一种用于生产PD-1抗体的CHO细胞高效灌流补料培养方法与流程

本发明涉及生物制药及生物工程领域，具体涉及抗体药生产的细胞培养，尤其是涉及一种用于生产pd-1抗体的cho细胞灌流补料培养方法。

背景技术：

1、自上世纪70年代，随着dna重组技术和单克隆抗体技术的出现，推动着生物制药领域的迅速发展。从1986年第一个治疗性抗体——抗cd3单抗okt3进入市场以来，已有百余种治疗性抗体药获得fda批准，成为现代生物医药的重要组成部分，广泛用于恶性肿瘤、免疫性疾病、遗传缺陷疾病、病毒性疾病等方面的治疗。

2、程序死亡受体1(programmed death-1)是免疫检查点蛋白之一，属于免疫球蛋白超家族cd28家族成员。其在限制t细胞活性中发挥着重要作用，活化的t细胞表面的pd-1与在肿瘤细胞表面的pd-l1相互作用，对免疫应答起负调节并减弱抗肿瘤免疫力。目前，已有针对pd-1靶点的多种抗体类药物获批上市。

3、cho细胞因其能够快速、高水平的表达多种重组蛋白，使用悬浮培养工艺易于放大培养，在生物制药领域中被广泛应用于生产治疗型蛋白。常用的cho细胞培养方式包括批次培养、补料分批培养和连续培养(灌流培养)。其中，灌流培养通过不断更换新鲜培养基，及时去除培养环境中的代谢废弃物如乳酸、铵离子等，能维持较高密度和活率的细胞生长，延长了细胞的培养时间，并且大幅提高了蛋白产量、确保了良好的产品一致性。因此，该方法在生产上越来越受重视和推广。

4、目前，典型的连续灌流培养方式是采用截留装置将细胞分泌的产物在培养期间被保留在生物反应器内或被收获。这种灌流培养工艺一方面需要消耗大量培养基，大大增加了生产成本；另一方面细胞截留装置长时间运行也会增加截留膜孔堵塞的概率，导致蛋白损失和质量下降。因此，需要对连续灌流培养工艺进一步优化，在实现细胞高密度、高活率、高产量的同时，降低生产成本，提高产品质量。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于生产pd-1抗体的cho细胞高效灌流补料培养方法，通过优化培养基、溶氧设置、温度设置等，使得细胞培养过程中营养充分、传质均匀、代谢废物减少，降低了生产能耗，有效地改善了抗体产品的电荷异质性，显著增加了抗体的表达量，方法具有极广的适应性。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于生产pd-1抗体的cho细胞高效灌流补料培养方法，包括如下步骤：

3、(1)在细胞培养容器中加入基础培养基，接种表达pd-1单克隆抗体的cho细胞后进行培养；其中，所述表达pd-1单克隆抗体的cho细胞可通过如下方法获得：宿主细胞cho-k1购自atcc(no.ccl61)，编码pd-1抗体的轻、重链基因见专利cn106432494a，构建携带抗体轻、重链基因的表达载体pcdna3.1-lc-g418和pcdna3.1-hc-zeocin转染cho-k1细胞。将转染24h后的细胞用选择性培养基(500ug/ml g418+400ug/ml zeocin)筛选以获得迷你细胞群。迷你细胞群恢复后利用流式分选技术进行克隆筛选，通过摇管分批补料实验进行克隆评估后挑选表达量最高、抗体质量最佳的克隆用于上游细胞培养工艺，将该克隆命名为clone1。

4、(2)培养过程中，当细胞培养至活细胞密度为50×106cells/ml～75×106cells/ml时，同时离线ph值≤6.95时，降低培养温度和溶氧值；同时在第2天至第6天采用细胞截留装置利用灌流培养基进行灌流补料培养，所述灌流培养基包括基础培养基、第一补料培养基和第二补料培养基，在第7天、第9天、第11天和第13天分别同时流加第一补料培养基和第二补料培养基进行流加培养；基础培养基、第一补料培养基和第二补料培养基以不同的速率补充到细胞培养容器中，通过细胞截留装置排出废弃培养基，将细胞和蛋白产物保留在生物反应器内，培养过程中维持葡萄糖浓度在3g/l～6g/l；

