双峰驼乳脂率相关基因CARD11及其作为分子标记的应用

本发明属于生物，尤其是涉及双峰驼乳脂率相关基因card11及其作为分子标记的应用。

背景技术：

1、双峰驼乳营养成分多、胰岛素含量高、易消化吸收而深受销费者喜爱，在国内外市场上供不应求。但是我国双峰驼品种原始，未进行过乳用性驼的定向选育，平均产乳水平较低，日产乳量仅1kg/峰左右，而个别驼日产量可达6kg以上，个体间差异极大，选育提高产乳量的空间很大。但有关双峰驼产奶性状相关基因研究报道较少，而利用现代生物分子标记技辅助双峰驼育种提高产奶性能的技术尚未见报道。目前乳用性状分子水平上的研究多集中在牛、羊上，而双峰驼乳用性能的研究则主要集中于表型数据的收集与整理及初期泌乳规律和泌乳特性的分析上。因此，亟待进一步从分子遗传水平深入研究双峰驼泌乳机制及调控机理，是加快双峰驼乳用性能提高的主要途径之一。双峰驼是内蒙古特色畜种资源，双峰驼役用的作用已经大大减弱，正在由传统的单一的生产方式向生产专门化、商品化的方向转变。驼产品行业的兴起意味着传统养驼业逐渐退出舞台。驼产品主要包括：驼乳、驼肉、驼皮、驼骨等。驼乳是其中重要一个组成部分，驼乳因有益于身体健康而深受消费者欢迎，在市场上供不应求的乳品。乳脂率，乳中脂肪含量的百分率，是评定乳质和乳畜生产力的重要指标之一。因此，如何提高产乳量直接关系着驼乳产业的发展，对牧区农牧民增收以及社会稳定具有重要意义。传统的育种方式主要是利用表型信息和系谱信息进行杂交选育，对遗传力低和测量复杂的性状，存在测定成本高、时间长、育种过程复杂的问题。随着高通量测序技术、生物信息学及统计学方法的快速发展，全基因组关联分析(genome wideassociation study,gwas)已成为禽畜重要性状主效基因挖掘与鉴定的主要手段。

技术实现思路

1、基于现有技术中缺少从分子遗传水平深入研究双峰驼泌乳机制及调控机理的现状，本发明提供一种双峰驼产奶性状相关基因card11及其作为分子标记的应用。

2、本发明将选择的分子标记应用于筛选出乳脂率高/低的双峰驼，为选育具有优良性状的双峰驼品种提供技术支撑。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

4、本发明首先提供一种双峰驼产奶性状相关基因card11作为与双峰驼产奶性状相关的分子遗传标记的应用。

5、进一步地，所述产奶性状具体是指双峰驼乳脂率。

6、进一步地，提供一种与双峰驼乳脂率相关的snp分子标记，位于双峰驼18号染色体9786961处核酸位点，该位点的碱基为c或t，包含在card11基因内含子内，其中，card11基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、本发明进一步提供所述snp分子标记进行选育或辅助选育双峰驼泌乳相关品种或品系的方法，具体是选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼。

8、进一步地，基于所述snp分子标记选育或辅助选育乳脂率高/低的双峰驼详细步骤为：采集双峰驼组织样或血液样本，提取双峰驼基因组dna，检测双峰驼的第18号染色体9786961核苷酸的序列为c或t，确定待测双峰驼的基因型是cc、ct或tt型，根据需要选择tt基因型或者cc基因型的双峰驼进行下一步选种和/或育种。

9、进一步说明，所述tt基因型双峰驼乳脂率高于ct型双峰驼，ct基因型双峰驼乳脂率则高于cc基因型双峰驼。

10、本发明还提供一种鉴定如上所述snp分子标记的方法，具体步骤为：

11、1)记录产奶性状：

12、采集并获取双峰驼产奶性状，记录其乳脂率及其影响因素，包括群体、年份、胎次、年龄、饲养方式、采样日期等；

13、2)获取双峰驼样本：

14、采取对应双峰驼耳部组织样本，收集于离心管中，加入无水乙醇浸没样品，密封编号后于-80℃保存备用；

15、3)基因组dna提取：

16、按照动物组织样dna提取试剂盒说明书的流程，提取骆驼基因组dna样品，使用nanodrop 2000检测dna样品的浓度和质量，并采用琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性；

