高亲和力TIGIT抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体领域，具体地，本发明涉及一种高亲和力tigit抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、制备抗体或其抗原结合片段的方法、重组细胞、组合物及其用途和药物及其用途。

背景技术：

1、恶性肿瘤作为一种严重威胁人类的生命健康的疾病。目前已有的恶性肿瘤治疗手段，包括手术切除、放疗、化疗、小分子靶向疗法、免疫检查点疗法、细胞及基因疗法等仅能够在部分恶性肿瘤患者中发挥有限的作用，恶性肿瘤仍是困扰人类生命健康的难题。

2、近年来，免疫疗法在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的进展，尤其是以抗ctla-4和抗pd-1或pd-l1抗体为代表的免疫卡控点阻断疗法。通过阻断t细胞表面抑制性受体与其配体的结合，阻断抑制性信号的传递，纠正免疫抑制性微环境所介导的免疫抑制，恢复肿瘤微环境t细胞的抗肿瘤能力，在多种转移性晚期恶性肿瘤(包括转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等)治疗方面取得了较高的应答率。但是不能忽视的是，即便目前获批适应症最广的pd-1/l1疗法的总体响应率仍只有30％，仍有更多的患者无法从中受益。

3、然而，并非所有的恶性肿瘤患者对pd-1、pd-l1或ctla-4阻断治疗有效，对pd-1或pd-l1抗体的治疗只有10％-30％的患者表现出长期持久的反应，大多数人群缺乏响应。一方面，由于肿瘤、肿瘤浸润淋巴细胞的免疫检查点受配体表达具有较大的异质性，导致单一种类的免疫检查点疗法无法适用于所有患者，多数患者无法从中获益；另一方面，部分接受过免疫检测点疗法的患者会复发肿瘤并产生对该免疫检查点疗法的耐受，继续给药也无法产生疗效，即继发性耐药。基于这两方面的原因，开发针对更多靶点的免疫检查点抗体是有必要的。

4、t细胞免疫球蛋白和itim(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)结构域蛋白(tigit)作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在自然杀伤(nk)细胞、活化的cd8+t和cd4+t细胞、调节性t细胞(tregs)和滤泡辅助性t细胞(tfh)表面。tigit识别的配体cd155和cd112主要在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dc)、t细胞、b细胞和许多非造血细胞(包括不同组织学类型的肿瘤细胞)上表达。tigit结合配体pvr(polivirus receptor，cd155)的亲和力显著高于其竞争受体cd226和cd96。tigit与其配体结合通过胞内itim基序传递抑制性信号，从而抑制t细胞、nk细胞的功能。

5、研究表明，tigit的表达与多种恶性肿瘤(如非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和滤泡性淋巴瘤)的发展相关。据报道，肺癌患者的肿瘤浸润t细胞表面高表达tigit分子，并且其表达和pd-1的表达存在显著的正相关。结肠癌患者的肿瘤浸润nk细胞表面tigit表达显著高于外周血nk细胞。在多种小鼠肿瘤模型中，利用抗体阻断tigit能够抑制肿瘤生长和转移，同时阻断tigit和pd-1能够有效治疗肿瘤。因此，开发治疗性tigit抗体显得尤为必要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、为了能够抑制肿瘤的生长和转移以及产生的继发性耐药问题，本发明提供了一种高亲和力tigit抗体及其在恶性肿瘤治疗中的应用。

3、本发明提供的抗体通过阻断tigit与配体cd155的结合，解除tigit介导的免疫抑制，促进免疫细胞抗癌功能。

4、因此，为了实现上述目的，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括：

5、分别如seq id no：1、2和3或者与seq id no：1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列；和

6、分别如seq id no：4、5和6或者与4、5和6具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3序列。

7、根据本发明实施例，所述抗体或其抗原结合片段可以与tigit结合，阻断tigit与配体cd155的结合，解除tigit介导的免疫抑制，激活免疫细胞抗癌机制，进而抑制肿瘤的生长和增殖。并且所述抗体或其抗原结合片段特异性高，可以避免继发性耐药问题的发生。

