一种玉米抗旱基因Zm00001d030678及其应用

一种玉米抗旱基因zm00001d030678及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种玉米抗旱基因zm00001d030678在提高植物的抗旱性方面的应用。


背景技术：

2.植物生活环境变幻莫测，经常遭遇各种不利的非生物胁迫，尤其是在人类不断地向大气中排放二氧化碳，产生温室效应，加剧了地球干旱等灾害。以及人口的增加和工业的迅速发展，导致水资源越来越缺乏。
3.玉米(zea mays l.) 是重要的粮食作物和工业原料作物，在世界粮食总产量中居首位，玉米叶片茂盛，蒸腾量大，对水的需求量大，而我国水资源相对贫乏，且在地理和时空上分布极不均匀， 使我国的玉米及其它农作物经常遭受干旱而造成减产。因此，对玉米及其它农作物抵抗水分胁迫的特性的研究越来越受到重视。在玉米及其它农作物中研究植物的抗旱机制，最终获得抵御环境胁迫能力的优良农艺性状作物品种，在生产上具有重要的应用价值。
4.目前，对zm00001d030678基因在干旱胁迫下的功能研究尚未见报道。而本发明了公开了zm00001d030678基因在提高植物的抗旱性方面的应用，并通过将具有所述的基因zm00001d030678玉米植株与具有其突变体zmmyb56玉米植株进行对照实验，证实了基因zm00001d030678具有抗旱的功能。本发明对zm00001d030678基因功能的深入研究和分析，对于探索玉米气孔关闭及干旱胁迫反应的分子机制，改良玉米水分利用效率、培育高产耐逆玉米新品种等，具有重要的理论意义和实际应用价值，为后续抗旱玉米新品系的培育和种质资源创新提供了新的技术。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性 ，通过提供一种新的可用于玉米抗旱遗传改良的基因，即具体为一种玉米抗旱基因zm00001d030678在提高植物的抗旱性方面的应用。
6.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种玉米抗旱基因zm00001d030678在提高玉米抗旱性能中的应用。
7.本发明进一步保护上述玉米抗旱基因zm00001d030678在玉米种质资源改良中的应用。
8.本发明进一步保护上述玉米抗旱基因zm00001d030678在制备抗旱转基因玉米中的应用。
9.本发明进一步保护一种提高植物抗旱性能的方法，将上述的玉米抗旱相关基因zm00001d030678整合到植物的细胞、组织和器官中，并使其过量表达。
10.作为本发明的进一步改进，所述植物包括玉米。
11.本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种玉米抗旱基因zm00001d030678在提
高玉米抗旱性能方面的应用。通过公开对zm00001d030678基因功能的深入研究和分析，对于揭示玉米气孔关闭调控及干旱胁迫反应机制，培育水分高效利用、抗逆高产玉米新品种和种质资源创新等提供基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。
附图说明
12.图1. zm00001d030678 (zmmyb56)基因点突变引起终止密码子的提前产生，zm00001d030678 (zmmyb56)基因结构及点突变位置显示及扩增产物测序鉴定纯合体。
13.图2. zmmyb56突变体气孔生理表型分析图2a.远红外热成像检测b73及zmmyb56突变体幼苗叶表面温度。比例尺 = 2 cm；图2b. b73及zmmyb56突变体幼苗叶表面温度统计分析；图2c. b73及zmmyb56突变体幼苗叶气孔导度检测；图2d. b73及zmmyb56突变体幼苗叶片离体水分散失比较。
14.图3. b73及zmmyb56突变体苗期干旱耐性比较图3a. 正常生长的b73及zmmyb56突变体。比例尺 = 2 cm；图3b. 干旱处理后的b73及zmmyb56突变体。比例尺 = 2 cm；图3c.干旱处理前后突变体及野生型组织水分含量比较；图3d.干旱处理前后突变体及野生型膜质氧化产物比较。
15.图4. zmmyb56的突变造成引起co2诱导气孔关闭的缺失图4a.不同浓度co2条件下b73及zmmyb56突变体气孔导度检测；图4b. 不同浓度co2条件下b73及zmmyb56突变体蒸腾速率检测。
16.图5. zm00001d030678启动子驱动的gus转基因玉米叶表皮的gus染色，比例尺= 100 μm。
具体实施方式
17.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
