一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向dya基因的sgrna组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。

背景技术：

1、crispr/cas9技术为目前最常用的基因编辑技术，此前所用的同源重组、zfn(锌指核酸酶)、tanlen(转录激活样效应核酸酶)等技术也可以实现目的基因的大片段精确敲除，但细胞内自然发生同源重组的效率极低。zfn、talen技术的设计繁琐，成本更高且效率较低，而crispr/cas9技术的基因编辑效率较高，并可以介导同源重组，相比于zfn和talen，cas9系统更具优势。利用crispr/cas9系统进行基因编辑时，需要首先根据基因组序列设计sg(single-guide，单链引导)序列，目标基因中一般可设计多个sg序列，但序列的位置碱基顺序会对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sg序列更容易获得目标基因编辑的细胞或受精卵，减少获得基因编辑细胞或动物个体的实验时间及成本。

2、dya(mhcclassiiantigendyalpha)基因即mhcii类抗原dyα。dya基因仅在反刍类动物淋巴组织，皮肤组织和脾脏等组织中表达，dya表达的蛋白主要位于树突状细胞表面，在免疫应答过程中发挥重要作用。dya在反刍动物中表达的特异性及其功能，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。现有报导中，没有针对绵羊dya基因进行编辑的报道，没有针对dya基因使用crispr/cas9系统实现编辑的实例。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向dya基因的sgrna组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。本发明提供的sgrna组可以利用crispr/cas9技术对绵羊dya基因进行编辑，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向dya基因的sgrna组，所述sgrna组包括exon1-sgrna和/或exon2-sgrna；

4、所述exon1-sgrna包括exon1-sgrna1和exon1-sgrna2；

5、所述exon1-sgrna1包括exon1-sgrna1-f和exon1-sgrna1-r；所述exon1-sgrna2包括exon1-sgrna2-f和exon1-sgrna2-r；

6、所述exon1-sgrna1-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述exon1-sgrna1-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；

7、所述exon1-sgrna2-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述exon1-sgrna2-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；

8、所述exon2-sgrna包括exon2-sgrna1和exon2-sgrna2，所述exon2-sgrna1包括exon2-sgrna1-f和exon2-sgrna1-r；所述exon2-sgrna2包括exon2-sgrna2-f和exon2-sgrna2-r；

9、所述exon2-sgrna1-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述exon2-sgrna1-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；

10、所述exon2-sgrna2-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述exon2-sgrna2-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。

11、本发明还提供了扩增上述方案所述sgrna组的靶标序列的引物对，所述引物对包括引物对1和/或引物对2；

12、所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；

13、所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示。

14、本发明还提供了一种敲除dya基因的质粒组，所述质粒组包括exon1-sgrna质粒组和/或exon2-sgrna质粒组；

15、所述exon1-sgrna质粒组包括exon1-sgrna1质粒和exon1-sgrna2质粒；所述exon1-sgrna1质粒包括权利要求1所述sgrna组中的exon1-sgrna1和px330质粒；所述exon1-sgrna2质粒包括权利要求1所述sgrna组中的exon1-sgrna2和px330质粒；

16、所述exon2-sgrna质粒组包括exon2-sgrna1质粒和exon2-sgrna2质粒；所述exon2-sgrna1质粒包括权利要求1所述sgrna组中的exon2-sgrna1和px330质粒；所述exon2-sgrna2质粒包括权利要求1所述sgrna组中的exon2-sgrna2和px330质粒。

17、优选的，所述px330质粒包括经bbsⅰ酶后的px330大片段质粒。

18、本发明还提供了上述方案所述sgrna组或上述方案所述的引物对或上述方案所述的质粒组在编辑dya基因中的应用。

19、优选的，所述dya基因包括绵羊的dya基因。

20、优选的，所述绵羊包括湖羊。

21、本发明还提供了上述方案所述sgrna组或上述方案所述的引物对或上述方案所述的质粒组在鉴定dya基因功能中的应用。

22、本发明还提供了一种编辑绵羊细胞中dya基因的方法，包括：将上述方案所述质粒组导入绵羊细胞中，得到基因编辑的绵羊细胞。

23、优选的，所述绵羊细胞包括绵羊成纤维细胞。

24、有益效果：

25、本发明提供了一种靶向dya基因的sgrna组，所述sgrna组包括exon1-sgrna和/或exon2-sgrna；所述exon1-sgrna包括exon1-sgrna1和exon1-sgrna2；所述exon1-sgrna1包括exon1-sgrna1-f和exon1-sgrna1-r；所述exon1-sgrna2包括exon1-sgrna2-f和exon1-sgrna2-r；所述exon1-sgrna1-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述exon1-sgrna1-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述exon1-sgrna2-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述exon1-sgrna2-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述exon2-sgrna包括exon2-sgrna1和exon2-sgrna2，所述exon2-sgrna1包括exon2-sgrna1-f和exon2-sgrna1-r；所述exon2-sgrna2包括exon2-sgrna2-f和exon2-sgrna2-r；所述exon2-sgrna1-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述exon2-sgrna1-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述exon2-sgrna2-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述exon2-sgrna2-r的核苷酸序列如seq idno.8所示。本发明针对dya基因的1号和2号外显子分别设计2个sg序列(即本发明中的sgrna组)，利用本发明设计的sgrna组，对绵羊dya基因进行编辑，发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对dya基因编码的蛋白质结构和功能造成较大破坏。通过在胎儿成纤维细胞中的转染和测序验证，证明在目标区域可造成不同片段长度的基因编辑，1号外显子总体编辑效率达到76.4％，2号外显子总体编辑效率达到84.09％。基因组中的两套染色体上均发生编辑(即纯合子)：1号外显子纯合子编辑效率为30.9％；2号外显子纯合子编辑效率为9.1％。本发明提供的sgrna组在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。