5、其中，所述基础培养基为hycell cho培养基，所述hycell cho培养基中添加如下组分：4mm谷氨酰胺、1％v/v ht添加剂、0.7g/l cb5、1g/l泊洛沙姆188和0.1mg/lcuso4·5h2o，记为：hycell cho+4mm谷氨酰胺+1％v/v次黄嘌呤钠盐/核苷(ht)+0.7g/l cb5+1g/l泊洛沙姆188+0.1mg/l cuso4·5h2o；所述第一补料培养基为cb7a，第二补料培养基为cb7b。

6、其中，灌流补料培养中，在第2天至第6天，基础培养基按照0.2～1.0vvd速率进行灌流；第一补料培养基按照0.02～0.10vvd速率进行灌流；第二补料培养基按照0.002～0.01vvd速率进行灌流。优选的，灌流补料培养中，在第2天至第6天，基础培养基按照0.2～0.8vvd阶梯递增的速率进行灌流；第一补料培养基按照0.02～0.08vvd速率进行灌流；第二补料培养基按照0.002～0.008vvd速率进行灌流。

7、在一种优选的实施方式中，第2天和第3天，基础培养基按照0.4vvd速率进行灌流，第一补料培养基按照0.04vvd速率进行灌流；第二补料培养基按照0.004vvd速率进行灌流；第4天和第5天，基础培养基按照0.6vvd速率进行灌流，第一补料培养基按照0.06vvd速率进行灌流；第二补料培养基按照0.006vvd速率进行灌流；第6天，基础培养基按照0.8vvd速率进行灌流，第一补料培养基按照0.08v速率进行灌流，第二补料培养基按照0.008vvd速率进行灌流。

8、在流加培养中，以初始培养体积的3～7％在第7天、第9天、第11天和第13天流加第一补料培养基，以初始培养体积的0.3～0.7％在第7天，第9天，第11天和第13天流加第二补料培养基。上述初始培养体积的含义为初始培养时整个培养基的体积。

9、优选地，在流加培养中，以5％培养体积的比例在第7天，第9天，第11天和第13天流加第一补料培养基，以0.5％培养体积的比例在第7天，第9天，第11天和第13天流加第二补料培养基。

10、在本发明的一些实施方式中，在活细胞密度达到峰值前降低细胞培养温度，诱导cho细胞停留在g1/g0期，从而促进抗体蛋白的表达，同时抑制cho细胞有丝分裂，抑制细胞过度生长。步骤(2)中，培养温度降低至30-34℃，溶氧值(do)由初始的do≥15％，设定值40％，调整为do≥10％，设定值20％。

11、优选地，细胞培养容器转速在第0天到第5天为200～260rpm，第6天后调整为300-320rpm。

12、在本发明的一些实施方式中，通过具有中空纤维过滤器的细胞截留系统将细胞和产物保留在生物反应罐内。在一些实施方式中，具有中空纤维过滤器的截留系统是交替切向流(atf)装置。在一些实施方式中，该中空纤维过滤器的膜孔径为约50kd。

13、优选地，培养至第14天或当细胞活率低于60％时结束培养，收获上清液并检测抗体表达量及质量。

14、其中，步骤(1)中，细胞接种量为1.3～1.9×106cells/ml，细胞培养容器初始温度35.0～37.0℃，ph值6.80-7.00，死区值0.25～0.35，表通空气0～1.0lpm，底通空气0～0.5lpm，底通氧气关联至do，底通二氧化碳关联至ph值。

15、有益效果：本发明通过筛选了一种适用于pd-1抗体生产的培养基配方并优化了do设置，有助于降低生产能耗；同时本发明的抗体生产方法显著增加了抗体产量，并提高了抗体质量。在优选的实施方案中，酸性峰含量降至23.1％，抗体表达量提高至5.98g/l，为pd-1抗体在生产过程中产品质量和产量的提升提供一种非常简便、有效、稳定的方法。