一种具有高分子量芳香烃类化合物降解功能的嗜脂环物菌T452及其应用

一种具有高分子量芳香烃类化合物降解功能的嗜脂环物菌t452及其应用
技术领域：
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种在好氧或厌氧条件下具有高分子量芳香烃类化合物降解功能的嗜脂环物菌t452及其应用。


背景技术：

2.芳香烃类化合物(aromatic hydrocarbons)在环境介质中普遍存在，其中许多种类都属于持久性有机污染物，如多环芳烃、卤代芳烃和杂环芳烃等。这些有机污染物多数具有生物毒性，一些甚至具有致畸、致癌和致突变的效应，对人类健康和生态环境具有极大的危害。微生物降解作用是芳香烃类化合物污染修复的重要途径，降解功能菌种的获得及其降解机制的阐明是污染治理和生态修复等领域的迫切需求。
3.目前已经在环境中发现了许多具有芳香烃类化合物降解能力的微生物，这些微生物能利用氧气或者在厌氧条件下利用硝酸盐、硫酸盐和三价铁等为电子受体，驱动芳香烃类化合物的降解转化。但是，由于多数芳香烃类化合物，尤其是多环芳烃、卤代芳烃和杂环芳烃等分子量高、结构稳定的持久性有机污染物降解过程缓慢，很难通过常规的富集培养方法获得降解菌。目前，相关降解功能微生物的报道甚少。例如，已报道的在厌氧条件下降解典型高环芳烃类污染物苯并(a)芘的微生物仅4株。这不仅影响了对这些高分子量芳香烃类化合物微生物降解机制的科学认知，更是极大限制了这类毒害有机物的有效治理。因此，具有高分子量芳香烃类化合物降解功能微生物菌种资源的获取对相关降解机制的科学认知及相关污染物的有效治理具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种具有在好氧、厌氧或者硝酸盐还原条件下具有高分子量芳香烃类化合物降解能力的嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452。该菌株于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no：63025。
5.本发明的第二个目的是提供了一种嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452在去除高分子量芳香烃类化合物中的应用。
6.优选，嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452在净化受污染空气、水体、沉积物或土壤中高分子量芳香烃类化合物的应用。
7.研究发现，在某曾受芳香烃类化合物污染的珠三角河流沉积物中，存在着一定丰度的嗜脂环物菌。本发明通过对广东佛山容桂某曾受芳香烃类化合物污染的河床底泥进行富集培养、分离和纯化得到菌株t452，位于嗜脂环物菌属，命名为嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452。
8.本发明人在曾经受芳香烃类化合物污染的河道沉积物中分离获得了一株能在好氧和厌氧条件下降解高分子量芳香烃类化合物的菌株t452，位于嗜脂环物菌属
(alicycliphilus)。嗜脂环物菌是具有广泛的异生物质降解能力的一类细菌，已有研究报道了该类细菌对苯、甲苯和萘等几种低分子量芳香烃污染物的降解功能。本发明通过分析该菌株对高分子量多环芳烃的降解能力，重点阐明了该菌株对典型高环芳烃类污染物苯并(a)芘的降解动力学和降解途径，并且通过基因组分析揭示了该菌具有广泛的芳香烃类化合物的降解能力，建立了利用该菌株强化去除高分子量芳香烃类化合物的方法，为受污染的空气、水体、沉积物和土壤的净化提供技术支撑。
9.本发明的嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452为在好氧或者硝酸盐还原条件下具有高分子量芳香烃类化合物降解的能力，能去除空气、水体、沉积物和土壤中的高分子量芳香烃类化合物，为空气净化、河道修复、废水处理和土壤治理提供了微生物菌种资源及其强化治理方法。
10.alicycliphilus sp.t452，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no：63025。
附图说明：
11.图1是实施例1中嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452的物种亲缘关系图；
12.图2是实施例1中嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452的透射电镜图；
13.图3是实施例4中嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452的苯并(a)芘降解动力图；
14.图4是实施例6中嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452的芳香烃类化合物降解途径。
具体实施方式：
15.下面结合附图，进一步通过实施例对本发明的一种具有芳香烃类化合物降解功能的嗜脂环物菌t452及其应用进行详细说明。本发明不限于以下实施例的描述。
16.实施例1：嗜脂环物菌t452的分类和生理特征鉴定
17.菌株t452分离于广东省佛山容桂某河道沉积物。使用r2a固体培养基对菌株t452进行培养，形成菌落后使用通用引物27f(agagtttgat cctggctcag)和1492r(tacgacttaa ccccaatcgc)对菌株t452的16s rrna基因进行pcr扩增和测序，测序结果经过拼接后获得近完整的16s rrna基因序列，结果如seq id no.1所示。与ncbi的genbank数据库中的16s rrna序列进行比对，获取同源性较高的近缘菌株的序列，并在mega5上构建系统发育树，确定菌株t452的分类地位。使用透射电子显微镜对菌株t452进行形态观察。使用biolog gen iii对菌株t452的碳源利用能力进行测定。使用r2a液体培养基对菌株t452的生长ph(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10)、温度(4、10、15、20、25、30、35、40、43)和盐度(硫化钠等量，0％、1％、2％、3％、4％、5％、10％)进行测定。
