分子标记VEQ2及其应用

本发明涉及植物生物，具体涉及分子标记veq2及其应用。

背景技术：

1、水稻(oryzasatival)是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国粮食作物中种植面积最大、单产最高的作物。随着我国经济社会的不断发展，市场对营养、健康、美味的功能性稻米的需求逐渐增加。水稻的营养品质包括蛋白质、脂肪、维生素和微量矿物质元素等。维生素e具有很强的抗氧化性，是人体中必需且对人类健康有很大益处的营养物质。活性最高的生育酚的形式为α-生育酚，α-生育酚可以帮助人体维持肌肉、血管系统和中枢神经正常运作，前提是在人体可以每日吸收7-9mg才能保证这些生理功能正常运作，对消化系统和生殖系统的生理功能也有较大帮助。在动植物细胞中维生素e还在细胞转导和转录调控中发挥作用。人们现如今可以通过保健品来摄入维生素e，可以避免心血管疾病和癌症风险的升高，并且可以有效地提高人体的免疫力。开发提高稻米维生素e含量的育种技术，培育高维生素e含量的水稻品种，能满足市场对高营养品质稻米的需求，是水稻营养品质育种的一个新方向。

2、目前，关于水稻中α-生育酚含量改良的研究与报道还比较少。提高维生素e含量的方法有很多种，其中包括转基因、定位相关维生素e含量的qtl以及分子标记辅助等方法。有部分研究为了能给克隆与维生素e合成的相关的基因提供遗传背景，定位到与维生素e含量相关的qtl，同时也可结合基因聚合的方法和分子育种或传统杂交育种的方法，来达到提高维生素e含量的目的。有研究表明生育酚中α-生育酚活性最高，将编码γ-tmt的基因转入目标品种中，理论上将提高α-生育酚的含量。将拟南芥中编码hppd的基因转入到水稻中，生育三烯酚的含量有少量上升，生育酚的总含最几乎不变，α-生育酚的含量明显增加，γ-生育酚的含量明显降低。将拟南芥中编码hpt和γ-tmt的基因单独转入到莴苣中，分别增加生育酚的总量和值，若将两基因同时转入到莴苣中，生育酚总量和α/γ值同时提高，尤其是总量可以提高到野生型的8倍，且比单独转入hpt的单株高倍以上。

3、分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是dna水平遗传多态性的直接的反映。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)是由美国学者lander e于1996年提出的第三代dna分子标记。snp是指同一位点的不同等位基因之间只有个别核苷酸的差异或只有小的插入、突变或缺失等。snp在生物基因组中分布广泛、数量多、遗传稳定，是物种中不同个体表型变异的主要遗传来源。

4、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是一种snp基因分型技术，自面世以来，以其超高的灵活性、准确度和性价比迅速抢占市场，被业内称为“基因分型研究者指尖跳跃的珠链”。kasp是基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型。kasp包含三个部分：带有目标snp的待测试dna；kasp引物混合物(kasp assay mix)，含有fam或hex接头序列的两条等位基因特异性竞争正向引物，和一个共用反向引物；kasp主混合物，含有通用fret(荧光共振能量转移)盒、roxtm被动参考染料、taq聚合酶、游离核苷酸和mgcl2。在pcr反应过程中，两条等位基因特异引物分别与不同基因型的目标snp结合并延伸，从而将fam或hex接头序列渗入到到新合成的dna链上。在后续pcr反应时，带有不同颜色荧光基团的fam或hex寡核苷酸引物就能以新产生的带有fam或hex接头序列的dna为模板进行扩增，释放荧光信号。通过仪器读取荧光信号就能判断基因型。kasp技术通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合来实现双等位基因鉴别。如果给定snp的基因型是纯合的，则只会产生两种可能的荧光信号中的一种。如果基因型是杂合的，则会产生混合荧光信号。kasp具有多态性高、标记丰富、成本低、操作简单等优点，已经成为国际上snp检测分析的主流方法之一。

5、分子标记辅助选择是指通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型，借助分子标记对目标性状基因型进行选择。利用分子标记辅助选择技术提高稻米α-生育酚含量具有不经过转基因步骤，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的优势，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。

6、但目前对这些性状良好、背景稳定的水稻品系进行营养品质的改良所开发的分子标记不具备分型快速、结果准确、成本低廉等优势，且选育效率不高，育种时间长，不能很好提高目标性状选择效率也不能满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了分子标记veq2及其应用。