19.实施例1.zm00001d030678基因及其突变体zmmyb56的鉴定pcr扩增用高保真酶等购自诺唯赞，phanta max super-fidelity dna polymerase（货号：p505-d1），内含2
×
phanta max buffer、10 mm dntp mix、phanta max super-fidelity dna polymerase等。template dna提取自玉米b73幼苗叶片基因组dna。正反向引物primer f/r由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
20.把所获得的玉米zm00001d030678基因株系及对应的ems突变体型株系均播种于营养钵中，于光照培养箱与温室大棚中培养，培养条件为光照16 h，白天温度30
°
c，夜间温度20
°
c。玉米生长至三叶期，取叶片材料。sls法提取玉米dna：取2 cm
²
大小左右的玉米幼苗叶片，置于装有小钢珠的1.5 ml离心管中，在液氮速冻后立即放入高通量组织研磨仪中，8,000 rpm震荡研磨1 min；向每个研磨完成的离心管中加入500 μl的sls dna提取液，剧烈震荡1 min，使其充分混匀；然后加入500 μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液，剧烈震荡1 min，
使其充分混匀，于高速离心机4
°
c下12,000 rpm离心15 min；离心后吸取上清液400 μl转移至新离心管中并加入等体积的异丙醇，充分混匀后于-20
°
c静置30 min；于高速离心机4
°
c下12,000 rpm离心10 min后弃去上清，加入750 μl的75%乙醇漂洗，再于高速离心机4
°
c下12,000 rpm离心5 min后弃去上清，重复两次后晾干；加入200 μl无菌水溶解dna并测定浓度，于-20
°
c保存。
21.以上述提取的玉米基因组dna为模板，利用引物组合sgmyb56t01f + sgmyb56r扩增获得zm00001d030678基因的cds序列：sgmyb56t01f：5
’‑
gcgcgccatttaaatactagtatggtgacagtgagagaggagac-3’；sgmyb56r：5
’‑ꢀ
catggtggatcccatactagtgaagcagggcccaactccttcact
ꢀ‑3’
pcr反应体系：体系组分体积2
×
phantamaxbuffer25μlprimerf1μlprimerr1μl10mmdntpmix1μltemplatedna1μlphantamaxsuper-fidelitydnapolymerase1μlddh2oto50μlpcr反应程序步骤温度程序195
°
c5min295
°
c30s358
°
c30s472
°
c1kb/min5goto2for35cycles672
°
c10min716
°
cforeverpcr扩增获得cds片段，经测序测序鉴定为zm00001d030678的cds编码序列利用sls法提取zmmyb56突变体玉米基因组dna，以之为模板，利用特异引物（l70-7de-f2: acctgcaattctaagcgcgg，l70-7de-r2: gcacaggagaggaagagg aac）进行扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，确定突变体，即zmmyb56突变体，在玉米基因zm00001d030678核苷酸序列的第630处的核苷酸由g突变为a。（图1）。
22.实施例2.通过玉米气孔生物学生理指标检测，以揭示玉米zm00001d030678基因的功能远红外叶温检测：将玉米zm00001d030678基因株系b73与zmmyb56突变体共同在营养钵中进行种植，在既定条件下进行培养，生长至三叶期，利用远红外成像系统监控干旱处理过程中植物叶面温度差异状况（图2a）。随机选取同一叶片5个位置并记录其温度具体值，求取平均值及标准差（图2b）。
23.气孔导度测定：分别选取5株zm00001d030678基因株系b73及zmmyb56突变体，利用
气孔导度计对表现出叶温差异的zm00001d030678基因株系b73与zmmyb56突变体进行气孔导度检测，计算获得平均气孔导度计及标准差（图2c）。
24.离体叶片失水速率检测：取正常情况下生长15天的zm00001d030678基因株系b73植株与zmmyb56突变体幼苗各3株，将每一株完全去除土壤后分别置于一台失水实验平台的天平中，程序设置自启动时，每5 min记录一次当前重量，待程序结束时自动计算其失水率（图2d）。
