究在结节性多动脉炎和不能明确诊断的血管炎性疾病患者中发现了相同的突变位点，并证实了存在ada2蛋白功能缺陷。作为腺嘌呤核苷代谢过程中的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ada)亚型之一的ada2不论在早期胚胎发育，还是在特异性免疫系统中都发挥了作用。推测ada2缺陷可能通过增加腺苷水平和破坏血管内皮的完整性从而导致血管炎症的发生，机制尚待进一步研究。

3、ada2是由cecr1基因编码的包含有511个氨基酸的蛋白质。编码ada2的cecr1基因位于22q11.2，共有10个外显子和9个内含子。目前已经发现的cecr1基因突变共有18种，其中p.g47r纯合突变大多是在是格鲁吉亚和土耳其人种中发现的，该突变在格鲁吉亚人中携带率为10％。r169q在北欧地区高加索人种中最常见，携带率约为2‰全外显子基因测序结果显示,所有ada2缺陷引起血管炎的家系患者均存在cecr1基因的隐性突变，该基因编码ada2。所有格鲁吉亚犹太人患者均是cecr1 c.139g→a(22号染色体：17，690，429c→t)导致gly47arg氨基酸替换的纯合突变，ada2的47位甘氨酸在测序的物种中是保守的，被替换为精氨酸后出现功能损害。而所有未患病的亲属均为杂合子或携带者。对确定的候选等位基因进行人群中靶基因测序验证，推测同族结婚的格鲁吉亚犹太人群中，gly47arg携带频率是0.102，这与结节性多动脉炎在该人群中高发率相一致。在德国家系中，受累患者是杂合突变，亦均发生在cecr1基因，为突变编码arg169gln(c.506g→a；22号染色体：17，687，997c→t)以及pro251leu(c.752c→t；22号染色体：17，684，454g→a)的复合杂合突变。在中国血管炎和cecr1的关联研究报导比较少，王新宁等通过全外显子测序发现两个g48r和g358r新突变和血管炎相关。

4、过去，免疫抑制治疗通常用作控制早发性结节性多动脉炎及卒中反复发作患者的严重全身炎症反应，其中糖皮质激素为主要治疗方法，可获得一定疗效。一项研究发现，所有患者对非甾体类抗炎药部分有效，大剂量糖皮质激素可达到缓解，但几乎所有慢性病程患者随着激素减量均会复发，严重并发症如脑卒中或肠套叠多于激素减量或停用时出现。其他免疫抑制治疗(硫唑嘌呤、环孢素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、霉酚酸酯)通常疗效甚微。研究发现10例患者应用tnf-α受体拮抗剂治疗，9例达到完全缓解，仅1例存在激素依赖。所以有学者建议一旦发现cecr1突变并诊断ada2缺陷应立即开始tnf-α受体拮抗剂治疗。而家系的cecr1基因突变检测可以早发现疾病从而有针对性的及早治疗。

5、综上所述，cecr1基因突变所致的ada2酶的功能缺失与血管病变及炎症表现相关，易引发网状青斑样皮疹和缺血性脑卒中，可导致儿童早发性卒中反复发作、系统性血管炎、免疫缺陷等一系列疾病。目前治疗方法主要是tnf-α受体拮抗剂。一旦确诊，应尽早并坚持持续应用tnf-α受体拮抗剂以减轻甚至避免神经系统损伤。尽早完善相关基因检查方法及ada2酶活性的测定方法，有助于早期诊断及治疗，改善预后。而我们目前开发的测序方法和试剂盒是基因突变检测的主要手段和金标准。通过对cecr1基因的全外显子检测可发现cecr1基因已知和未知的全部类型的异常，为血管炎患者的诊断提供可靠依据。从而找到患者cecr1基因突变与临床表型的关系，尽早治疗，延长生命周期。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测cecr1基因的多位点碱基突变的引物，采用pcr技术，可用于快速检测血管炎患者体内cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点的突变情况。所述检测cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点突变情况的引物，包括：

2、扩增cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点的引物，其碱基序列为：cecr1-f：tgtaaaacgacggccagtgggtacaaggaagggtgtgc cecr1-r：aacagctatgaccatgggctctggaaacgcctgtag；

3、进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

4、m13 f：tgtaaaacgacggccagt

5、m13 r：aacagctatgaccatg

6、本发明还提供了检测cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点突变情况的方法，包括以下步骤：

7、1.抽提外周血中的基因组dna；

8、2.用pcr扩增步骤1中提取的dna；

9、3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

10、4.对测序结果进行判断，确定cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点是否发生突变；

11、其中扩增cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点的引物，其碱基序列为：

12、cecr1-f：tgtaaaacgacggccagtgggtacaaggaagggtgtgc

13、cecr1-r：aacagctatgaccatgggctctggaaacgcctgtag。

14、进一步地，测序引物碱基序列为：

15、m13 f：tgtaaaacgacggccagt

16、m13 r：aacagctatgaccatg。

17、本发明还提供了一种检测cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点突变的试剂盒，包括：

18、(i)血液dna抽提试剂；

19、(ii)检测体系pcr扩增反应液：包括扩增cecr1基因的c.1004a>g、c.1081+78g>a位点的引物，其碱基序列为：

20、cecr1-f：tgtaaaacgacggccagtgggtacaaggaagggtgtgc

21、cecr1-r：aacagctatgaccatgggctctggaaacgcctgtag；

22、(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：

23、m13 f：tgtaaaacgacggccagtm13 r：aacagctatgaccatg；

24、(iv)阳性对照品和阴性对照品。

25、有益效果：本发明只用1对引物，可同时检测cecr1基因c.1004a>g、c.1081+78g>a2个突变，高效简便。并且c.1004a>g、c.1081+78g>a是新突变(未见文献报道，属首次发现)，在本次检测中突变率为50％。本发明采用pcr技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度，荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计不同探针，按照现在2个突变，就需要设计4个探针，成本高，假阳性发生率高。。