一种检测人TGFBI基因突变的引物探针组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种检测人tgfbi基因突变的引物探针组合物及其应用。

背景技术：

1、角膜营养不良(corneal dystrophy)是一组遗传性、对称性、非炎症性角膜疾病的总称，其共同特点是在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。avellino角膜营养不良(avellino corneal dystrophy，acd)是常染色体显性遗传病，外显率高，男女患病率大致相等。由于其临床表现与颗粒状角膜营养不良(granular corneal dystrophy,gcd)ⅱ型相似，即发病早(10-20岁)、进展快、手术后复发快的特点，既往将该类疾病划归gcd。但该病的晚期又可出现线状混浊，即格子样改变，尤其是下方角膜多见，尽管出现较晚，但随着患者年龄增大出现比例明显增加。

2、tgfbi基因是第一个被发现，也是目前报道的最为常见的与角膜营养不良相关的基因。它位于人第五号染色体，包含17个外显子，编码一个由683个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白存在于角膜上皮细胞和基质细胞中，发挥创伤愈合和黏附作用，其病变可以导致淀粉样蛋白的沉淀。avellino型角膜营养不良主要是由tgfbi基因第四外显子p.r124h位点突变(cgc>cac)引起的。患者的临床症状与r124h位点的突变剂量存在累积效应，即纯合突变的患者较杂合子患者发病更早更严重，且更容易复发。

3、现有技术中采用荧光定量pcr加焦磷酸测序法检测r124h位点突变情况，要求先进行实时荧光pcr扩增之后，先经过琼脂糖凝胶电泳，有单一目的条带出现的则进行焦磷酸测序，反应中加入测序引物在qiagen pyromark q24测序仪上进行测序反应，一次实验需进行三次反应，操作复杂，且频繁开盖，增加气溶胶污染风险。因此亟需开发操作简便、精度高的r124h位点突变情况的检测方法及相关的试剂或试剂盒。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何快速的检测人tgfbi基因的是否产生r124h突变。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种用于检测人tgfbi基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括引物探针组合物1和引物探针组合物2，所述引物探针组合物1包括特异性扩增和结合核苷酸序列是seq id no.1的dna分子的引物对和探针，所述引物探针组合物2包括特异性扩增和结合核苷酸序列是seq id no.2的dna分子的引物对和探针。

3、进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物1包括引物r124-f、引物r124wt-r和探针r124 probe，所述引物探针组合物2包括所述引物r124-f、引物r124h-r和所述探针r124 probe，

4、所述引物r124-f是核苷酸序列是seq id no.3所示的单链dna；

5、所述引物r124wt-r是核苷酸序列是seq id no.4所示的单链dna；

6、所述引物r124h-r是核苷酸序列是seq id no.5所示的单链dna；

7、所述探针r124 probe的核苷酸序列是seq id no.8。

8、本发明中，所述人tgfbi基因突变可为所述tgfbi基因r124突变，所述r124位点为genbank accession no.ng_012646.1(18-may-2020)的第22512-22514位，所述r124h突变的hgvs命名为ng_012646.1:g.22513g>a。

9、本发明中，核苷酸序列是seq id no.1的dna分子是人tgfbi基因r124野生型，核苷酸序列是seq id no.2的dna分子是人tgfbi基因r124h突变型。

10、进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物1和引物探针组合物2还包括内参基因的引物对和探针，所述内参基因为b2m基因，所述内参基因的引物对包括引物b2m-f和引物b2m-r，所述内参基因的探针为b2m-probe，

11、所述引物b2m-f是核苷酸序列是seq id no.6所示的单链dna；

12、所述引物b2m-r是核苷酸序列是seq id no.7所示的单链dna；

13、所述探针b2m-probe的核苷酸序列是seq id no.9。

14、本发明中，所述r124-probe为特异性识别人tgfbi基因(包括r124野生型及r124h突变型)的探针，所述b2m-probe为特异性识别b2m基因的探针，探针的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。所述r124-probe和所述b2m-probe5'端连接的荧光基团的发光类型不同。

15、荧光基团可选自但不限于fam(5/6-羧基荧光素)、vic(绿色荧光蛋白)、tet(四氯-6-羧基荧光素)、joe(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、hex(六氯-6-甲基荧光素)、cy3、tamra(6-羧基四甲基若丹明)、rox(羧基-x-罗丹明)、texas red、lc red640、cy5(花菁燃料)、lc red705、fitc(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重pcr检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同。