25.实施例3.通过干旱处理后相关生理生化指标检测，以证明玉米zm00001d030678基因的功能干旱处理：将玉米zm00001d030678基因株系b73与zmmyb56突变体共同在营养钵中进行种植，在既定条件下培养12天（生长至三叶期），停止浇水进行干旱处理，观察干旱处理过程中的表型并进行照相（图3a-b）；组织相对含水量检测：取被检测植物组织，称取鲜重w1。然后将植物组织置于烘箱中，65℃条件下充分烘干，称量获得干重w2。利用公式计算组织含水量：(w1-w2)/w1*100%.如图3c。
26.mda含量检测：称取0.2 g实验材料放入提前装好钢珠的离心管中，在液氮速冻后立即放入高通量组织研磨仪中，8,000 rpm震荡研磨1 min；随后加入2 ml 10%的tca溶液，4
°
c，4,000 rpm，离心10 min，吸取1 ml上清液加入1 ml 0.5%的tba溶液混匀，在沸水浴中反应15 min，冷却后，4
°
c，10,000 rpm，离心10 min，离心后转移上清液200 μl至酶标板中，于酶标仪中测定532 nm、600 nm和450 nm三处的吸光值并按照如下公式计算mda含量。mda浓度（μmol/l）=6.45(d532-d600)-0.56d450；mda含量（μmol/g）=mda浓度（μmol/l）
×
提取液体积（ml）／样本重量（g）。结果如图3d。
27.实施例4.通过zmmyb56突变体co2响应检测，进一步揭示玉米zm00001d030678基因的作用的机理利用光合仪检测将玉米zm00001d030678基因株系b73与zmmyb56突变体对于改变的co2浓度等诱导性气孔运动条件检测。结果显示，zmmyb56突变体气孔导度、蒸腾速率与光合速率略高于b73，zmmyb56在高浓度co2诱导气孔关闭的反应过程严重受损，zmmyb56突变体对于其他条件反应趋势与b73基本一致（图4）。
28.实施例中5 .zm00001d030678基因的气孔保卫细胞特异表达检测构建zm00001d030678基因自身启动子启动gus基因的载体（zmmyb56pro::gus）。载体构建引物为gusmyb56f：tatgaccatgattacgaattctagaggaagagagggacgagtgt；gusmyb56r：ttaccctcagatctaccatggatcgatcctgtgatgaaaactgat。将载体转入玉米自交系材料b73-329中，得到转基因阳性植株后先繁殖一代。取zmmyb56pro::gus转基因玉米，撕取叶片表皮条进行gus染色，脱色后用显微镜观察。结果显示，gus报告基因主要在气孔保卫细胞中表达（图5）。
29.gus染色的方法：撕取玉米gus转基因幼苗叶片表皮条，置于90%的丙酮中，冰上静置1-2 h，脱色和固定。然后用gus漂洗液清洗两次，去除丙酮。将叶片转移至gus染液中，真空处理5-10 min，暗处理，37
°
c，2-5 h至蓝色肉眼可见。用15%、30%、50%、75%、90%、100%的酒精梯度脱色，每个梯度不少于15 min。在无水乙醇中脱色干净后用显微镜观察拍照。也可转移至70%的酒精中长期保存。
30.实施例中6.通过回交群体创建及表型检测，进一步揭示玉米zm00001d030678基因的属性将zmmyb56突变体株系与对应的玉米zm00001d030678基因b73株系进行杂交，获得回交f1代种子。种植f1，并进行自交，收获自交玉米种子，即为回交f2。种植回交f2代籽粒，检测三叶期玉米表型。分别统计表现出与玉米zm00001d030678基因b73株系幼苗类似的红外叶温及干旱耐性表型植株及与zmmyb56突变体幼苗表型类似植株数目，用于遗传分析，具体如 zmmyb56与zm00001d030678基因b73回交f2表型分离统计表1所示：zmmyb56与b73回交f2代分离统计df=1，x
20.05
=3.84，计算得x2=3.0900《 x
20.05, 差异极显著，即f2代表型确认为3:1，符合孟德尔基因隐性遗传规律。
31.综上所述，通过将具有所述的基因zm00001d030678玉米植株与具有其突变体zmmyb56玉米植株进行对照实验，证明了基因zm00001d030678具有抗旱的功能。本发明对zm00001d030678基因功能的深入研究和分析，对于探索玉米气孔关闭及干旱胁迫反应的分子机制，改良玉米水分利用效率、培育高产耐逆玉米新品种等，具有重要的理论意义和实际应用价值，为后续抗旱玉米新品系的培育和种质资源创新提供了新的技术。
32.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所做出的若干修改，都视为本发明的保护范围。