一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-异亮氨酸发酵中的应用的制作方法

本发明涉及一种发酵工程，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-异亮氨酸发酵中的应用。

背景技术：

1、l-异亮氨酸属于疏水性支链氨基酸，系统名为“α-氨基β-甲基戊酸；1936年，国外学者rose等人对动物进行营养实验，结果显示l-异亮氨酸能促进人体新陈代谢，补充人体必备营养物质。人体正常每日需从食物中获取20mg/kg的l-异亮氨酸。如果补充不充分，人体正常的新陈代谢受到影响，营养失衡，人体免疫力下降，甚至可能引起疾病发生。l-异亮氨酸适合作为食品添加剂，保证人体获取充足的物质含量。此外，l-异亮氨酸还具有丰富的药用价值，l-异亮氨酸与l-亮氨酸、l-缬氨酸统称支链氨基酸，支链氨基酸能促进人体肌肉发育，增强肝脏免疫力，缓解疲劳，因此可以作为饮料添加剂以增强能量。氨基酸饮料能促进人体肌肉内蛋白质分解，因此很多饮料生产厂家将其融入到饮料制备中。运动员们经常饮用含有氨基酸的饮料，运动员服用后可以促进肌肉放松，更好的发挥状态。氨基酸饮料市场发展日益繁荣，获得了市场的广泛认可。具有代表的功能饮料生产品牌包括：如日本味之素公司生产的“氨基生命素”、“氨基维他水”、日本明治制草公司的“萨伯斯aminospo”能量饮料等。可以推断，随着未来人们对氨基酸的理解日益深化，功能饮料的发展将在市场中拥有更加广阔的空间。

2、下述列举了异亮氨酸以及发酵废液(盐)重新利用相关技术的部分专利情况，可见现有技术中氨基酸发酵领域主要热点和工艺如下：

3、一种降低l-异亮氨酸发酵废液中铵氮含量，cn 101899482 b：该专利通过用氢氧化钠替换ph调节剂氨气，进而减少发酵废液中铵根离子的浓度，该工艺将会减少分离中铵根离子的干扰，并降低铵根成本；

4、一种氨基酸发酵废水二次增值利用的方法，cn 110981003 a：该专利通过利用蒙脱石粉末将发酵废液上清吸附沉淀，其上清可灌溉使用，沉淀和菌体混合制成肥料，此工艺主要创新点是，发酵废液基本全部重新利用；

5、一种谷氨酸生产废液的利用方法，cn 101168515 b：该专利主要续创新点是将谷氨酸发酵分离的上清液进行分离并重新利用，其中硫酸铵被回收制成化肥，未被回收的固体部分被磷酸水解后作为发酵配料，实现了资源循环利用。

6、一种稳定高效生产l-异亮氨酸的发酵方法，cn 113046398 a：该专利主要创新点是在发酵液中添加发酵稳定剂，稳定剂包括钴胺素、吡哆醇、氯化胆碱、叶酸，最终l-异亮氨酸产量可达48g/l。

7、一种生产l-异亮氨酸的发酵方法，cn 111172086a：该专利主要创新点是控制残糖在0.5g/l以下，以此来进行杂酸控制，最终l-异亮氨酸产酸可达45g/l，杂酸仅有3.5g/l。

8、一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程，cn 111321100 a：该专利主要创新点是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造，其改造部分将l-异亮氨酸工业生产菌wm001的启动子ilva替换为启动子tac，敲除基因alat、brnq，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvbn和ppnk，并且此菌株最终不用添加任何抗生素，产酸为32.1g/l。

9、一种安全、高效生产1，3丙二醇的方法cn 200710048122.8：该专利发明了一种通过添加naoh进行转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，其发酵过程中通过流加naoh控制发酵液中的盐浓度进而进行丙二醇发酵过程；其中控制naoh浓度，可看做一种控制盐浓度即渗透压的方法；

10、一种调节发酵液渗透压提高赤藓糖醇产量的方法，cn201210204534.7：该专利发明了一种调节发酵液渗透压提高赤藓糖醇产量的方法，其特征在于以假丝酵母为生产菌过程中利用kcl和nacl并控制对应渗透进行发酵；

11、但是，上述现有技术均未解决目前国内l-异亮氨酸产酸低、糖酸比转化率较低并且杂酸较多等问题，对于本领域而言，亟需一种高产酸、高糖酸比、杂酸低的新技术以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足之处，本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-异亮氨酸发酵中的应用；其有效解决了现有技术中存在的产酸低杂酸高等技术难题，达到了高产酸、高转化率、低杂酸的有益效果。

2、首先，本技术所述的谷氨酸棒杆菌突变株为谷氨酸棒杆菌ibcl-1(corynebacterium glutamicum)，保藏编号为cctcc no:m 2022764。

3、进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌ibcl-1(corynebacterium glutamicum)是以谷氨酸棒杆菌(cicc no.21756)为出发菌株，通过诱导诱变定向培养，筛选出的，是一种高产l-异亮氨酸、副酸少的生产菌株—其于2022年05月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学。