16、所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。

17、进一步地，上述的引物探针探针组合物中，所述引物探针组合物1中r124-f、r124wt-r、r124-probe、b2m-f、b2m-r、b2m-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中r124-f、r124h-r、r124-probe、b2m-f、b2m-r、b2m-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。

18、进一步地，上述的引物探针组合物中，所述引物探针组合物还包括质控品质粒，所述质控品质粒选自下述任一种：

19、a1)、含有核苷酸序列是seq id no.11的dna分子的重组质粒；

20、a2)、含有核苷酸序列是seq id no.12的dna分子的重组质粒；

21、a3)、含有核苷酸序列是seq id no.13的dna分子的重组质粒。

22、在本发明的一个实施例中，上述质控品质粒分为a、b、c三组用于操作环节的质控。具体如下：

23、质控品a包含a2)和a3)2种重组质粒；

24、质控品b包含a1)、a2)和a3)共3种重组质粒；

25、质控品c包含a1)和a3)2种重组质粒。

26、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述引物探针组合物在制备鉴定或辅助鉴定人tgfbi基因突变的试剂或试剂盒中的应用。

27、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定人tgfbi基因突变的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有上述的引物探针组合物。

28、进一步地，上述试剂或试剂盒中含有引物探针组合物1和引物探针组合物2。

29、进一步地，上述试剂或试剂盒中所述引物探针组合物1中r124-f、r124wt-r、r124-probe、b2m-f、b2m-r、b2m-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1；所述引物探针组合物2中r124-f、r124h-r、r124-probe、b2m-f、b2m-r、b2m-probe的物质的量比值为4:4:3:2:2:1。

30、进一步地上述试剂或试剂盒中的引物探针组合物中各组分分别包装。

31、为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定人tgfbi基因r124h突变的方法，包括用上述的引物探针组合物1和引物探针组合物2分别对待测样本的基因组dna进行荧光定量pcr，根据式1的δct得到引物探针组合物1的δct和引物探针组合物2的δct，根据这两个δct按照下述步骤确定待测样本是否存在所述突变，

32、r1)引物探针组合物1的δct＜5，且引物探针组合物2的δct＜5，待测样本为杂合突变；

33、r2)引物探针组合物1的δct≥5，且引物探针组合物2的δct＜5，待测样本为纯合突变；

34、r3)引物探针组合物1的δct＜5，且引物探针组合物2的δct≥5，待测样本为野生型；

35、δct＝│ct(r124-probe)-ct(b2m-probe)│     式1，

36、其中，ct(r124-probe)为由所述探针r124-probe得到的荧光定量pcr的循环数，所述ct(b2m-probe)为由所述探针b2m-probe得到的荧光定量pcr的循环数。探针r124-probe得到的荧光定量pcr的循环数分别表示引物探针组合物1和引物探针组合物2的两个反应体系的荧光定量pcr的循环数。

37、在本发明的实施例中，ct(r124-probe)也用ct(fam)表示，ct(b2m-probe)也用ct(rox)表示。

38、本发明采用arms-pcr结合荧光pcr探针法，原理是pcr下游引物3’端碱基错配会导致产物急剧减少，设计适当的引物可以通过pcr方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。现有技术针对待测基因snp位点设计pcr引物，结合taqman探针进行实时荧光定量pcr检测，同时引入内参基因，根据ct待测基因与ct内参基因之间的差值△ct值来判断多态位点的型别，从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。

39、本发明利用两种反应体系检测tgfbi基因r124h突变位点及r124wt野生型位点，根据ct目标基因与ct内参基因之间的差值△ct值来判断多态位点的型别，从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。为了降低管间差异导致的判读结果不准确的风险，每个反应体系中均引入内参基因同时进行检测。

40、上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。

41、本专利检测方法：1)提取样本中的dna，将其作为dna模板，dna浓度不低于1ng/μl，dna的od260/od280值在1.6-2.0之间；2)本试剂盒扩增反应体系为：25×anstart masterpcr mix 0.8μl，5×taq buffer(mg2+plus)4μl，10×引物探针混合液2μl，模板3μl，超纯水补充至20μl。3)pcr反应体系：50℃2min，95℃3min；95℃30sec，60℃50sec，40个循环；25℃1min；4)结果判读。

42、结果判读：

43、r124判读结果：b2m基因荧光pcr的扩增曲线呈典型的s型，且ct值≦30，δct＝│ct(r124-probe)-ct(b2m-probe)│。

44、(2)技术效果

45、本发明只需一次pcr扩增(两组组合在同一反应程序，同一反应板上进行，可认为是同一次pcr扩增反应)即可得到结果，操作简便，且省去了中间开盖过程，降低污染风险。