单管检测多种呼吸道病毒的引物探针组合及检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学诊断，具体涉及一种单管检测多种呼吸道病毒的引物探针组合及检测试剂盒。

背景技术：

1、呼吸道感染(respiratory tract infection，rti)为常见的传染性疾病，是全球公共的严重卫生问题，发病率居急性传染病首位，主要是指包括鼻、咽、喉、气管、支气管以及肺部的感染性炎症。

2、呼吸道感染有多种病原体所致，其数量也日益增加。近年来，随着环境及气候变化，严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes，sars)、中东呼吸综合征(middle eastrespiratory syndromes，mars)、新型冠状病毒(cov-2019)等新发急性呼吸道传染病层出不穷，给传染病的监测和防控带来巨大挑战。引起呼吸道感染的病原谱十分复杂，其中70％～80％的呼吸道感染的主要病原体为病毒。研究发现，引起呼吸道感染的病毒感染率最高的5种病原体依次为：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒(包括副流感病毒ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型)。

3、目前市场上已上市的多重呼吸道病原体检测试剂盒，大多采用物理分割将反应液分成多管进行检测，且仅使用fam、vic/hex、rox或者cy5通道，其检测通量和多重qpcr仪使用效率显著降低；其次部分检测试剂采用多种方法组合，如qpcr组合熔解曲线或pcr飞行时间质谱等，虽然解决了通量问题，但检测时间增加，无法满足急性呼吸道感染情况下的快速检测；另外，目前国内已上市的新型冠状病毒检测试剂中，大多将orf1ab基因和n基因分成两个通道，使得检测结果的判读极其复杂，且由于两个基因扩增效率不同导致低浓度样本的复检率大大增加。

4、呼吸道病毒感染患者症状各异但无特异性。近年来，呼吸道感染尤其是不明病原体的急性呼吸道感染发病率升高，因此快速鉴定急性呼吸道感染的病原体对于选择及时的治疗方法、挽救生命、控制疫情、避免药物滥用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种单管检测引起上呼吸道感染最常见的五种病毒共7种病原体：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒(包括副流感病毒ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型)的引物探针组合及检测试剂盒。旨在解决现有技术中无法通过一次检测对上述病原体引起的上呼吸道感染进行分诊的问题。

2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、一种单管检测多种呼吸道病毒的引物探针组合，该引物探针组合包括：

4、检测新冠病毒orf1ab基因的引物对如seq id no：1～2所示、探针如seq id no：3所示；

5、检测新冠病毒n基因的引物对如seq id no：4～5所示、探针如seq idno：6所示；

6、检测甲型流感病毒的引物对如seq id no：7～8所示、探针如seq id no：9所示；

7、检测乙型流感病毒的引物对如seq id no：10～11所示、探针如seq idno：12所示；

8、检测呼吸道合胞病毒的引物对如seq id no：13～14所示、探针如seq idno：15所示；

9、检测副流感病毒ⅰ型的引物对如seq id no：16～17所示、探针如seq idno：18所示；

10、检测副流感病毒ⅱ型的引物对如seq id no：19～20所示、探针如seq idno：21所示；

11、检测副流感病毒ⅲ型的引物对如seq id no：22～23所示、探针如seq idno：24所示。

12、作为优选实施方案，所述引物探针组合还包括：

13、内源性内标引物对如seq id no：25～26所示、内标探针如seq id no：27所示。

14、seq id no：1～27的序列信息见表1。

15、表1：引物探针序列

16、

17、本发明还提供一种单管检测多种呼吸道病毒的检测试剂盒，该试剂盒包括seq idno：1～27所示的引物探针组合。

18、作为优选实施方案，所述特异性引物seq id no：1-2，seq id no：4-5，seq id no：7-8，seq id no：10-11，seq id no：13-14，seq id no：16-17，seq id no：19-20和seq idno：22-23在扩增反应液中的浓度分别为0.15-0.60μm；所述特异性探针seq id no：3，seqid no：6，seq id no：9，seq id no：12，seq id no：15，seq id no：18，seq id no：21和seqid no：24在扩增反应液中的浓度分别为0.05-0.35μm；所述内源性内标引物探针seq idno：25-27在扩增反应液中的浓度分别为0.05-0.20μm。

19、作为优选实施方案，所述探针的荧光标记选自fam、vic、rox、cy5、quasar705和atto425。

20、作为优选实施方案，所述新型冠状病毒探针seq id no：3和seq id no：6采用fam荧光标记，甲型流感病毒探针seq id no：9采用vic荧光标记，乙型流感病毒探针seq idno：12采用rox荧光标记，副流感病毒ⅰ型探针seq id no：18、副流感病毒ⅱ型探针seq idno：21和副流感病毒ⅲ型探针seq id no：24均采用cy5荧光标记，呼吸道合胞病毒探针seqid no：15采用quasar705荧光标记，内源性内标探针seq id no：27采用atto425荧光标记。

21、作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括：核酸扩增反应液、酶混合液；

22、所述核酸扩增反应液包括：seq id no：1～27所示的引物探针和rt-pcr反应试剂；

23、所述酶混合液，包括：逆转录酶、dna聚合酶、rna酶抑制剂、udg酶、牛血清白蛋白、鱼明胶、单链结合蛋白及甜菜碱。

24、作为优选实施方案，所述rt-pcr反应试剂包括：10-40mm的tris缓冲液、30-60mm钾离子、20-50mm硫酸铵、3-7mm镁离子、400-800μmda/t/g/c/utps、25-40mm四甲基氯化铵、0.5％-1.5wt％海藻糖、体积百分比0.1％-2％二甲基亚砜、体积百分比1-5.0％甲酰胺、0.1-2.0wt％的聚乙二醇。

25、作为优选实施方案，所述酶混合液包括：0.3-0.5u/μl逆转录酶、0.15-0.30u/μldna聚合酶、0.25-0.40u/μl rna酶抑制剂、0.0015-0.0030udg酶、0.1-0.3wt％牛血清白蛋白、0.001-1.00wt％鱼明胶、0.001-1.00wt％单链结合蛋白、0.1-5wt％甜菜碱。

26、作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和空白对照；

27、所述阳性对照为新冠病毒n基因假病毒、甲型流感病毒假病毒、乙型流感病毒假病毒、呼吸道合胞病毒假病毒、副流感病毒ⅰ型假病毒和人阴性咽拭子组成的混合液；

28、所述阴性对照为人阴性咽拭子；

29、所述空白对照为无核酸酶水。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

31、1，本发明提供的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性，将其应用于检测试剂盒，能够高效的对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒和人副流感病毒(包括副流感病毒ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型)感染进行筛查和分诊。

32、2，本发明的试剂盒能够实现单管试剂对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒和人副流感病毒(包括副流感病毒ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型)进行同时检测，并且满足较高的灵敏度。本发明试剂盒将orf1ab基因和n基因放在同一通道能大大降低新型冠状病毒变异导致的漏检，且增加灵敏度并降低了复检率。

33、3，本发明的试剂盒不仅缩短了检测时长，同时也提高了对多种呼吸道病原检测的通量，大大增加了多种荧光pcr仪器使用效率，避免了检测通道不饱和引起的仪器资源浪费的情况。