一种基于镧盐混凝剂预处理的水中诺如病毒的检测方法

本发明涉及一种基于镧盐混凝剂预处理的水中诺如病毒的检测方法，涉及饮用水、地表水、地下水和污水等水质监测领域。

背景技术：

1、诺如病毒(norovirus，nov)又称诺瓦克病毒，隶属杯状病毒科，颗粒呈20面体对称的球形，直径为27-35nm，无囊膜，表面粗糙。基于其衣壳蛋白核酸序列的不同，诺如病毒可以分为6个不同的基因型(gⅰ～gⅴi)，其中gⅰ型和gⅱ型通常感染人类。诺如病毒是引起人类病毒性胃肠炎的主要病原微生物之一，10～100个病毒颗粒就能造成感染。研究表明，水源污染是诺如病毒传播感染的重要方式，检测诺如病毒最常用的方法为反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)，该方法需要至少5个拷贝的模板量，然而自然水体中诺如病毒的含量通常较低，经核酸提取后模板量低于rt-pcr检测下限，无法进行检测，对诺如病毒疫情防控及溯源造成了一定的困难，因此建立一种准确、灵敏、快速的水中诺如病毒检测方法非常必要。

2、本发明的水中诺如病毒检测方法主要包括四个步骤：水样浓缩、病毒释放、核酸提取和病毒定量。

3、水样浓缩是水中诺如病毒检测的关键环节。诺如病毒在水中的含量通常较低，必须对大体积水样进行富集浓缩。目前对诺如病毒的富集浓缩主要有以下几种方法：膜吸附洗脱法、超速离心法、peg沉淀浓缩法等。美国环境保护署(usepa)推荐使用的水样浓缩方法为膜吸附洗脱法(epamethod 1615measurement ofenterovirus and norovirusoccurrence in water by culture andrt-qpcr)，该方法灵敏度高(地表水：2copies/l，地下水：0.4copies/l)，但滤膜依赖进口且价格昂贵，价格及供货渠道易受国外限制，同时因滤膜洗脱效率差异也会造成病毒回收率不稳定；国际标准化组织推荐peg沉淀浓缩法(iso15216-1:2017)用于食品中诺如病毒浓缩，该方法也常被用于水样中病毒的分离浓缩，但该方法试剂消耗量大(100g/lpeg)，灵敏度低(1000copies/ml)，对仪器要求较高，需要高速离心设备(高达10000g)。而我国尚缺乏针对水中诺如病毒的检测方法，因此本发明建立了一种基于混凝剂预处理的水中诺如病毒的检测方法，混凝剂包括有机混凝剂和无机混凝剂，有机混凝剂比如脱脂牛奶，也常被用于水中病毒的富集，但有机混凝剂耗时较长，不利于水中诺如病毒快速预警，本发明选择无机混凝剂进行混凝处理，原理是向水中加入无机混凝剂，混凝剂水解产生带正电的氢氧化物胶体，调节溶液ph值大于诺如病毒等电点(5.5-6.9)，此时诺如病毒释放质子带负电，带正电的絮体通过吸附电中和作用与带负电荷的病毒颗粒结合脱稳形成絮体，从水中沉降分离出来，从而实现水中诺如病毒的富集。常用的无机混凝剂包括：铝盐、铁盐等，为获得更好的混凝效果，本发明选用镧盐作为混凝剂，相比于铝盐(核电荷数13)和铁盐(核电荷数26)，镧作为一种稀土元素，其金属离子核电荷较高(核电荷数57)，通过吸附电中和作用与表面带负电的颗粒结合脱稳聚集的速率更块，而且镧外层的不饱和结构使其具有活跃的配位作用，能形成[la(oh)m(h2o)n](3-m)+配合物，具有较强的络合力，能络合大量羟基形成链状结构，随着水解的不断进行，链状结构不断增长，加大了絮体体积(显微镜照片如附图1)，增强了絮体对病毒颗粒的卷扫网捕能力，从而获得更好的絮凝效果，本发明选用镧盐作为混凝剂有利于提高诺如病毒的富集效率。

