一种纳米乳液热稳定性的提高方法

1.本发明属于蛋白质的改性技术领域，具体涉及一种适度酶解改性乳清蛋白结合多糖形成蛋白胶束再协同酶交联处理乳清蛋白胶束复合物提高乳清蛋白乳液热稳定性的方法。


背景技术：

2.乳清蛋白具有丰富的营养价值和独特的生理功能，含有丰富的必需氨基酸，易被生物体消化吸收，有“蛋白之王”的美誉，因此被作为功能性食品、营养制品等的重要原料和成分，广泛应用于食品生产中。乳清蛋白在水相中高度溶解，乳化过程中能够迅速扩散吸附在油水界面，使疏水部分位于在油相中，亲水基团位于水相中，来保持油滴的静电和立体稳定，在油滴周围展开并形成一层界面膜可制备成稳定水包油乳液。
3.但是乳清蛋白的乳化特性会受到自身的分子聚集、表面疏水性以及巯基交联凝胶性的影响，一定程度会限制乳清蛋白对油相的吸附速率和在乳化液滴表面的延展性，从而影响其是否能在水油界面形成良好的薄膜。同时乳清蛋白存在热不稳定性，在生产加工过程中结构易被破坏，尤其是在进行工业上巴氏杀菌和121℃热杀菌时它很容易发生热诱导变性和聚合，从而降低其溶解性和功能性，导致其制备的乳液变得不稳定。因此可通过物理、化学及酶法等技术对乳清蛋白进行改性处理可改变其疏水基团分布、空间排列构象以及氨基酸组成等，进而改进乳清蛋白的功能性质及其乳液热稳定性。
4.酶解是提高蛋自质功能(如乳化活性)和营养吸收的一种相对安全、经济、便捷的方法。适度的酶解可以增加蛋白质的乳化活性，这是因为适度酶解会导致蛋白质链结构的解构，增加疏水性肽的暴露，从而使它们更容易吸附在油表面。由于二级结构的减少，适度酶解可以增加蛋白质的热稳定性，减少絮状物的产生。然而，一些研究报告认为在乳液体系中，蛋白质水解物会降低乳液的热稳定性。这可能是由于蛋白质水解物的空间位阻降低，或蛋白质疏水肽的增加导致蛋白质之间的疏水相互作用。
5.乳清蛋白在90℃～100℃的热处理过程中，β-乳清蛋白发生热变性后-sh暴露，发生二硫键交换反应形成聚合物。热变性的α-乳白蛋白与己形成的β-乳清蛋白聚合物相互结合，进而通过二硫键与κ-酪蛋白结合形成大分子聚合物，进而形成乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物。得到乳清蛋白胶束复合物的表面疏水性增强，乳清蛋白的乳化特性得到改善。
6.相比单独蛋白，蛋白-多糖复合物乳化得到液滴对环境应力具有良好的稳定性，从而表现出良好的乳化特性。κ-卡拉胶是带负电荷生物聚合物，但蛋白质为两性物质，其可与蛋白质产生交互作用，根据浓度和ph的不同，分别发生凝聚沉淀、悬浮和凝胶作用。κ-卡拉胶的-so
4-基团与乳清分离蛋白的-nh
3+
基团之间产生的静电相互作用力所主导，多糖的存在改变了蛋白质的空间结构，使得色氨酸残基移向更加疏水的环境中。在酸性条件下加入多糖的导致蛋白质的表面疏水性降低，亲水性增强，有利于乳清蛋白分子向油-水界面的扩散，改善乳清蛋白质的乳化性质。
7.酶法交联是蛋白酶通过类蛋白反应使乳清蛋白发生交联，将氨基酸从一条肽链转
移至另一条肽链上实现对肽链的改变。tgase常被用于蛋白交联反应中，主要以肽链上游离的ε-氨基、赖氨酸残基的氨基为受体，酰基供体为谷氨酰胺残基上的γ-羟基酰胺基，在分子内和分子间形成成ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸交联链，进而改善乳清蛋白的乳化性等性质。
8.基于上述现状，本发明将利用适度酶解改性乳清蛋白结合多糖形成蛋白胶束再协同酶交联处理乳清蛋白胶束复合物提高乳清蛋白乳液热稳定性的方法，来延长乳液的储藏期。


技术实现要素：

9.针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种适度酶解改性乳清蛋白结合多糖形成蛋白胶束再协同酶交联处理提高乳清蛋白纳米乳液热稳定性的方法，以达到提高乳清蛋白乳化特性和乳液热稳定性的目的。本发明利用协同处理后仅添加2％的乳清蛋白，即可制备在高温灭菌后仍保持稳定的乳液并且可长期储藏。
