一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法

1.本发明属于海洋藻类蛋白质提取技术领域，具体地说是一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法。


背景技术：

2.近年来，随着养殖技术不断进步和养殖规模逐渐扩大，坛紫菜的加工利用也逐渐引起人们的关注。目前关于坛紫菜源活性物质的研究集中于萜类、多糖类物质的提取和活性研究，而对于坛紫菜蛋白质和多肽的研究少之甚少。因此，开发一种高效的坛紫菜蛋白质提取方法，对于坛紫菜的开发利用具有重要的促进作用。
3.由于坛紫菜细胞壁坚韧，采取一般提取方法不能达到良好的提取效果。在坛紫菜蛋白质的提取过程中，高效地破碎其刚性细胞壁，成为提取技术的关键。此外，蛋白质提取液中包含大量多糖类物质，用传统的离心沉淀和等电点沉淀无法实现蛋白质与杂质的良好分离。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，具有省时、高效的特点。
5.为实现上述目的，本发明所述一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，具体步骤如下：s1：坛紫菜预处理，取坛紫菜于55℃～70℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定；利用高速粉碎机对干燥后的坛紫菜进行粉碎，过200目筛，于-20℃密封保存（保存时间，保存时间是否与提取率有关或与提取效率有关）；s2：超声波辅助破壁处理坛紫菜，将坛紫菜粉末配制成溶液（溶剂是否为水），调整ph至6.0～8.0，采用超声波进行辅助处理，超声波频率10-15 khz，模式为间歇式超声，超声发生时间和超声间隔时间均为6～8 s，超声功率800～1500 w范围内，超声全程时间40～80 min；超声处理结束后进行首次离心，取上清液；s3：坛紫菜粗蛋白质纯化，冰浴条件下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度达50%～70%，静置2h，将硫酸铵沉淀后的溶液进行再次离心，取沉淀物，即得粗蛋白质；将沉淀物复溶于双蒸水，调节溶液ph至中性，于200 da透析袋中透析24～48 h脱盐；s4：坛紫菜粗蛋白质干燥，对透析后的坛紫菜蛋白质溶液进行真空旋转蒸发浓缩收集浓缩液；将浓缩液置于-40℃~-50℃环境中冷冻，于真空冷冻干燥机中干燥12~24 h，即得
坛紫菜粗蛋白质干粉。
6.优先的，所述步骤s2中在超声处理结束后进行首次离心，首次离心条件为10000 r
•
min-1
、4℃、20 min。
7.优先的，所述步骤s3中，将硫酸铵沉淀后的溶液进行再次离心，再次离心条件为15000 r
•
min-1
、4℃、15 min。
8.优先的，所述步骤s4中透析后的坛紫菜蛋白质溶液真空旋转蒸发浓缩，浓缩条件为45℃～55℃，浓缩至200～300 mg
•
ml-1
。
9.所述坛紫菜粗蛋白质在5~50 mg/ml范围内具有较强的抗氧化活性，abts自由基清除能力相当于0.83
±
0.08 mmol/l trolox，dpph清除率在10 mg/ml时达到68.04
±
0.73%。
10.本发明所述一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，其有益效果在于：本发明通过对坛紫菜进行粉碎、溶解、超声波辅助水提等处理过程，能够破碎坛紫菜细胞壁，促进蛋白质溶出，充分提取坛紫菜中的蛋白质，提高了坛紫菜蛋白质的提取率，并有效缩短了提取时间，节约了提取成本；并且高饱和度硫酸铵能够沉淀蛋白质，使得回收率高；在硫酸铵盐析法沉淀蛋白质的过程中，随硫酸铵饱和度的增加，沉淀中蛋白质回收率先升高后下降，在硫酸铵饱和度50%～70%时达到最大值；根据本发明方法，通过bca试剂盒法检测产品蛋白质含量，得出沉淀中蛋白质回收率为72%～85%。
附图说明
11.图1为ph对坛紫菜蛋白质提取率的影响；图2为坛紫菜蛋白质性质。
具体实施方式
12.实施例1本发明所述一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，具体步骤如下：s1：坛紫菜预处理，取坛紫菜于55℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定；利用高速粉碎机对干燥后的坛紫菜进行粉碎，过200目筛，于-20℃密封保存；s2：超声波辅助破壁处理坛紫菜，将坛紫菜粉末配制成溶液，调整ph至6.0，采用超声波进行辅助破壁处理，超声波频率10 khz，模式为间歇式超声，超声发生时间和超声间隔时间均为6 s，超声功率1200 w，超声全程时间60 min；超声处理结束后进行首次离心，首次离心条件为10000 r
•
min-1
、4℃离心20 min，取上清液，测定蛋白质提取率为50.11%；s3：坛紫菜粗蛋白质纯化，在冰浴条件下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度达60%，静置2 h，将硫酸铵沉淀后的溶液进行再次离心，再次离心条件为15000 r