8、根据本发明的实施例，上述抗体或其抗原结合片段还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

9、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括：

10、如seq id no：1所示的重链可变区cdr1序列，如seq id no：2所示的重链可变区cdr2，如seq id no：3所示的重链可变区cdr3，seq id no：4所示的轻链可变区cdr1，seq idno：5所示的轻链可变区cdr2，seq id no：6所示的轻链可变区cdr3。

11、gssitsdya(seq id no：1)，

12、itysgrt(seq id no：2)，

13、arwgllrryfdy(seq id no：3)，

14、qdvfnq(seq id no：4)，

15、sasfryt(seq id no：5)，

16、qqhystplt(seq id no：6)。

17、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别tigit。

18、根据本发明的实施例，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示，

19、qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvtgssitsdyawnwirqfpgkklewmgyitysgr ttynpslksritisrdtsknqfslklssvtaadtatyycarwgllrryfdywgqgtlltv ss(seq id no：7)，

20、divmtqspssmstsvgdrvtitcrasqdvfnqvawyqqkpgkspklliysasfrytg vpdrfsgsgsgtdftftissvqaedfatyycqqhystpltfgagtklelk(seq id no：8)。

21、根据本发明的实施例，所述抗体为人源化抗体。

22、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段含有重链框架区序列和轻链框架区序列，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

23、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。

24、根据本发明的实施例，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源igg1抗体、igg2a抗体或其突变体或人源igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体、igg4抗体或其突变体。根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段为单链抗体、多聚体抗体、cdr移植抗体、fab抗体、fv抗体中的至少之一。

25、在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

26、根据本发明实施例的核酸分子编码的抗体或其抗原结合片段具有更强的特异性、更长的半衰期和更高的效力，能够在较少的用药剂量下，有效治疗或预防恶性肿瘤，且毒副作用低，安全性更高。

27、在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带本发明第二方面所述的核酸分子。

28、本发明实施例所提出的表达载体可在适合的受体细胞中高效表达前述的抗体或其抗原结合片段，本发明设计的抗体或其抗原结合片段具有更强的特异性以及具有更高的安全性。

29、在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

30、将本发明第三方面所述的表达载体引入到细胞中；

31、将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述抗体或其抗原结合片段。

32、发明人发现，根据本发明实施例制备的抗体或其抗原结合片段可以更加高效的培养出高纯度的抗体或其抗原结合片段，并且操作步骤简单，成本较低。

33、根据本发明的实施例，所述细胞为真核细胞。

34、在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞表达本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，携带本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的表达载体。

35、根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效并大量表达抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有更强的特异性、更长的半衰期和更高的效力，能够在较少的用药剂量下，将抗体药物递送到靶细胞，实现疾病的有效治疗或预防癌症，其毒副作用低，具有更高的安全性。

36、在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体或本发明第五方面所述的重组细胞。

37、根据本发明的实施例，本发明组合物进入生物体中可以达到与抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体以及重组细胞相同的治疗效果。

38、在本发明的第七方面，本发明提出了一种组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防恶性肿瘤。

39、根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段可以用于制备药物，所述制备的药物具有与抗体或其抗原结合片段相同的功效，可用于治疗或预防恶性肿瘤等疾病。

40、根据本发明的实施例，所述恶性肿瘤包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。

41、在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的重组细胞或本发明第六方面所述的组合物，所述药物用于治疗恶性肿瘤。

42、发明人发现，含有抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物的药物，对于恶性肿瘤的治疗和预后均有较优的疗效。

43、根据本发明的实施例，所述恶性肿瘤包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。

44、在本发明的第九方面，本发明提出了一种前述抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测tigit。

45、根据本发明的实施例，所述试剂盒更加高效、精确的检测检测tigit，为临床治疗节省时间和探索成本。

46、在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

47、发明人发现，基于抗体或其抗原结合片段制备的试剂盒，可应用于科学研究中，节省解析恶性肿瘤所消耗的时间和成本。