10.本发明的技术方案如下：
11.一种蛋白胶束协同酶交联处理提高乳清蛋白乳液热稳定性的方法，包括：
12.将乳清蛋白溶解于去离子水中得到乳清蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行适度酶解后，再进行灭酶并使蛋白变性，接着加入酪蛋白，在90-100℃微煮沸热诱导下产生α-乳白蛋白和β-乳球蛋白与κ-酪蛋白胶束反应，冷却至常温，添加κ-卡拉胶，产生絮凝反应，形成大分子蛋白-蛋白胶束与蛋白-多糖胶束，然后用tgase进行交联处理，冷冻干燥得到改性乳清蛋白；利用改性乳清蛋白作为乳化剂制备稳定纳米乳液；
13.制备的纳米乳液经过121℃、15min高温高压灭菌后，仍保持稳定且可储藏180天以上。
14.进一步，本发明所述的方法包括如下步骤：
15.(1)配制乳清蛋白溶液
16.具体的配制方法为：将乳清蛋白溶于去离子水中，磁力搅拌2～4h，充分溶解，放置4℃冰箱中过夜，完全水化，得到乳清蛋白溶液；优选乳清蛋白溶液的质量分数为15％；
17.(2)适度酶解：在乳清蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶进行适度酶解；
18.优选木瓜蛋白酶的添加量为300-400u/g，处理时间为1-3h；
19.(3)灭酶变性：将适度酶解后的乳清蛋白溶液进行灭酶和乳清蛋白变性；
20.优选灭酶和乳清蛋白变性的温度为100℃，时间为10min；
21.(4)胶束反应：在步骤(3)处理后的乳清蛋白溶液中添加酪蛋白，在90-100℃下反应5-15min，得到乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物；
22.优选酪蛋白与乳清蛋白的质量比为0.05-0.25：1；
23.在90-100℃微煮沸热诱导下，能够产生α-乳白蛋白和β-乳球蛋白与κ-酪蛋白胶束反应，得到乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物；
24.(5)絮凝反应：将步骤(4)所得乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物冷却至常温后，添加κ-卡拉胶(产生絮凝反应)，得到乳清蛋白-酪蛋白-卡拉胶大分子胶束复合物；
25.优选κ-卡拉胶的添加量为0.005-0.25％；
26.(6)酶交联处理：在步骤(5)所得乳清蛋白-酪蛋白-卡拉胶大分子胶束复合物中添加tgase，于40-60℃下进行酶交联反应2-8h，之后于冰水中顿酶，得到改性乳清蛋白溶液；
27.优选tgase的添加量为20-40u/g；
28.优选酶交联反应的条件为45℃，4h；
29.(7)将步骤(6)所得改性乳清蛋白溶液冷冻干燥，得到改性乳清蛋白；
30.(8)乳清蛋白水相制备：将步骤(7)所得改性乳清蛋白分散于去离子水中，常温下搅拌完全溶解后，得到水相待用；
31.优选改性乳清蛋白的添加量为2-5％；
32.(9)玉米油油相制备：将玉米油隔水预热后加入单甘酯，使其完全溶解，得到油相，油温保持在60℃；
33.优选单甘酯的添加量为0.05-0.1％；
34.(10)乳液制备：将水相和油相混合，经高速剪切机剪切处理得到粗乳液，再经过微射流处理制得最终乳液；
35.优选高速剪切机的工作参数为：5000rpm、1min；
36.优选微射流处理的工作参数为：压力25-35mpa，次数2次；
37.所得最终乳液中，优选玉米油含量为5-10％；
38.(11)灭菌
39.具体的灭菌操作如下：将制备好的最终乳液封装到瓶中，放入灭菌锅中121℃、15min灭菌。
40.本发明的有益效果在于：
