一种增强的切刻酶依赖扩增的方法及应用与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种增强的切刻酶依赖扩增的方法及应用。

背景技术：

1、全基因组扩增技术(whole genome amplification，wga)是能够实现在没有序列倾向性的前提下对整个基因组扩增以提供大量可供分析样品的技术

2、1基于pcr技术的wga方法(pcr-based wga)

3、1.1引物延伸预扩增法

4、引物延伸预扩增法(primerextension preamplification，pep)在所有wga方法中是较早出现的一种，pep法是一种基于pcr技术发展而来的wga方法，主要原理是使用15个碱基长的随机引物(n15，理论上有415种组合)在37℃的低退火温度下进行较长时间的退火，然后缓慢升温至55℃进行长时间的引物延伸，如此反复多个循环。但由于pep法使用随机引物以及较为不严格的pcr循环参数，因此可能导致不均衡的扩增结果和随机突变。

5、1.2简并寡核苷酸引物pcr

6、简并寡核苷酸引物pcr法(degenerate oligonucleotide primed pcr，dop-pcr)也是一种基于pcr技术的全扩增方法，其原理是使用部分简并的引物进行pcr反应(引物中间部分含有6个随机碱基)，在最初的几个循环中使用较低的温度(25℃)进行退火以确保引物与模板的结合，并缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(55℃)进行多循环常规pcr反应，对dop-pcr结果影响较大的因素是聚合酶及引物浓度。dop-pcr法虽然使用相对pep法更为严格的pcr反应条件，但引物与模板间结合的不确定性以及引物间的相互作用仍可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率，因此，较大程度上限制了该方法的应用。

7、1.3连接介导pcr

8、连接介导pcr(ligation-mediated pcr，lm-pcr)指的是一类有接头连接过程参与的pcr反应。lm-pcr全扩增技术需要通过3个步骤来实现：(1)模板dna的片段化处理：可通过物理剪切或限制性内切酶处理使基因组dna断裂成若干适合pcr扩增的片段。使用物理剪切法对dna进行处理时因无法预测片段末端结构，因此需要对其进行平末端化处理以满足其与接头进行连接的条件；如使用限制性内切酶对模板进行剪切，因各片段末端组成已知，因此大多数情况下无需对片段进行处理；(2)模板片段与接头连接：根据酶切片段类型，设计可与之连接的接头，在dna连接酶的作用下与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，用作下一步pcr反应中的引物；(3)全扩增pcr反应：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行pcr反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。lm-pcr虽然灵敏度高，且在扩增pcr时可以使用通用引物，但是lm-pcr操作繁琐且在实验过程中容易丢失模板dna。

9、2恒温全基因组扩增反应

10、2.1mda：多重置换扩增反应

11、多重置换扩增法(multiple displacement amplification，mda)是基于恒温核酸扩增技术的一种方法，相对pcr类全扩增方法出现较晚，其基本原理是使用一条硫代修饰的六核苷酸随机引物(n6)在恒温条件下与基因组随机退火，并在具有强链置换活性的phi29dna聚合酶的作用下发生链置换扩增反应，置换产生的单链序列又可与随机引物任意退火延伸，形成超分支扩增结构，由于phi29 dna聚合酶具有较强的持续合成dna的能力，因此可持续合成长达50～100kb的产物。由于mda法是一种恒温核酸扩增方法，可能存在一定的非特异性扩增问题，即体系内不含有模板时也会产生大量产物。mda法是目前公认应用最广泛的wga方法，操作简单且对实验仪器的要求极低，且使用非预变性的模板时也可取得良好的wga效果，可进一步简化实验操作及避免污染的产生，可广泛应用于基因组测序、cgh(高通量阵列比较基因组杂交技术)、snps(单核苷酸多态性)分析等相关领域，目前针对该方法开发的产品较为成熟，具有代表性的为qiagen公司的repli-g系列全扩增试剂盒。

12、2.2pwga：基于引物酶的全基因组扩增

13、基于引物酶的全基因组扩增(primer-based whole genome amplification，pwga)是一种由t7细菌噬菌体核酸复制方式演化而来的恒温全基因组扩增方法，相对于其他所有wga方法，pwga最大的特点是在扩增过程中不需要使用任何引物，且不需要对模板进行预变性处理。pwga过程中所需的t7 gp4蛋白可同时发挥解旋酶和引物酶的作用，该蛋白的c端部分可利用脱氧胸苷三磷酸(dttp)水解产生的能量来将dna双链解旋；而n端则行使引物酶(primase)的作用，其特异性识别3'-ctgg(g/t)-5'和3'-ctgtg-5'并产生短的rna作为扩增引物。引物生成后在t7 dna聚合酶全酶的作用下进行持续的扩增反应，由t7 gp2.5基因编码的单链dna结合蛋白(single-stranded dnabinding protein)与解旋产生的单链dna结合并与解旋酶/引物酶、聚合酶一起完成整个全基因组扩增过程，该扩增模式与滚环扩增(rolling circle amplification，rca)相似并可以产生长达40kb的产物。