18.结果显示，菌株t452的16s rrna基因序列与alicycliphilus denitrificans k601
t
的相似度最高(98.7％)，并且在进化树中与嗜脂环物菌属邻接(图1)。说明菌株t452系属于嗜脂环物菌属的一个物种。菌株t452在r2a固体培养基上培养3天后形成1-2mm的透明菌落，呈圆形，突起，表面光滑，边缘整齐的形态。通过透射电镜观察发现，菌体1.0～1.8μ
m长，0.5～0.7μm宽，有单一鞭毛(图2)。生长温度范围为20～40℃，生长ph范围为6.0～9.0，耐盐度最高达2％。利用的碳源包括乳酸、甘油、d果糖-6-磷酸、l-丙氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-焦谷氨酸、l-丝氨酸、l-半乳糖醛酸内酯、d-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、糖质酸、甲基丙酮酸、柠檬酸、α-酮-戊二酸、d-苹果酸、l-苹果酸、α-羟基-丁酸、羟基丁酸、吐温40、α-酮-丁酸、丙酸和乙酸。
19.经过形态学、生理生化和分子分类学的鉴定表明，菌株t452系属于alicycliphilus属的物种，并命名为嗜脂环物菌(alicycliphilus sp.)t452，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no：63025。
20.实施例2：嗜脂环物菌t452对多环芳烃的降解特征
21.将嗜脂环物菌t452在r2a上进行活化，按od
600
为0.01接种到含有10g/l硝酸钾的r2a液体培养基中，180rpm厌氧培养到od
600
为0.4时(1天)，分别加入500μg/l芘、苯并(a)蒽和苯并(a)芘，再培养2天后，萃取和用uplc测定各多环芳烃的降解率。设无菌对照组，加入含有10g/l硝酸钾的r2a液体培养基，以及500μg/l的芘、苯并(a)蒽和苯并(a)芘，不接种嗜脂环物菌t452，180rpm厌氧放置2天后，测定各多环芳烃的浓度。
22.结果显示：无菌对照组的多环芳烃无明显的下降，而接种菌株t452的处理组，包括芘、苯并(a)蒽和苯并(a)芘分别降低了约60％、62％和56％。说明菌株t452具有芘、苯并(a)蒽和苯并(a)芘等高分子量多环芳烃的降解能力。
23.实施例3：好氧和硝酸盐还原条件下嗜脂环物菌t452对苯并(a)芘的降解特征
24.将嗜脂环物菌t452在r2a上进行活化，按od
600
为0.01接种到含有10g/l硝酸钾的r2a液体培养基中，180rpm厌氧培养到od
600
为0.2时(约18小时)，8000g离心收集菌体，用m9无机盐培养基洗涤后，按照od
600
为0.25接种到含有2mg/l苯并(a)芘和2g/l硝酸钾的m9无机盐培养基中，设厌氧和好氧两种条件进行培养。各实验处理组设3个重复，设置灭菌对照组各三个重复。在第0、4天取样测定苯并(a)芘浓度的变化。
25.结果显示，菌株在好氧条件下苯并芘降解率约为38％，而硝酸盐还原条件下的降解率约为62％。说明菌株t452在好氧和硝酸盐还原条件下都具有苯并(a)芘的降解能力，并且厌氧的硝酸盐还原条件下的效率更高。
26.实施例4：硝酸盐还原条件下嗜脂环物菌t452对苯并(a)芘的降解动力学特征
27.将嗜脂环物菌t452在r2a上进行活化，按od
600
为0.01接种到含有5g/l硝酸钾的r2a液体培养基中，加入1mg/l苯并(a)芘，并设置灭菌对照组。分别在0、4、8、12、24、48、72、96小时测定苯并(a)芘的降解率以及od
600
和硝酸盐浓度的变化。
28.结果如图3所示，菌株t452在生长的同时，硝酸盐出现了明显的下降(图3a)，说明该菌利用硝酸盐为电子受体进行生长繁殖。而添加的约1mg/l的苯并(a)芘也随着菌株厌氧生长的过程逐渐降解去除(图3b)，最终在100小时降解率达到40.6％，与对照组存在显著差异(p《0.01)。
29.实施例5：好氧条件下嗜脂环物菌t452对四溴双酚a的降解特征
30.将嗜脂环物菌t452在r2a上进行活化，按od
600
为0.2接种到含有10mg/l四溴双酚a的m9无机盐培养基中，设3个重复，设置灭菌对照组。在第0和7天取样测定四溴双酚a浓度的变化。
31.结果显示，灭菌对照组的四溴双酚a降低了12.9％，而添加嗜脂环物菌t452的处理组四溴双酚a降低了42.3％，显著低于灭菌对照组(p《0.01)，说明嗜脂环物菌t452具有较高的四溴双酚a降解能力。
32.实施例6：基因组分析揭示嗜脂环物菌t452降解芳香烃类化合物的途径
33.提取嗜脂环物菌t452的总dna，通过二代测序方法测定其基因组框架图，下机数据通过spades v3.13.1软件进行组装，prodigal v2.6.3和eggnog-mapper分别进行基因的预测和注释，并在kegg-mapper进行代谢途径重构。
34.结果显示，菌株t452的基因组上存在大量芳香烃类化合物降解相关的基因(图4)，如苯和苯酚等通过儿茶酚降解途径进入tca循环而测底降解(图4a)；3-氯儿茶酚、3-氟儿茶酚等的降解途径(图4b、4c)；以及甲苯、甲基苯酚和3-甲基儿茶酚等测底降解的途径(图4d)。
35.seq id no.1
36.[0037][0038]