41.本发明利用适度酶解改性乳清蛋白结合多糖形成蛋白胶束再协同酶交联处理来提高乳清蛋白的乳化特性及制备纳米乳液的热稳定性，选用乳清蛋白为原料，添加木瓜蛋白酶对乳清蛋白进行适度酶解改性后与多糖结合形成蛋白胶束，再利用tgase交联作用，得到经过复合改性乳清蛋白。
42.本发明使用的tgase交联效率高、专一性强，交联作用条件温和且过程简单，成本低，易推广应用于大型企业生产中。同时利用协同处理后的乳清蛋白在浓度仅为2％时即可制备在高温灭菌处理仍保持稳定的乳液，且长时间储存后不出现分层现象，可达到产品货架期要求。
43.本发明制备所需的乳清蛋白营养价值高，改性后乳清蛋白乳化特性提高，可作为良好乳化剂制备稳定纳米乳液，同时提高纳米乳液的热稳定性，延长纳米乳液的储藏期。
附图说明
44.图1为实施例1～3中改性乳清蛋白乳化活性指数(eai)图。
45.图2为实施例1～3中改性乳清蛋白乳化稳定指数(esi)图。
46.图3为实施例1～3中改性乳清蛋白表面疏水性(h0)图。
47.图4为实施例4～6中改性乳清蛋白制备高温灭菌后纳米乳液及储藏180d的宏观图。
48.图5为实施例4～6中改性乳清蛋白制备高温灭菌后0d和180d的平均粒径图。
具体实施方式
49.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而
更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
50.实施例1
51.一种蛋白胶束协同酶交联处理提高乳清蛋白乳化特性的方法，包含如下步骤：
52.(1)乳清蛋白的水化：
53.将乳清蛋白溶解于去离子水中，配置成干物质含量为15％(w/w)的乳清蛋白水合物，磁力搅拌2h使其完全溶解后，放置于4℃冰箱中过夜以充分水化。
54.(2)乳清蛋白适度酶解：
55.在乳清蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶(300u/g)进行适度酶解3h。将上述适度酶解后的乳清蛋白溶液进行100℃灭酶和乳清蛋白变性；
56.(3)乳清蛋白胶束复合物制备：
57.向完全水化的乳清蛋白溶液中添加酪蛋白(乳清蛋白:酪蛋白为1:0.1)，在90℃～100℃微煮沸热诱导下产生α-乳白蛋白和β-乳球蛋白与κ-酪蛋白胶束反应(5min)，冷却至常温后，添加0.1％κ-卡拉胶，产生絮凝反应，形成大分子蛋白-蛋白胶束与蛋白-多糖胶束。
58.(4)乳清蛋白的酶交联处理：
59.将初步改性得到的乳清蛋白胶束溶液中加入30u/g的tgase，放置于45℃的水浴锅中反应4h，取出后立即放置于冰水中顿酶。
60.(5)改性乳清蛋白的成品：
61.将灭酶后的乳清蛋白冷冻干燥，得到改性乳清蛋白成品。
62.实施例2
63.一种蛋白胶束协同酶交联处理提高乳清蛋白乳化特性的方法，包含如下步骤：
64.(1)乳清蛋白的水化：
65.将乳清蛋白溶解于去离子水中，配置成干物质含量为15％(w/w)的乳清蛋白水合物，磁力搅拌2h使其完全溶解后，放置于4℃冰箱中过夜以充分水化。
66.(2)乳清蛋白适度酶解：
67.在乳清蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶(400u/g)进行适度酶解3h。将上述适度酶解后的乳清蛋白溶液进行100℃灭酶和乳清蛋白变性；
68.(3)乳清蛋白胶束复合物制备：
69.向完全水化的乳清蛋白溶液中添加酪蛋白(乳清蛋白:酪蛋白为1:0.1)，在90℃～100℃微煮沸热诱导下产生α-乳白蛋白和β-乳球蛋白与κ-酪蛋白胶束反应(15min)，冷却至常温后，添加0.15％κ-卡拉胶，产生絮凝反应，形成大分子蛋白-蛋白胶束与蛋白-多糖胶束。
70.(4)乳清蛋白的酶交联处理：
71.将初步改性得到的乳清蛋白胶束溶液中加入30u/g的tgase，放置于45℃的水浴锅中反应4h，取出后立即放置于冰水中顿酶。
