miRNA前体作为氡暴露诊断分子标志物的应用及其筛选方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及mirna前体作为氡暴露诊断分子标志物的应用及其筛选方法。

背景技术：

1、随着电离辐射技术的发展，从事放射性职业的工作人员日趋增多，电离辐射对放射性工作人员的健康的影响也成为高度关注的热点问题。因此，如何有效进行放射性工作人员健康管理工作，提升他们的职业健康状况成为当前一个重要的研究课题。对放射工作人员职业健康管理是放射卫生工作的重点之一，其中包括职业健康监护。放射工作人员的健康监护除了进行健康状况的分析和个体工作适任性评价外，还要发现健康的异常变化，尽可能防止疾病发生和发展，促进健康康复。目前对放射工作人员的健康检查除常规体检外，主要为淋巴细胞染色体畸变和微核的分析，但此二项检查也无法检测到辐射诱导的早期损伤。

2、因此，为了及早发现放射工作人员的健康异常状况，提高健康监护能力，急需研发可用于检测早期辐射损伤的技术，从而为放射工作人员健康保驾护航。

3、目前，我国已将氡及其子体诱发的矿工肺癌列为职业性放射性肿瘤之一。对于职业高危人群，定期的职业健康体检是健康监护的主要手段。目前肺癌筛查常用方法为痰脱落细胞检查和胸片x射线检查。随着肿瘤分子生物学研究的深入，20世纪90年代以来，研究人员围绕p53、k-ras、hprt、o6-mgmt等肿瘤相关基因，陆续开展了氡暴露致肺癌的相关研究，期望寻找氡致肺癌的特异性分子标志物。目前关于铀矿工氡致肺癌的早期筛查手段仍是痰细胞涂片病理检查和胸部x射线检查。

4、mrna及非编码rna在肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用，有望成为肿瘤早期筛查及预后的生物学指标。氡致肺癌早期分子标志物的研究有助于矿工氡致肺癌的早发现及早治疗。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的是提供mirna前体作为氡暴露诊断分子标志物的应用及其筛选方法，筛选出nr_029854作为氡暴露诊断的分子标志物，能够便捷、准确、定量的进行辐射暴露诊断。

2、为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：mirna前体作为氡暴露诊断分子标志物的应用，作为氡暴露诊断分子标志物的所述mirna前体为nr_029854。

3、进一步，所述nr_029854既反应人支气管上皮细胞早期损伤，又在人支气管上皮细胞晚期损伤中持续差异表达。

4、本发明还提供mirna前体作为氡暴露诊断分子标志物的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

5、s1、建立实验组细胞模型：构建α粒子分次累积照射致人支气管上皮细胞beas-2b损伤模型；

6、s2、基因芯片筛选：提取各实验组细胞总rna、对照组细胞总rna并分别进行基因芯片检测分析，利用基因芯片探讨α粒子累积照射对人支气管上皮细胞beas-2b转录组表达的影响，并筛选出差异基因；

7、s3、通过pcr验证确认mirna前体分子nr_029854基因作为分子标志物用于氡暴露辐射早期损伤诊断的可行性。

8、进一步，步骤s1包括如下具体步骤：

9、s11、培养人支气管上皮细胞beas-2b；

10、s12、取对数生长期的beas-2b细胞接种于带无菌圆形盖玻片的六孔板中作为实验组，利用α粒子照射实验组，构建实验组beas-2b细胞模型；

11、s13、确证实验组beas-2b细胞模型构建成功。

12、进一步，步骤s12中，所述利用α粒子照射实验组采用分次照射的方式：第一次α粒子照射后继续传代培养10代；再进行第二次α粒子照射后继续传代培养10代；依此累计α粒子照射4次、传代培养40代；

13、实验组beas-2b细胞模型命名为2b-xgy(y)-z，其中，x代表α粒子照射剂量数，y代表α粒子照射次数，z代表传代培养代数；

14、以未进行α粒子照射、且传代培养相同代数的beas-2b细胞为对照组。

15、进一步，步骤s13中，确证实验组beas-2b细胞模型构建成功的方法为：

16、与对照组beas-2b细胞相比，实验组beas-2b细胞诱发人支气管上皮细胞增殖速率升高；使细胞周期呈现从g1期快速向s期转化的趋势；诱导emt相关蛋白e-cadherin的下调表达和vimentin、vegfa、tgf-β的上调表达。

17、进一步，步骤s13中，还包括如下步骤：

18、根据危害因素暴露的持续性及暴露剂量的差异性，构建α粒子照射致人支气管上皮细胞早期损伤模型、α粒子照射致人支气管上皮细胞晚期损伤模型。

19、进一步，步骤s2包括如下具体步骤：

20、s21、提取各实验组细胞总rna、对照组细胞总rna并分别进行基因芯片检测分析，利用genespring12.5软件对各实验组细胞、对照组细胞进行quantile标准化和后续处理；标准化后的数据进行过滤，在用于比较的每组样本中至少有1组100％标记为detected的探针留下进行后续分析；

21、s22、根据各实验组中所有rna相对于对照组的上调或者下调差异倍数变化值，进行差异基因筛选。

22、进一步，所述差异基因筛选的标准为：

23、上调或者下调差异倍数变化值≥2.0。

24、进一步，步骤s3包括如下具体步骤：

25、s31、采用外周血mirna提取试剂盒提取多名铀矿井下作业人员外周血mirna样本为辐射照射实验组，多名铀矿地面工作人员外周血mirna样本为辐射照射对照组，辐射照射实验组的mirna样本、辐射照射对照组的mirna样本经琼脂糖凝胶电泳及nanodrop进行质检定量；

26、s32、按逆转录试剂盒说明书反转录cdna，取适量辐射照射实验组的样本cdna和辐射照射对照组的样本cdna，分别对mirna前体分子靶标nr_029854基因进行pcr验证。

27、本发明的有益效果在于：采用本发明所提供的mirna前体作为氡暴露诊断分子标志物的应用及其筛选方法，利用nr_029854作为氡暴露诊断的分子标志物，既能反应人支气管上皮细胞早期损伤，又在人支气管上皮细胞晚期损伤中持续差异表达。本发明通过α粒子照射装置对实验组人支气管上皮细胞beas-2b进行分次累积照射，根据照射后实验组细胞增殖活力、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭等生物学指标检测，成功构建α粒子分次累积照射致人支气管上皮细胞beas-2b损伤模型；然后，通过筛选第二次累积照射和第四次累积照射实验组细胞模型作为α粒子照射不同损伤阶段的模型细胞，利用基因芯片探讨α粒子累积照射对人支气管上皮细胞beas-2b转录组表达的影响，并通过α粒子照射不同损伤阶段的模型细胞中差异表达rna分子的比较筛查，确定α粒子照射诱发人支气管上皮细胞损伤潜在分子靶标nr_029854；最后，通过pcr验证确认mirna前体分子nr_029854基因作为分子标志物用于氡暴露辐射早期损伤诊断的可行性。采用本发明提供的nr_029854作为氡暴露诊断的分子标志物，能够便捷、准确、定量的进行辐射暴露诊断。