一种双酶偶联合成高浓度(S)-构型玻色因的方法与流程

(一)本发明属于生物催化领域，涉及一种以β-丙酮木糖苷为底物双酶偶联催化合成高浓度(s)-构型玻色因的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、玻色因，化学名为羟丙基四氢吡喃三醇，分子式c8h18o5，分子量为192.21，具有良好的抗衰活性。它可以增加细胞及皮肤的紧致度，还可以帮助维持真皮的弹性，预防皮肤老化。此外，玻色因易于生物降解，不会在生物体内积累，没有毒性，在生物、医药、化妆品等领域的应用日渐宽广。玻色因是一种木糖衍生物，它有多种立体异构体，不同的异构体特征对生物活性具有影响。研究论文(synthesis of pro-xylanetm:a new biologically activec-glycoside in aqueous media)中提到β-糖苷键对维持玻色因生物活性的重要性远大于α-糖苷键，而羟丙基四氢吡喃三醇的7位手性碳原子上的(s)-羟基为优势构型，即兼具β-糖苷键和(7s)-羟基的(s)-构型玻色因生物活性更好。

2、玻色因的合成以木糖为原料，在碱性条件下与2,4-戊二酮缩合反应生成β-丙酮木糖苷，β-丙酮木糖苷的羰基经还原反应生成玻色因。β-丙酮木糖苷的羰基还原合成(s)-构型玻色因，因需要引入手性羟基，是合成(s)-构型玻色因的关键步骤。相较于化学法，生物酶法合成(s)-构型玻色因更加安全高效，成本低廉，立体选择性专一且对环境更加友好。尽管生物酶法具有诸多优点，目前适用的底物浓度不高于50g/l，生物酶法合成高浓度(s)-构型玻色因的方法尚有待开发。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种双酶偶联催化β-丙酮木糖苷还原合成高浓度(s)-构型玻色因的方法，以β-丙酮木糖苷为底物、以异丙醇为辅底物、优选的源自lentilactobacilluskefiri的短链醇脱氢酶lkcr为生物催化剂，辅酶循环体系由醇脱氢酶和异丙醇组成。生物催化剂利用还原型辅酶(nadh或nadph)催化β-丙酮木糖苷选择性加氢生成(s)-羟丙基四氢吡喃三醇和氧化型辅酶(nad+或nadp+)，而优选的醇脱氢酶和异丙醇则起到驱动辅酶循环的作用，将氧化型辅酶转换为还原型辅酶。该生物催化体系可适用1000mm底物β-丙酮木糖苷(190g/l)，产物非对映体选择性>99％。该方法具有催化效率高、适用底物浓度高和产物易于分离纯化等优点，后续的产物分离纯化过程简便。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种双酶偶联催化合成高浓度(s)-构型玻色因的方法，所述方法为：以含源自lentilactobacillus kefiri的短链醇脱氢酶lkcr编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的粗酶液作为催化剂，以β-丙酮木糖苷为底物，以nad+或nadp+为辅酶，加入辅助催化剂和辅底物驱动辅酶循环，以ph 5.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为25～45℃，300～600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得(s)-羟丙基四氢吡喃三醇，即(s)-构型玻色因。该催化体系可适用1000mm底物β-丙酮木糖苷(190g/l)，转化率>99％。本发明反应过程中利用自动滴定系统维持ph恒定，滴定所用的碱液为1m naoh水溶液。所述辅助催化剂包括含葡萄糖脱氢酶bmgdh、甲酸脱氢酶aafdh或是醇脱氢酶raadh的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液。所述辅底物包括葡萄糖、甲酸铵、异丙醇。

4、进一步，所述短链醇脱氢酶lkcr是将lkcr编码基因导入大肠杆菌构建获得的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述短链醇脱氢酶lkcr编码基因核苷酸序列如seq id no.1所示。短链醇脱氢酶lkcr基因工程菌构建方法为：将seq id no.1所示lkcr编码基因插入pet28a载体的nde i和hind iii限制性酶切位点，得到重组载体pet28a-lkcr；将重组载体pet28a-lkcr导入宿主细胞e.coli bl21(de3)，得到基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-lkcr。

5、进一步，所述辅助催化剂分别通过将编码基因导入大肠杆菌构建获得基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述葡萄糖脱氢酶bmgdh编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所述，氨基酸序列如seq id no.4所示。所述甲酸脱氢酶aafdh编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。所述醇脱氢酶raadh编码基因的核苷酸序列如seq idno.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。葡萄糖脱氢酶bmgdh基因工程菌构建方法为：将seq id no.3所示葡萄糖脱氢酶bmgdh编码基因插入pet28a载体的bamh i和xho i限制性酶切位点，得到重组载体pet28a-bmgdh；将重组载体pet28a-gdh导入宿主细胞e.coli bl21(de3)，得到重组基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-bmgdh。甲酸脱氢酶aafdh基因工程菌构建方法为：将seq id no.5所示甲酸脱氢酶aafdh编码基因插入pet28a载体的bamh i和xho i限制性酶切位点，得到重组载体pet28a-aafdh；将重组载体pet28a-aafdh导入宿主细胞e.coli bl21(de3)，得到重组基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-aafdh。醇脱氢酶基因工程菌构建方法为：将seq idno.7所示醇脱氢酶raadh编码基因插入pet28a载体的bamh i和xho i限制性酶切位点，得到重组载体pet28a-raadh；将重组载体pet28a-raadh导入宿主细胞e.coli bl21(de3)，得到重组基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-raadh。

6、进一步，所述反应体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为20～100g/l(优选50g/l)；催化剂与辅助催化剂以质量比1:1混合；所述底物加入终浓度为400～1000mm，所述底物与辅底物加入摩尔浓度比为1:1～6(优选1:4)；所述辅酶加入终浓度为0～1mm(优选0.2mm)。

7、进一步，所述反应时间为6～30h，所述反应温度为40℃，转速300rpm，反应介质为ph 7.0的50mm pbs缓冲液。

8、进一步，所述催化剂和辅助催化剂的湿菌体或者由湿菌体制得的粗酶液按如下方法制备：将基因工程菌接种于含有终浓度100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度od600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0～0.6mm(优选0.2mm)的iptg，在24℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用ph 8.0的50mm tris-hcl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，所得湿菌体即作为整细胞催化时的生物催化剂或辅助生物催化剂；以1g湿菌体和15ml pbs缓冲液(50mm，ph 7.0)的比例悬浮湿菌体，将悬浮液于超声破碎仪中以工作2s，间歇4s，650w的功率的程序破碎20min。在4℃和12000rpm下离心10min，收集上清液，上清液即为生物催化剂或辅助生物催化剂的粗酶液。

9、进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入活性炭脱色；脱色结束后，在12000rpm下离心1min，取上清，用截留分子量3000的超滤膜预处理，然后用截留分子量200的纳滤膜脱盐，55℃下减压旋蒸去除水分，获得产物(s)-构型玻色因。

10、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的双酶偶联催化合成(s)-羟丙基四氢吡喃三醇的方法，以β-丙酮木糖苷为底物、优选的短链醇脱氢酶lkcr利用nadph催化β-丙酮木糖苷加氢生成(s)-羟丙基四氢吡喃三醇和nadp+，而优选的醇脱氢酶则起到驱动辅酶循环的作用，利用异丙醇和nadp+生成丙酮和nadph(图1)。该生物催化体系可适用1000mm底物β-丙酮木糖苷(190g/l)。反应高效，转化率>99％；反应立体选择性专一，产物的非对映体选择性>99％。产物分离纯化过程简便，产品纯度>99％。