一种与先天性白内障相关的SNP分子标记及应用

本发明属于分子遗传学，涉及一种先天性白内障致病基因的突变位点及其检测引物、检测试剂盒。

背景技术：

1、先天性白内障是一种发生于婴儿出生前的晶状体混浊现象，临床特征为白瞳症，即眼球出现白色反射状物。先天性白内障是造成儿童失明或弱视的主要原因之一，约三分之一的先天性白内障与遗传因素相关，其中以常染色体显性遗传最为常见。先天性白内障的发病机制还不十分明确，已鉴定出的100多个先天性白内障相关基因。

2、铁蛋白(ferritin)是一种广泛存在于原核生物及真核生物的铁储存蛋白，主要负责铁元素在细胞内的储存和分布，结构上包含24个亚基，分为重链亚基(ferritin heavychain,fth)和轻链亚基(ferritin light chain,ftl)两大类。fth亚基具有铁氧化酶活性，可将fe2+转换为fe3+，以便其存储在铁蛋白核心空腔区间，同时防止fe3+发生还原反应转换为fe2+；ftl亚基不具有催化活性，但具有协助铁离子成核与矿化功能，将铁离子储存于核心空腔中。

3、在铁离子匮乏条件下，铁调节蛋白(iron regulatory protein，irp)结合到转铁蛋白受体-1(transferrin receptor 1，tfr1)mrna的铁元素应答元件(eiron responsiveelement，ire)上，提高mrna的稳定性。同时，irp也结合到铁蛋白mrna的铁元素应答元件(eiron responsive element，ire)上，抑制铁蛋白基因的翻译。铁离子过量情况下，irp结合铁离子，失去对ire元件的亲和性，导致tfr1 mrna不稳定，铁蛋白的合成抑制被解除，发挥其储存铁离子的功能。

4、综上可知，血铁浓度异常是先天性白内障的发病机制之一。因此，对先天性白内障或迟发白内障病例进行血铁浓度筛查或铁蛋白含量检测将有助于先天性白内障的诊断。

5、研究表明，铁蛋白轻链上的致病性突变可导致神经铁蛋白病，主要表现为铁蛋白沉积在大脑的基底节区形成包涵体和铁在中枢神经系统异常聚集，铁蛋白轻链突变个体往往显示出较高的铁氧化和铁释放速率，部分患者还具有精神症状。遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征(hereditary hyperferriemia cataract syndrome，hhcs)是一种罕见的疾病，其特征是血清铁蛋白水平高、先天性双侧白内障和组织铁超载缺失，这种疾病是由位于ftl基因5utr的ire突变引起。

6、cn111607641公开了一种致先天性膜性白内障的新基因突变位点，该突变基因位点为lim2基因cdna编码区的388位单核苷酸：c.388c>t。cn107723359a公开了一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒，先天性白内障致病基因为变异的cryba4基因，其第4外显子的第277位碱基由t突变为c，该突变导致编码第93位丝氨酸的遗传密码子(tcc)变成脯氨酸的遗传密码子(ccc)区的388位单核苷酸：c.388c>t。

7、因此，确定新的先天性膜性白内障相关基因的致病突变，对开展先天性白内障的分子诊断具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题，在于提供一种先天性白内障致病基因的突变位点及其检测引物、检测试剂及应用。

2、为实现上述目的，本发明是这样实现的：

3、一种先天性白内障致病基因ftl，ftl基因的核苷酸序列为gene bank登录号为nc_000019.10所示的核苷酸序列的第48964994-48966879位，本发明ftl基因的突变位点为第48965381位，即seq id no:1seq id no:1所示核苷酸序列从5，端第347位碱基由g突变为c。野生型ftl基因在ncbi数据库中的基因编号为nm_000146.4。本发明首先提供了一种检测人先天性白内障致病基因的突变位点，即ftl c.-168g>c，该基因定位于染色体19q13.3，其5’-utr区的c.-168g>c单点突变，是一种非常罕见的snp位点，编号为rs398124635，杂合突变即致病；其次，本发明还提供了所述的突变位点在制备先天性白内障基因突变的检测试验盒中的应用。

4、本发明提供了一种用于检测所述的突变位点的引物对，包括正向引物和反向引物。

5、正向引物序列：gtgctcccataaaactctagcc(seq id no:2)；

6、反向引物序列：ggactcaccagagagaggtagg(seq id no:3)。

7、包含上述检测引物的检测试剂盒，还包括dntps、反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。

8、上述试剂盒用于先天性白内障致病基因的扩增，该试剂盒的检测体系为：总体积40μl；5×pcr缓冲液5μl，dntp 3μl，正向引物1μl，反向引物1μl，taq酶1μl，dna模板2μl，nuclease-free h2o 27μl。

9、该试剂盒采用普通pcr进行扩增，反应程序为：94℃预变性4min；

10、(94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s)扩增35循环；72℃延伸10min，4℃保存。

11、所述dna模板采用苯酚-氯仿抽提，所有离心操作于4℃低温离心机中下进行。步骤如下：①采用红细胞裂解液以10:1比例稀释外周血样本，颠倒混匀至混合液呈透明状。300×rcf离心10min，弃上清；②加入3ml 1×细胞核裂解液、300μl 20％的sds溶液和25μl20mg/ml蛋白水解酶k，37℃涡旋孵育消化6h；③加入6ml tris-饱和酚/氯仿混合液，颠倒混匀，300×rcf离心10min，吸取上层水相至新的ep管；④加入6ml氯仿，颠倒混匀，300×rcf离心10min，吸取上层水相至新的ep管；⑤加入10ml无水乙醇，轻柔颠倒，产生絮状沉淀后，吸取沉淀至新的ep管，1300×rcf离心15min，弃上清；⑥75％乙醇洗涤沉淀，1300×rcf离心15min，重复一次，弃上清，吸干残液；⑦通风橱晾干dna沉淀，再加入适量nuclease freeh2o溶解dna；⑧nano-drop检测dna浓度与纯度，要求od260/280比值在1.8-1.9之间，od260/223比值大于2.0；⑨琼脂糖电泳二次验证dna质量。

12、本发明提供了所述的引物对在制备先天性白内障基因突变位点的检测试验盒中的应用。

13、本发明的变异的人类ftl基因中，其5’-utr区的168号位的碱基由g变成了c。该

14、突变正好位于ftl mrna的ire元件上，导致ftl的合成抑制被解除，生成大量ftl，过度储存铁离子，过量的铁离子储存、滞留和聚集在凝胶状的晶状体内干扰光线的传输，而引发遗传性高铁蛋白血症-白内障综合征。

15、该变异基因可作为探针用于制备家族性先天性白内障的诊断试剂盒，并可制备成基因芯片用于制备检测家族性先天性白内障的诊断试剂盒。本发明的检测引物及检测试剂盒对于本发明中所述的家系中的先天性白内障的诊断准确。对于其他患者进行诊断时，如果结果是发生了该突变，则判断为是先天性白内障患者；如果结果是未发生本发明中的突变，则并不能排除其因其他基因突变患白内障的可能性。