2、本发明提供了分子标记veq2及其应用，能够使得遗传背景稳定，综合性状良好品系水稻的α-生育酚的含量提高，为了能对这些性状良好背景稳定的水稻品系进行营养品质的改良，提高其α-生育酚的含量，开发了kasp(kompetitive allele-specific pcr)分子标记，证实利用kasp标记更高效，准确地检测调控水稻精米中α-生育酚含量的q2位点基因进行基因分型检测，提高选育效率，缩短育种时间。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高目标性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了分子标记在如下方面中的应用：

5、(i)、预测或鉴定禾本科植物α-生育酚含量；和/或

6、(ii)、禾本科植物营养品质的改良。

7、所述分子标记位于禾本科植物第2号染色体的第28809100位碱基；

8、所述改良包括通过分子标记辅助选择育种提高子代禾本科植物中的α-生育酚含量。

9、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

10、本发明还提供了引物组，所述引物组包括：

11、(i)正向引物q2-f1具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；和

12、(ii)正向引物q2-f2具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；和

13、(iii)反向引物q2-r具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；或

14、(ⅳ)与(i)～(iii)任一项所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)～(iii)任一项所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

15、(ⅴ)与(i)～(ⅳ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)～(ⅳ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

16、(ⅵ)与(i)～(ⅴ)任一项所述的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

17、在上述研究的基础上，本发明还提供了所述引物组在如下方面中的应用：

18、(i)、预测或鉴定禾本科植物α-生育酚含量；和/或

19、(ii)、禾本科植物营养品质的改良；和/或

20、(iii)、制备预测或鉴定禾本科植物α-生育酚含量的试剂盒；

21、所述改良包括通过分子标记辅助选择育种提高子代禾本科植物中的α-生育酚含量。

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

23、本发明还提供了试剂盒，包括所述引物组。

24、本发明还提供了所述试剂盒在如下方面中的应用：

25、(i)、预测或鉴定禾本科植物α-生育酚含量；和/或

26、(ii)、禾本科植物营养品质的改良；

27、所述改良包括通过分子标记辅助选择育种提高子代禾本科植物中的α-生育酚含量。

28、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

29、本发明还提供了生育酚含量的鉴定方法，包括如下步骤：提取禾本科植物基因组dna，使用所述引物组和/或所述试剂盒鉴定禾本科植物的基因型，检测生育酚含量。

30、在本发明的一些具体实施方案中，所述生育酚包括α-生育酚。

31、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

32、在本发明的一些具体实施方案中，根据所述基因型评价α-生育酚含量标准如下：

33、(i)、若所述禾本科植物第2号染色体的第28809100位碱基为cc时，与该位点为tt时相比，所述禾本科植物具有更高的α-生育酚含量，即cc型植株含有的α-生育酚含量均值显著高于tt型植株含有的α-生育酚含量均值；

34、(ii)、若所述禾本科植物第2号染色体的第28809100位碱基为ct时，与该位点为tt时相比，所述禾本科植物具有更高或相似水平的α-生育酚含量，即ct型植株含有的α-生育酚含量均值与tt型植株相比没有显著差异或更高。

35、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

36、本发明还提供了禾本科植物选育的方法，包括如下步骤：提取禾本科植物基因组dna，使用所述引物组和/或所述试剂盒pcr扩增，根据pcr产物的荧光信号判断，获得相应品种。

37、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

38、在本发明的一些具体实施方案中，根据所述荧光信号判断基因型评价α-生育酚含量的标准如下：

39、(i)、若所述禾本科植物第2号染色体的第28809100位碱基为cc时，与该位点为tt时相比，所述禾本科植物具有更高的α-生育酚含量，即cc型植株含有的α-生育酚含量均值显著高于tt型植株含有的α-生育酚含量均值；

40、(ii)、若所述禾本科植物第2号染色体的第28809100位碱基为ct时，与该位点为tt时相比，所述禾本科植物具有更高或相似水平的α-生育酚含量，即ct型植株含有的α-生育酚含量均值与tt型植株相比没有显著差异或更高。

41、在本发明的一些具体实施方案中，所述禾本科植物包括稻；所述稻包括水稻精米或水稻糙米。

42、在本发明的一些具体实施方案中，所述pcr扩增的反应程序包括：

43、(ⅰ)94℃预变性15min，94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；和/或

44、(ⅱ)94℃预变性15min，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，26个循环；和/或

45、(ⅲ)94℃预变性15min，94℃变性20s，57℃退火延伸60s，32～38个循环；

46、优选地，所述(ⅲ)为94℃预变性15min，94℃变性20s，57℃退火延伸60s，35个循环。

47、本发明提供了一种调控水稻α-生育酚含量的位点veq2，以及检测该位点基因型的kasp(kompetitive allele-specific pcr)分子标记和应用，证实利用kasp标记高效，准确地对veq2位点进行基因分型检测，预测α-生育酚含量，提高选育效率，缩短育种时间。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高目标性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。