•
min-1
、4℃离心15 min取沉淀物，测定剩余上清液中蛋白质含量，计算沉淀蛋白质回收率为72.13%；将沉淀物复溶于双蒸水，调节溶液ph至7.0，于200 da透析袋中透析48 h脱盐；s4：坛紫菜粗蛋白质干燥，对透析后的坛紫菜蛋白质溶液进行真空旋转蒸发浓缩收集浓缩液，真空旋转蒸发浓缩为45℃下进行真空旋转蒸发，浓缩至200 mg
•
ml-1
，冷阱温度-45℃条件下进行冷冻真空干燥，即得坛紫菜蛋白质干粉。
13.实施例2本发明所述一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，具体步骤如下：
s1：坛紫菜预处理，取坛紫菜于60℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定；利用高速粉碎机对干燥后的坛紫菜进行粉碎，过200目筛，于-20℃密封保存；s2：超声波辅助破壁处理坛紫菜，将坛紫菜粉末配制成溶液，调整ph至7.0，采用超声波进行辅助破壁处理，超声波频率15 khz，模式为间歇式超声，超声发生时间和超声间隔时间均为7 s，超声功率1000 w，超声全程时间60 min；超声处理结束后进行首次离心，首次离心条件为10000 r
•
min-1
、4℃离心20 min，取上清液，测定蛋白质提取率为58.12%；s3：坛紫菜粗蛋白质纯化，在冰浴条件下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度达65%，静置2 h，将硫酸铵沉淀后的溶液进行再次离心，再次离心条件为15000 r
•
min-1
、4℃离心15 min取沉淀物，测定剩余上清液中蛋白质含量，计算沉淀蛋白质回收率为85.16%；将沉淀物复溶于双蒸水，调节溶液ph至7.0，于200 da透析袋中透析48 h脱盐；s4：坛紫菜粗蛋白质干燥，对透析后的坛紫菜蛋白质溶液进行真空旋转蒸发浓缩收集浓缩液，真空旋转蒸发浓缩为45℃下进行真空旋转蒸发，浓缩至200 mg
•
ml-1
，冷阱温度-45℃条件下进行冷冻真空干燥，即得坛紫菜蛋白质干粉。
14.实施例3本发明所述一种超声波辅助破壁提取坛紫菜蛋白质的方法，具体步骤如下：s1：坛紫菜预处理，取坛紫菜于70℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定；利用高速粉碎机对干燥后的坛紫菜进行粉碎，过200目筛，于-20℃密封保存；s2：超声波辅助破壁处理坛紫菜，将坛紫菜粉末配制成溶液，调整ph至7.0，采用超声波进行辅助破壁处理，超声波频率15 khz，模式为间歇式超声，超声发生时间和超声间隔时间均为8 s，超声功率1500 w，超声全程时间70 min；超声处理结束后进行首次离心，首次离心条件为10000 r
•
min-1
、4℃离心20 min，取上清液，测定蛋白质提取率为54.32%；s3：坛紫菜粗蛋白质纯化，在冰浴条件下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度达70%，静置2 h，将硫酸铵沉淀后的溶液进行再次离心，再次离心条件为15000 r
•
min-1
、4℃离心15 min取沉淀物，测定剩余上清液中蛋白质含量，计算沉淀蛋白质回收率为81.44%；将沉淀物复溶于双蒸水，调节溶液ph至7.0，于200 da透析袋中透析48 h脱盐；s4：坛紫菜粗蛋白质干燥，对透析后的坛紫菜蛋白质溶液在50℃下进行真空旋转蒸发浓缩收集浓缩液，浓缩至300 mg
•
ml-1
，冷阱温度-45℃条件下进行冷冻真空干燥，即得坛紫菜蛋白质干粉。
15.单因素试验：补充1.坛紫菜于55℃～70℃恒温干燥箱中烘干至质量恒定，其中温度对提取率的影响；2.高速粉碎机对提取率的影响；-20℃密封保存温度对提取率的影响；3.ph 6.0～8.0对提取率的影响；在ph 3~9范围内，溶液ph值对坛紫菜蛋白质提取率的影响比较显著（p《0.05）。随着ph的增大，提取率呈现先增加随后趋于平衡的趋势，当ph为7 时达到最大值。
16.坛紫菜蛋白在ph 5.5 时乳化活性可达112.49
±
5.33 m2/g，乳化稳定性为40.52
±
1.08 min，蛋白质具有开发成天然乳化剂的潜力，能够通过物理、化学和生物学方法对其进行蛋白质改性，使其获得更加良好的乳化性质。
17.坛紫菜蛋白质在ph 4.5时泡沫稳定性达80.84
±
2.95%，说明本方法提取的蛋白质
具有良好的泡沫稳定性。
18.4.超声波进行辅助破壁处理，超声波参数对提取率的影响；5.首次离心条件对提取率的影响；再次离心条件对提取率的影响；6. 硫酸铵粉末对提取率的影响；7.坛紫菜蛋白质性质测定。
19.坛紫菜蛋白质在5~50 mg/ml范围内具有较强的抗氧化活性，abts自由基清除能力相当于0.83
±
0.08 mmol/l trolox，dpph清除率在10 mg/ml时达到68.04
±
0.73%。
20.坛紫菜蛋白质的等电点为4.5。
21.由图2可知，坛紫菜的蛋白质吸水性为1.797ml/g，吸油性0.998ml/g，持水性1.640g/g。