4、本发明提供了含有所述谷氨酸棒杆菌ibcl-1(corynebacterium glutamicum)的菌群，还提供了含有所述谷氨酸棒杆菌ibcl-1或所述菌群的菌剂。

5、如下i)～iii)所示在l-异亮氨酸发酵中的应用：

6、i)、所述的谷氨酸棒杆菌ibcl-1(corynebacterium glutamicum)或其培养物和/或提取物；ii)、所述的菌群；iii)、所述的菌剂。

7、另外一方面，本技术还公开了所述的谷氨酸棒杆菌突变株在l-异亮氨酸发酵中的应用；具体是一种新型l-异亮氨酸发酵方法，该方法通过条件优化，获得一种依靠渗透压阶段控制的发酵工艺，大大提高了l-异亮氨酸的产量同时降低了杂酸；

8、进一步的，本发明采用了硫酸铵稀释液控制渗透压，硫酸铵不仅为发酵过程中提供一定的无机氮，而且影响了整个发酵液的渗透压，进而调控了l-异亮氨酸的关键酶活性增加产量，降低杂酸合成；

9、进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌突变株发酵生产l-异亮氨酸的方法，包括如下步骤：

10、(1)将l-异亮氨酸生产菌ibcl-1经过种子培养并接种至发酵罐中，发酵温度30-34℃，初始ph6.8-7.0，溶氧5-25％，待发酵液中菌种od562生长至40-45时，ph调至7.0-7.2；待发酵液残糖降至6-7％时，通过流加无机盐补料液控制发酵液渗透压在500-900mosm/l；

11、(2)待残糖低于1-4％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖维持在1-4％，同时继续流加无机盐补料液或发酵废液，控制发酵液的渗透压在700-1000mosm/l，糖耗完发酵结束，测得产酸5.4-6.2wt％，糖酸转化率28-33％，杂酸含量0.15-0.4wt％。

12、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的发酵废液为：将步骤(2)获得的l-异亮氨酸发酵液灭菌后，过滤去除菌体，上清液加硫酸调ph至4.0-4.5并脱色，再加入氨水调ph至6.0-6.5，浓缩、过滤、去除下层结晶，取上清液、过滤杂质制得。本发明利用发酵分离后收集的废液(此废液中富含高浓度的硫酸铵，即发酵废液)，进而将其用做发酵过程中渗透压控制液，大大节省了发酵成本。

13、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的无机盐补料液为5-20wt％的硫酸铵；更优选8-12wt％的硫酸铵；

14、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(1)中控制发酵液渗透压为650-750mosm/l，溶氧9-11％；

15、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(2)中控制发酵液渗透压为850-950mosm/l，残糖0.8-1.2％；

16、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(2)中控制残糖的补料糖液为38-42wt％葡萄糖、磷酸二氢钾0.08-0.12wt％，硫酸镁0.04-0.06wt％；

17、对于上文所述的技术方案而言，进一步地，所述的步骤(1)中将l-异亮氨酸生产菌ibcl-1经过逐级扩大接种体积的过程中的培养基包括：

18、一级种子培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，kh2po40.1-0.13wt％，mgso4·7h2o 0.05-0.07wt％，碳酸钙0.5-1.0wt％，ph7.0-7.2；

19、二级种子罐培养基：葡萄糖3-5wt％，玉米浆干粉1.0-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，kh2po40.1-0.13wt％，mgso4·7h2o 0.05-0.07wt％，ph6.8-7.2；

20、标准发酵罐发酵初始培养基：葡萄糖12-15wt％，玉米浆干粉0.8-1.2wt％，硫酸铵0.5-1.0wt％，磷酸二氢钾0.1-0.13wt％，硫酸镁0.05-0.07wt％，ph6.8-7.2。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、1.本发明通过筛选优化，获得一株l-异亮氨酸高产菌株，其产酸高，杂酸少；

23、2.在微生物培养中，渗透压不仅仅影响菌种的生长，并且在研究发现中，渗透压还影响菌种代谢糖的能力以及其他代谢途径中关键酶的活性，因此本发明采取了发酵过程中利用硫酸铵控制渗透压的调节方式，l-异亮氨酸产量大幅度提升，最高可达6.2％，为国内领先水平；

24、3.本发明通过控制阶段控制发酵过程中的溶氧与渗透压、残糖，进而大幅度降低其他代谢途径强度，进而减少杂酸浓度，最低杂酸可降至0.15％；

25、4.本发明在渗透压控制时，采取10％硫酸铵溶液进行控制，主要原因是在分离阶段，需要添加硫酸和氨水进行ph调节，从而产生了大量的硫酸铵，因此在发酵阶段使用高浓度的硫酸铵废液进行发酵使用，可以很好的解决硫酸铵废盐问题，从而达到了硫酸铵的循环使用。