17、4)基因组重测序：

18、采用illumina公司标准建库流程制备测序文库，用hiseq测序平台进行双峰驼基因组重测序，测序深度为4x；

19、5)检测变异位点：

20、用plink软件对测得的原始文库数据进行过滤处理，以减少碱基错误对结果造成的影响，过滤标准如下：(1)去除带接头的序列；(2)去除无法确定碱基信息的序列；(3)当单端序列含有质量低于5，需要去除此对序列；(4)仅保留双端序列；

21、6)全基因组关联分析：

22、采用vcftools软件对变异中的snp根据群体变异分布进行过滤，过滤阈值包括：(1)次要等位基因数量大于3；(2)snp缺失率超过5％；(3)snp质量大于30；(4)最小测序深度5；(5)最小等位频率低于0.05；最后，通过过滤的snp用于全基因组关联分析，应用rmvp软件，利用一般线性模型(glm)、混合线性模型(mlm)、固定和随机模型循环概率统一方法(farmcpu)进行全基因组关联分析，鉴定影响产奶性状的关键候选基因及位点。

23、进一步地，步骤5)检测变异位点时，具体方法为：

24、使用bwa-mem软件将基因组序列比对到骆驼参考基因组(bcgsac_cfer_1.0assembly)上，采用samtools软件对比对结果进行排序和建立索引；然后，使用gatk软件进行下游分析：首先，使用gatk markduplicates去除因pcr造成的序列重复；随后，使用gatk haplotypecaller对全基因组范围内的变异进行检索；最后，使用gatkvariantfiltration对变异位点进行硬过滤；其中，snp过滤的阈值设为“qd<2.0，mq<40.0，fs>60.0，sor>3.0，mqranksum<-12.5，readposranksum<-8.0”，indel过滤的阈值设为“qd<2.0，fs>200.0，sor>10.0，mqranksum<-12.5，readposranksum<-8.0”。

25、本发明还进一步提供一种双峰驼选育方法，包括如下步骤：

26、检测供试双峰驼基于snp分子标记的基因型，根据基因型选育双峰驼，所述双峰驼的第18号染色体9786961核苷酸的序列为c或t，确定待测双峰驼的基因型是cc、ct或tt型，所述tt基因型双峰驼乳脂率高于ct型双峰驼，ct基因型双峰驼乳脂率则高于cc基因型双峰驼。

27、本发明公开了与双峰驼产奶性状相关的基因card11，以及利用其单核苷酸多态性位点(snp)作为分子标记进行辅助选择的育种方法与应用。本发明首次研究发现了card11基因与双峰驼泌乳性状中乳脂率高/低相关的位点，为选育具有优良性状的双峰驼品种，改善驼奶乳品质提供候选基因。

28、具体地，本发明利用二代测序技术对162头双峰驼进行基因组重测序，通过与骆驼乳脂率性状进行全基因组关联分析，鉴定出card11基因中与双峰驼乳脂率相关的分子标记。该标记位于18号染色体9786961bp位点，发生c>t单碱基突变(g.9786961c>t)，该突变位点可以提高驼奶的乳脂率，利用该标记能针对双峰驼的驼乳脂率性状开展分子标记辅助选择。

29、其中，card11基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

30、18号染色体9786961bp位点具体信息如下：

31、>18:9786861-9787061

32、cagggcaggaggaggggccgcccccaccctgagcatcggtcctgcagg

33、agcagacgcgcctgcccgggcc

34、ccttctcgtcaggtggcgcctctcctgcagcgggggtcactaggcagtg

35、agtctgtcggggacaccctgc

36、aggggattcccgcttcacatacaaggctggactggacgaaatttccttctggctctaagag。

37、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

38、本发明首次研究发现了card11基因与双峰驼泌乳中的乳脂率高低相关联的位点，为选育具有优良性状的双峰驼品种提供有效的候选基因。同时，本发明利用标记-性状关联分析方法鉴定出card11基因中，一个snp(g.9786961c>t)与双峰驼乳脂率显著相关。该位点可应用于双峰驼产奶性状相关的关联分析中，为双峰驼高/低乳脂率的分子标记辅助选择提供了新的遗传标记资源。简而言之，本发发明采用了基于全基因组关联分析的方法进行双峰驼产奶相关基因的筛选与鉴定。针对鉴定出的候选基因，本发明进一步采用候选基因法策略判定所研究基因中是否存在与双峰驼产奶性状相关联的位点，从而进一步验证候选基因与泌乳性能的关系。此外，通过候选基因法，鉴定出的与产奶性状相关snp的位点可作为双峰驼优良性状选育的分子标记，有助于双峰驼产奶性能的遗传进展。本发明具有操作简便、耗时短、所选标记准确性高等特点，也为其他畜禽重要经济性状的遗传解析提供技术支撑。