72.(5)改性乳清蛋白的成品：
73.将灭酶后的乳清蛋白冷冻干燥，得到改性乳清蛋白成品。
74.实施例3
75.一种蛋白胶束协同酶交联处理提高乳清蛋白乳化特性的方法，包含如下步骤：
76.(1)乳清蛋白的水化：
77.将乳清蛋白溶解于去离子水中，配置成干物质含量为15％(w/w)的乳清蛋白水合物，磁力搅拌2h使其完全溶解后，放置于4℃冰箱中过夜以充分水化。
78.(2)乳清蛋白适度酶解：
79.在乳清蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶(400u/g)进行适度酶解3h。将上述适度酶解后的乳清蛋白溶液进行100℃灭酶和乳清蛋白变性；
80.(3)乳清蛋白胶束复合物制备：
81.向完全水化的乳清蛋白溶液中添加酪蛋白(乳清蛋白:酪蛋白为1:0.1)，在90℃～100℃微煮沸热诱导下产生α-乳白蛋白和β-乳球蛋白与κ-酪蛋白胶束反应(5min)，冷却至常温后，添加0.15％κ-卡拉胶，产生絮凝反应，形成大分子蛋白-蛋白胶束与蛋白-多糖胶束。
82.(4)乳清蛋白的酶交联处理：
83.将初步改性得到的乳清蛋白胶束溶液中加入40u/g的tgase，放置于45℃的水浴锅中反应4h，取出后立即放置于冰水中顿酶。
84.(6)改性乳清蛋白的成品：
85.将灭酶后的乳清蛋白冷冻干燥，得到改性乳清蛋白成品。
86.乳化活性指数和乳化稳定指数的测定：
87.将上述制备得到的乳清蛋白用去离子水复溶为10mg/ml的乳清蛋白溶液，与玉米油以3：1(v/v)的比例混合，用高速剪切机以13,500rpm的速度剪切1分钟。分别于0min和10min从底部取出液体0.1ml，用0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(1：40，v/v)稀释，在500nm处测定吸光度。
88.乳化活性指数(eai)(m2/g)定义为：
[0089][0090]
其中：a0表示0min时的吸光值，c表示蛋白溶液浓度(g/ml)，为油相体积分数，d为稀释因子。
[0091]
乳化稳定指数(esi)(％)定义为：
[0092][0093]
其中，a0和a
10
分别为0min和10min时的吸光值。
[0094]
表面疏水性(h0)测定
[0095]
采用1-苯胺萘-8-磺酸盐(ans)荧光法测定蛋白的表面疏水性。样本稀释(0.1mg/ml,0.2mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,and 2mg/ml用1％醋酸溶液ph值为4)。然后20μl ans(20ml,8.0mm在磷酸缓冲溶液(0.2m,ph值7.5))混合4ml样品。用荧光光谱仪在波长380nm(激发)和470nm(发射)处测量复合物的荧光强度。根据样品浓度的荧光强度曲线的初始斜率计算表面疏水性(h0)。
[0096]
结果：图1中表示出经过不同压力和次数超高压微射流处理后的eai。图2中表示出经过不同压力和次数超高压微射流处理后的esi。图3中表示出经过不同压力和次数超高压
微射流处理后的h0。经过微射流和tgase处理后乳清蛋白的eai、esi和h0都明显高于未经处理的乳清蛋白和只经过tgase处理的乳清蛋白。
[0097]
实施例1中木瓜蛋白酶添加量300u/g、κ-卡拉胶添加量0.1％、tgase添加量30u/g的处理后，改性后乳清蛋白的eai值为6.31，相比未经处理的乳清蛋白增加了36.12％；esi值从35.5％上升至50.34％，上升了41.81％；h0值升高至120.64，与wpc和tg-wpc相比分别增加了40.27％和16.58％。
[0098]
实施例2中木瓜蛋白酶添加量400u/g、κ-卡拉胶添加量0.15％、tgase添加量30u/g的处理后，改性后乳清蛋白的eai值为6.57，相比未经处理的乳清蛋白增加了41.68％；esi值从35.5％上升至54.62％，上升了53.861％；h0值升高至125.15，与wpc和tg-wpc相比分别增加了45.24％和20.26％。
