一种靶向条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体、其制备方法及其应用与流程

本发明属于生物，涉及一种靶向条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体、其制备方法及其应用，所述的应用包括条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用，以及在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选的研究及质量检测方面的应用。

背景技术：

1、ignar是鲨鱼等软骨鱼类所独有的一种抗体，与骆驼等驼类所拥有的vhh抗体都属于纳米抗体的一种。vhh抗体免疫成熟的过程已经得到了广泛的研究，市场上商业化的vhh检测抗体比比皆是，无论是美洲驼还是骆驼，但凡是能够产生vhh抗体的骆驼科动物在免疫时都能在市场上找到适用的血清检测抗体。

2、而ignar抗体在软骨鱼类生物体内的免疫成熟过程尚不为人们所知，且ignar的结构也尚未被研究透彻，所以市面上仅有一两款针对护士鲨等的ignar检测抗体，而且这些抗体所针对的鱼类并不是条纹斑竹鲨。

3、相关文献表明(roux kh,greenberg as,greene l,strelets l,avila d,mckinney ec,flajnik mf.structural analysis of the nurse shark(new)antigenreceptor(nar):molecular convergence of nar and unusual mammalianimmunoglobulins.proc natl acad sci u s a.1998sep 29；95(20):11804-9.doi:10.1073/pnas.95.20.11804.)，在护士鲨中，ignar具有5个恒定结构域(ch1-ch5)，而在条纹斑竹鲨中，ch1结构域直接连接到ch4，出现ch2以及ch3结构的缺失。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种靶向条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体、其制备方法及其应用，所述的应用包括条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用，以及在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选的研究及质量检测方面的应用。

2、在不确定这些检测抗体是否能够用于条纹斑竹鲨的血清效价检测的情况下，发明人通过分析条纹斑竹鲨体内ignar抗体的ch1区序列，找到了其中的保守序列，合成短肽后与klh偶联并免疫新西兰大白兔产生针对该短肽的兔源多克隆抗体。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、在本发明的第一方面，提供了一种条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体。所述的多克隆抗体是用氨基酸序列如seq id no：1所示的合成多肽与klh耦联得到的免疫原免疫动物后得到。

5、在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

6、s1.制备合成多肽；所述多肽序列来源于条纹斑竹鲨ignar-ch1，为保守片段序列，其氨基酸序列如seq id no：1所示，多肽氨基酸序列为yscqvshsat；

7、s2.将步骤s1中制备的多肽与klh耦联，多肽与klh的重量比为1：1，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到ig nar多克隆抗体血清；

8、s3.对ig nar-ch1多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。

9、进一步地，

10、所述步骤s2中，得到ig nar多克隆抗体血清的具体过程为：

11、s21.初次免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，皮下注射入免疫动物体内；

12、s22.加强免疫：将免疫原与弗氏不完全佐剂混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，皮下注射入免疫动物体内，进行加强免疫若干次；

13、s23.最后一次免疫后，免疫动物颈动脉取血，收集得到靶向ignar-ch1的多克隆抗体血清。

14、更进一步地，

15、所述免疫原与弗氏完全佐剂以1：1等体积混合乳化，所述免疫原与弗氏不完全佐剂也以1：1等体积混合乳化；所述初次免疫的免疫剂量为1mg/只，所述加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只；初次免疫后进行2次加强免疫，间隔1周免疫1次，最后一次免疫7～10天后采用颈动脉取全血。

16、进一步地，所述步骤s2中，所述的免疫动物为新西兰大白兔。

17、进一步地，所述步骤s3中，亲和纯化的具体过程为：

18、s31.将亲和层析柱依次用纯水和ph7.4的1×pbs，流速70ml/h充分清洗，取待纯化的血清于离心管中，用0.45μm滤膜抽滤；

19、s32.将抽滤过的血清样品以40ml/h流速上样，重复一次；

20、s33.用ph7.4的1×pbs以70ml/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率的t档示数为100；