14、3malbac：多次退火环状循环扩增技术

15、多次退火环状循环扩增技术(multiple annealing and looping-basedamplification cycles，malbac)结合了mda法与pcr方法的特点，使用的35nt长的引物，由一段固定的27nt通用引物序列和8nt随机碱基序列(n8)组成，在0℃时该8nt随机碱基序列可与模板任意退火，梯度升温至65℃后在具有链置换活性的bst dna聚合酶大片段作用下发生链置换聚合反应，得到一系列长度不一的(0.5～1.5kb)半扩增子(semi-amplicons)，在94℃变性、0℃退火以及65℃延伸循环后，上一循环中半扩增子形成了两端具有互补结构(27nt)的全扩增子(amplicons)，随后降低温度至58℃，使得到的扩增子两端互补形成loop结构，从而可以避免引物与其进行结合导致全扩增子倍增导致的不均衡扩增，因此可以很大程度上保证该循环发生的是线性扩增。在经过5个上述类似线性扩增循环后可得到大量全扩增子，并做为接下来pcr反应的模板，使用该27nt通用引物进行指数pcr反应，因此只有全扩增子才能得到有效扩增，从而实现对整个基因组的高效而又均衡的全扩增。

16、4转座子插入线性扩增(linear amplification via transposon insertion，lianti)

17、谢晓亮教授在science上的报告了一种改进的单细胞的wga法：通过转座子插入进行线性放大。dna被含有t7启动子的tn5转座子随机片段化，t7启动子允许线性扩增。lianti法优于现有的方法，能在千碱基分辨率进行微cnv(copy number variation)检测。这允许直接观察从细胞到细胞不同的，随机发生的dna复制起始。

18、5依赖于切刻酶的恒温扩增技术

19、5.1切口酶核酸恒温扩增术(nicking enzyme mediated amplification，nema)

20、首先使用一种链置换酶与模板dna进行反应生成含有切刻内切酶识别序列的少量dna，然后切刻内切酶识别酶切位点，将单链切断。dna聚合酶接着以切口为起点，以未被切断的单链核酸为模板，合成新的双链核酸，并将旧链剥离作为下一轮合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点，重复进行切割、延伸和剥离，即可扩增大量靶核酸序列。

21、5.2切刻酶依赖的dna链置换技术(nickase-dependment dna stranddisplacement amplification，nda)

22、首先是切刻酶在目标dna两侧的识别位点处或其附近切割dna，产生切刻，然后dna聚合酶切口为起点进行聚合延伸反应封闭切刻，同时通过链置换作用将下游的dna链从原有双链上剥离，形成游离的单链；切刻酶的切口在这一反应过程中重新形成，从而使酶切--延伸的过程可以反复进行，最终得到了可以线性扩增的相应单链dna。产物单链与含有切点的引物退火延伸形成双链，再次酶切--延伸，使目的片段得到指数扩增，反应不需要dntps，但是暂时无法扩增较复杂的基因组dna。

23、5.3线性化链置换扩增技术(linear strand-displacement amplification，lsda)

24、通过切刻内切核酸酶切割双链dna一条链中识别序列中的磷酸二酯键后，dna聚合酶结合切口位点并从3ˊoh延伸，置换下游链。dna聚合酶从切口的延伸再生了切口酶的双链识别位点。切口核酸内切酶和dna聚合酶的连续联合作用导致一条dna链的线性扩增。切口酶的识别位点是靶dna上的内源位点或者是通过连接含有识别序列的寡核苷酸双链体或通过使用含有识别序列的引物的pcr而添加到靶dna末端的位点。

25、现有技术目前公认应用最广泛的是mda方法，操作简单且对实验仪器的要求极低，针对该方法开发的产品较为成熟，具有代表性的为qiagen公司的repli-g系列全扩增试剂盒。但是mda本质上仍是通过phi29聚合酶在随机引物与模板dna结合下进行置换合成反应。仍存在引物之间相互作用及产生非特异性扩增问题，且虽然实验简单，但是反应时间较长，以qiagen公司的repli-g系列为例，反应时长从1.5h～16h不等。总结如下：

