一种检测牛多瘤病毒的引物和探针组合及其应用的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测牛多瘤病毒的引物和探针组合及其应用。

背景技术：

1、牛多瘤病毒(bovine polyomavirus，bpyv)属于多瘤病毒科(polyomaviridae)，是一种无包膜的闭环双链dna病毒，目前已知有3种基因型。bpyv基因组大小约为4.7kb，病毒颗粒大小为40-45nm。bpyv最早在从被污染的猴肾细胞(macaque kidney cell)培养物中分离得到，一开始认为是一种内源性病毒，后来被证明其是一种来源于细胞培养过程中使用的牛血清中的外源性病毒。

2、bpyv在牛血清和牛肉中普遍存在，甚至城市污水和土壤中也能检测到，因此常用作牛排泄物环境污染的参数。全球70％批次的牛血清存在bpyv污染的风险。健康的牛在感染bpyv后一般不会产生疾病，在特殊情况下(如免疫力下降)可能会导致母牛流产以及肾脏病变的发生；有研究表明bpyv可能会导致牛出现神经系统疾病。目前还没有人类感染bpyv并致病的案例，但在与牛以及牛类制品存在密切接触的人群中，常常发现其bpyv血清阳性，提示其作为是一种人兽共患病病原的潜力。

3、因为牛血清在细胞培养以及生产过程中的使用相当普遍，并且bpyv可在mrc-5、mdbk、frhk-4、vero和ma104等多种细胞中复制增殖，所以bpyv对生物制品的生产存在极大的安全隐患，且多瘤病毒较强的灭活抗性加剧了此种担忧。《美国药典》中建议使用合适的方法检测用于生产人用生物制品的牛血清中的bpyv。

4、对于目前bpyv的核酸检测方面的专利较少，通过专利检索，检索到了一篇关于牛多瘤病毒核酸的液相芯片检测方法(cn110904272a)。该方法是使用病毒特异性的引物对病毒dna进行扩增，然后将pcr扩增产物纯化，与交联在微球上的含有对扩增产物特异性的荧光探针混匀，之后再经过一次pcr扩增反应，置于luminex 200液相芯片检测仪上读取荧光值，该方法为一种定性检测方案，难以进行定量检测。

5、目前对于bpyv的商业化检测方法不多，因此，建立一种快速便捷的方法检测bpyv污染具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测牛多瘤病毒的引物和探针组合及其应用。本发明针对bpyv 1型的vp1基因设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及高度覆盖性等优点的实时定量pcr法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种检测牛多瘤病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测牛多瘤病毒vp1基因的引物和探针组合；

4、所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；

5、所述正向引物的核苷酸序列包括seq id no:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括seq id no:2所示；

6、所述探针的核苷酸序列包括seq id no:3所示。

7、正向引物1(seq id no:1)：cctgttgagtgttggtgtcc；

8、反向引物1(seq id no:2)：cacaggtggagtgctaaca；

9、探针1(seq id no:3)：fam-aacaccagatacttcggaaca-bhq。

10、本发明中所述引物和探针组合对应的扩增检测区域是bpyv 1型基因组中非常保守的区域，因此，所述引物和探针组合能够检测出ncbi数据库中所有bpyv 1型病毒分离株的基因组dna，对于将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高。

11、优选地，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂。

12、优选地，所述荧光素选自fam、vic或hex任意一种。

13、优选地，所述淬灭剂选自mgb、bhq或tamra任意一种。

14、优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列如seq id no:4所示。

15、seq id no:4：

16、gataaactcagcaacaaatcccaggtgctagatcctaccctcaagggaattctagacaaagatggtgtgtatcctgttgagtgttggtgtccagatccaagtaaaaatgaaaacaccagatacttcggaacatatacaggaggtgttagcactccacctgtgctgcagttcacaaatactgtgacaaccattcttcttgatgagaatggcgtag。

17、第二方面，本发明提供一种检测牛多瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测牛多瘤病毒的引物和探针组合。

18、优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量pcr反应试剂。

19、优选地，所述病毒核酸标准品为包含seq id no:4所示核苷酸的质粒。

20、优选地，所述荧光定量pcr反应试剂包括酶液和反应缓冲液，所述酶液包括dna聚合酶。

21、第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测牛多瘤病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

22、(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系；

23、(2)对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量pcr反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线；

24、(3)根据病毒核酸标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。

25、优选地，所述荧光定量pcr体系按终浓度计包括：taqman universal master mix1×、800-900nm正向引物(例如可以是800nm、850nm或900nm等)、800-900nm反向引物(例如可以是800nm、850nm或900nm等)、220-250nm探针(例如可以是220nm、240nm或250nm等)。

26、优选地，所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12min；步骤2：94-96℃，13-17sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2min；步骤2和步骤3，40-42个循环。

27、其中，步骤1：94-96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，8-12min(例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等)；

28、步骤2：94-96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，13-17sec(例如可以是13sec、14sec、15sec、16sec或17sec等)；

29、步骤3：58-62℃(例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等)，0.8-1.2min(例如可以是0.8min、0.9min、1.0min、1.1min或1.2min等)；

30、步骤2和步骤3，40-42个循环(例如可以是40、41或42)。

31、第四方面，本发明提供一种检测牛多瘤病毒的方法，所述方法包括：

32、(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系，所述pcr体系包括第一方面所述的检测牛多瘤病毒的引物和探针组合；

33、(2)对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量pcr反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线；

34、(3)根据病毒核酸标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。

35、优选地，所述荧光定量pcr体系按终浓度计包括：taqman universal master mix1×、800-900nm正向引物、800-900nm反向引物、220-250nm探针。

36、优选地，所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12min；步骤2：94-96℃，13-17sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2min；步骤2和步骤3，40-42个循环。

37、第五方面，本发明提供一种检测牛多瘤病毒的系统，所述系统包括：

38、(1)样品制备模块：采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系，所述pcr体系包括第一方面所述的检测检测牛多瘤病毒的引物和探针组合；

39、(2)检测模块：对荧光定量pcr体系进行荧光定量pcr反应；

40、(3)分析模块：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。

41、第六方面，本发明提供第一方面所述的检测牛多瘤病毒的引物和探针组合、第二方面所述的检测牛多瘤病毒的试剂盒或第五方面所述的检测牛多瘤病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测牛多瘤病毒的产品中的应用。

42、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

43、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

44、(1)本发明选择的扩增检测区域是bpyv 1型基因组中非常保守的区域，所述检测方法能够检测出ncbi数据库中所有bpyv 1型病毒分离株的基因组dna，对于将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高。

45、(2)本发明所述检测方法用时约1.5h，时间短，操作简单，人工和物料成本低。

46、(3)本发明所述检测方法可以检测出低至10-100个病毒基因组拷贝，该方法的高灵敏度能够更好地保证生物制品的安全性。

47、(4)细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染。用pcr方法做检测时，检测样本dna中也包含大量的细胞dna与微量的病毒dna(如果病毒污染存在)。大量的细胞dna常常会抑制pcr反应。根据实验结果，证明本发明所述检测方法在大量细胞基因组dna和其它病毒dna存在的情况下仍然有良好的特异性和灵敏度，特别适用于生物制品大批量生产的繁复检测，尤其是含细胞样品中的bpyv 1型病毒污染的检测。