21、s34.调节蛋白检测仪吸光率的1a档示数为0，此时打开电脑桌面的hd-a电脑采集器，并将满屏量程调到5，用ph 2.7，0.2m的甘氨酸溶液以40ml/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体；在抗体收集过程中以1m的碳酸氢钠及时调节抗体的ph值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值；

22、s35.抗体收集完后，调节ph值至7左右，并记录洗脱的抗体体积；

23、s36.超滤浓缩，即得纯化好的多克隆抗体。

24、在本发明的第三方面，还提供了如第一方面所述条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体或第二方面所述方法制备的条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用。

25、检测鲨鱼血清效价的方法，包括如下步骤：

26、1)包板：用抗原稀释液将已知抗原稀释至1μg/ml，加入酶标板反应孔中，每孔50μl，4℃静置12小时，弃去抗原，用pbst洗3次，每孔200μl；

27、2)封闭：酶标板反应孔中加入1％ bsa，每孔150μl，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去封闭液；

28、3)一抗：酶标板反应孔中加入100μl抗原稀释液稀释过的血清(首孔8000倍稀释，后续依次4倍梯度稀释)，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去一抗，pbst洗3次，每孔200μl。

29、4)二抗：酶标板反应孔中加入100μl用1％bsa进行稀释的羊抗兔-hrp抗体(1:5000)，加入酶标板孔中，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去二抗，pbst洗3次，每孔200μl。

30、5)每孔加入100μl tmb显色液，室温反应8min。

31、6)终止：每孔加入100μl 1m硫酸溶液

32、7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据。

33、在本发明的第四方面，还提供了如第一方面所述条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体或第二方面所述方法制备的条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选等研究及质量检测方面的应用。

34、在本发明的第五方面，提供了一种合成多肽，序列来源于条纹斑竹鲨ignar-ch1，为保守片段序列，其氨基酸序列如seq id no：1所示，具体为yscqvshsat。

35、在本发明的第六方面，提供了如第四方面所述的合成多肽在制备条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体中的应用。

36、本发明具有如下技术效果：

37、1、本发明公开的条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体的制备方法，可制备出用于特异性识别条纹斑竹鲨ignar-ch1的多克隆抗体，且可用于条纹斑竹鲨血清效价的检测。

38、2、本发明提供的合成多肽，可用于制备条纹斑竹鲨ignar-ch1多克隆抗体。

39、另外，与现有技术(cn 114316069 a等)相比，本发明具有如下预料不到的技术效果：

40、1.本发明的免疫原中的多肽所选用目的序列为条纹斑竹鲨特征保守序列，(位于ch1区，因为条纹斑竹鲨ignar的ch2、ch3区的基因编码会出现剪切缺失，导致部分ignar无法被识别该区域的抗体识别。)。

41、2.本发明中，由于采用特定的免疫原加上独特的免疫策略，对实验兔的免疫周期更短，21-24天即可获得纯化抗体，同时获得较好的免疫效果，抗体效价在1:128万以上。本发明的免疫策略与现有技术的免疫策略不同，主要不同之处为：免疫周期不同，本发明在第1天初次免疫，第7、14天加强免疫，第21-24天取血清。每次免疫的抗原分成10份分别注射免疫动物背部皮下各点，达到最大特异性免疫反应效果，从而达到最大化获取特异性抗体的作用。现有技术中，有一种常规免疫方案是第一天初次免疫，后期每两周加强免疫一次，免疫4-5次，间隔过长；另有一种免疫方案，是第1、7、28天各免疫一次，第35天取血清。也比本发明的方案耗时长。另外本发明抗体效价本方案普遍达到128万以上，较现有技术高出不少。

42、3.本发明中，使用核酸蛋白检测仪进行亲和层析洗脱，所得抗体纯度及浓度更高。

43、4.本发明制备多克隆兔抗特异性好，与现有商品化抗ignar抗体相比，具有更好的特异性识别条纹斑竹鲨ignar的能力。本领域技术人员从图2中可清楚发现本发明的抗体的特异性更强。