26、1、现有技术多数需要使用引物，而引物容易形成引物二聚体，造成非模板依赖性的扩增。这些副反应会产生大量的非靶标dna，从而干扰下游的实验。

27、2、现有技术大多包含温度循环变化的过程，需求特定的热循环仪实现较精密的温度控制，而且现有技术大多实验繁琐，扩增反应时间也较长。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供的一种增强的切刻酶依赖扩增的方法及应用，解决核酸检测前量太少的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了同源重组酶在提高全基因组预扩增效率中的应用；

4、所述同源重组酶包括reca、recbcd、recf、reco、recr、rad51或mre11-rad50中的一种或多种；

5、所述全基因组预扩增包括引物非依赖的、基于切刻酶的全基因组预扩增。

6、在本发明中的一些具体实施方案中，上述应用中所述同源重组酶包括tth_reca。

7、本发明还提供了组合物，包括切刻酶和同源重组酶，且不包括引物。

8、在本发明中的一些具体实施方案中，上述组合物的所述切刻酶来源于耐热物种。

9、在本发明中的一些具体实施方案中，上述组合物的所述同源重组酶来源于耐热物种。

10、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述切刻酶nb.bbvci、nb.bsmi、nb.bsrdi、nb.btsi、nt.alwi、nt.bbvci、nt.bsmai、nt.bspqi、nt.bstnbi或nt.cvipii中的一种或多种。

11、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述切刻酶包括nt.bbvci、nt.bstnbi、nt.alwi和/或nt.cvipii。

12、在本发明中的一些具体实施方案中，上述组合物的所述切刻酶为nt.bstnbi。

13、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述同源重组酶包括reca、recbcd、recf、reco、recr、rad51或mre11-rad50中的一种或多种。

14、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述同源重组酶包括tth_reca。

15、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述tth_reca具有：

16、(1)、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或

17、(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

18、(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

19、所述多个为2个至100个。

20、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述组合物还包括单链结合蛋白和/或dna聚合酶。

21、在本发明中的一些具体实施方案中，上述组合物的所述单链结合蛋白来源于耐热物种。

22、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述单链结合蛋白包括tth_ssb。

23、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述单链结合蛋白具有：

24、(4)、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或

25、(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

26、(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

27、所述若干个为2个至85个。

28、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述dna聚合酶具有5’-3’聚合酶活性以及链置换活性，且不具有5’-3’外切酶活性。

29、在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述dna聚合酶包括bst dna聚合酶。

30、本发明还提供了上述组合物在核酸扩增中的应用；

31、所述核酸扩增包括全基因组扩增。

32、本发明还提供了上述组合物在制备核酸扩增试剂、试剂盒和/或装置中的应用，所述核酸扩增包括全基因组扩增。

33、本发明还提供了试剂、试剂盒和/或装置，包括上述的组合物，以及可接受的辅料、助剂和/或部件。

34、本发明还提供了全基因组的预扩增方法，其基于上述组合物扩增。

35、本发明还提供了全基因组的预扩增方法，包括：将上述组合物、缓冲液、助剂和待扩增基因组核酸混合，反应，获得全基因组预扩增产物。

36、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述切刻酶的终浓度为0.001～0.5u/μl。

37、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述同源重组酶的终浓度为0.004～0.5mg/ml。

38、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述单链结合蛋白的终浓度为0.004～5mg/ml。

39、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述缓冲液包括ndabuffer。

40、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述助剂包括终浓度为10～6000μmol/l的atp。

41、在本发明中的一些具体实施方案中，上述预扩增方法中的所述同源重组酶需消耗atp终浓度为10～6000μmol/l。

42、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述切刻酶的终浓度为0.05u/μl。

43、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述同源重组酶的终浓度为0.07mg/ml。

44、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述组合物中的所述单链结合蛋白的终浓度为0.04mg/ml。

45、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述缓冲液包括ndabuffer。

46、在本发明的一些具体实施方案中，上述预扩增方法的所述助剂包括终浓度为600μmol/l的atp。

47、本发明的应用及试剂盒有如下效果：

48、1、本发明不需要使用引物，只需要游离的dntps，在聚合酶的作用下就会在模板dna上延伸；

49、2、本发明只需两个温度，在55℃左右反应，待反应结束后使用95℃灭活，即可得到大量模板。