[0099]
实施例3中木瓜蛋白酶添加量400u/g、κ-卡拉胶添加量0.15％、tgase添加量40u/g的处理后，改性后乳清蛋白的eai值为6.78，相比未经处理的乳清蛋白增加了46.13％；esi值从35.5％上升至56.21％，上升了58.36％；h0值升高至127.31，与wpc和tg-wpc相比分别增加了47.74％和22.34％。
[0100]
实施例4
[0101]
一种协同处理后的乳清蛋白提高其纳米乳液热稳定性的应用，包含如下步骤：
[0102]
(1)乳清蛋白水相制备：取协同处理后得到的乳清蛋白2g分散于93ml的去离子水中，常温下搅拌制备成的乳清蛋白溶液，完全溶解后待用；
[0103]
(2)玉米油油相制备：称取5g玉米油，隔水预热后，加入0.05g单甘酯，使其完全溶解，并且油温保持在60℃左右；
[0104]
(3)乳液制备：将乳清蛋白溶液水相和玉米油油相混合，高速剪切机5000rpm处理2min得到粗乳液，再经过微射流均质处理，均质处理条件为30mpa，均质两次，得到乳液；
[0105]
(4)灭菌：将制备好的乳液封装到瓶中，放入灭菌锅中121℃、15min灭菌。
[0106]
实施例5
[0107]
一种协同处理后的乳清蛋白提高其纳米乳液热稳定性的应用，包含如下步骤：
[0108]
(1)乳清蛋白水相制备：取协同处理后得到的乳清蛋白5g分散于90ml的去离子水中，常温下搅拌制备成的乳清蛋白溶液，完全溶解后待用；
[0109]
(2)玉米油油相制备：称取5g玉米油，隔水预热后，加入0.05g单甘酯，使其完全溶解，并且油温保持在60℃左右；
[0110]
(3)乳液制备：将乳清蛋白溶液水相和玉米油油相混合，高速剪切机5000rpm处理2min得到粗乳液，再经过微射流均质处理，均质处理条件为30mpa，均质两次，得到乳液；
[0111]
(4)灭菌：将制备好的乳液封装到瓶中，放入灭菌锅中121℃、15min灭菌。
[0112]
实施例6
[0113]
一种协同处理后的乳清蛋白提高其纳米乳液热稳定性的应用，包含如下步骤：
[0114]
(1)乳清蛋白水相制备：取协同处理后得到的乳清蛋白5g分散于85ml的去离子水中，常温下搅拌制备成的乳清蛋白溶液，完全溶解后待用；
[0115]
(2)玉米油油相制备：称取10g玉米油，隔水预热后，加入0.1g单甘酯，使其完全溶解，并且油温保持在60℃左右；
[0116]
(3)乳液制备：将乳清蛋白溶液水相和玉米油油相混合，高速剪切机5000rpm处理
2min得到粗乳液，再经过微射流均质处理，均质处理条件为35mpa，均质两次，得到乳液；
[0117]
(4)灭菌：将制备好的乳液封装到瓶中，放入灭菌锅中121℃、15min灭菌。
[0118]
粒径测定：
[0119]
乳液的粒度通过专用粒度分析仪测量。分散相的折射率为1.460，连续相的折射率为1.330。用pbs缓冲液将乳液稀释1000倍。
[0120]
结果：
[0121]
图4中表示出经过不同比例的改性乳清蛋白纳米乳液在高温灭菌后稳定，且在储藏半年后仍保持稳定状态。图5中表示不同蛋白添加量制备乳液在高温灭菌及储藏180d后的平均粒径。
[0122]
不同比例的改性乳清蛋白纳米乳液在高温灭菌后都为稳定状态，且没有出现水油分层的现象。由平均粒径可知，当乳清蛋白溶液水相与玉米油油相的比例增加时，粒径会一定程度上有所增加，但仍然保持稳定。同时在经过180d后乳液平均粒径均有不同程度的变高，未改性乳清蛋白纳米乳液粒径增大为原来的3.5倍，增大程度最大；实施例4变化程度小，仅增大了44.6％，乳液相对更加稳定。通过实施例之间的比较，当改性蛋白的添加量仅为2％时，即可使纳米乳液在高温灭菌后保持180天稳定且不分层。