4、病毒释放是水样通过混凝沉淀法富集后的必要步骤，由于被包裹到絮体中的诺如病毒不能直接被检测，因此需要将病毒释放。病毒释放的方法主要有研磨法和加入释放剂的方法，epa1615方法中使用的牛肉浸膏属于洗脱剂，不能溶解la(oh)3絮体，无法将病毒有效释放，而研磨法操作繁琐、耗时较长，并且回收效率较低，因此本发明选用加入释放剂的方法，即选用金属螯合剂乙二胺四乙酸二钠(edta·2na)作为释放剂，edta·2na能螯合la(oh)3絮体中的金属镧离子，生成溶于水的螯合物，使絮体溶解，将包裹在絮体中的诺如病毒释放出来。

5、病毒提取方法主要包括硅胶柱法、trizol法和磁珠法：硅胶柱法提取效率高，但成本也较高；trizol法较为经济，但操作复杂且重复性低；磁珠法在保证提取效率的同时可节省大量人力物力，因此本发明采用磁珠法进行诺如病毒核酸提取。诺如病毒裂解后核酸释放，通过结合液(高浓度盐溶液)中的阳离子将核酸骨架上的负电基团与磁珠外层负电基团连接起来，形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，将诺如病毒核酸结合到磁珠表面，通过磁铁固定携带病毒核酸的磁珠后，用漂洗液去除蛋白质等杂质，加入低盐溶液破坏盐桥结构进而将病毒核酸从磁珠上洗脱下来，获得诺如病毒提取液。

6、病毒定量的方法为rt-pcr法，诺如病毒核酸在反转录酶的作用下反转录为cdna，再以cdna链为模板进行扩增，经过变性(cdna链打开)、退火(引物结合到cdna单链上)和延伸(taq酶合成新的dna链)过程扩增目的基因，通过标准曲线对诺如病毒核酸进行定量。

7、综上所述，本发明能够有效富集水中诺如病毒，并结合高效分子生物学检测技术，建立水中诺如病毒准确、灵敏、快速的检测方法，该方法操作简便，检出限低，回收率高。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决国内尚无水中诺如病毒检测方法，而国际上的水中诺如病毒检测存在技术垄断，设备耗材依赖进口，耗时长，效率低、成本高等问题，提供一种基于混凝剂预处理的水中诺如病毒检测方法。

2、为实现目的，本发明建立了一种水中高灵敏度的诺如病毒检测方法，采用镧盐做混凝剂，调节ph产生絮凝沉淀，絮体溶解后进行水中诺如病毒富集，将病毒富集液进行核酸提取后可采用荧光定量pcr进行定量，该方法回收率高于epa1615规定限值(5％)。

3、技术方案如下：

4、1)向水样中加入镧盐混凝剂，充分混合均匀；

5、2)加入ph调节剂，使水样最终ph值大于6，产生絮凝，振荡混凝之后进行固液分离处理，获得包裹诺如病毒的絮凝沉淀物；

6、3)向所得沉淀中加入金属螯合剂，混合均匀，沉淀溶解，病毒释放，获得诺如病毒富集液；

7、4)取一定体积的诺如病毒富集液进行核酸提取及核酸定量。

8、其中，步骤1)所述待测水样为饮用水、地表水、地下水和生活污水。

9、特别是，所述镧盐混凝剂为氯化镧，所述镧盐混凝剂添加至水样中后，镧离子的浓度为0.0015-0.1m，优选为0.003m。

10、其中，本方法适用于ph值高于6的水样，步骤2)中若测定的水的ph值高于6，则不需要进行ph调节；如果测定的水的ph值低于6，则添加ph调节剂，调整水的ph值高于6，优选为8。ph调节剂为盐酸或氢氧化钠溶液，优选为1m盐酸溶液或氢氧化钠溶液。

11、混凝处理的时间为至少5min，优选为10-20min，将调节ph值后的水样置于摇床中，在转速为100-200rpm的条件下混合至少5min，优选为10-20min。

12、其中，所述固液分离处理方式为离心，离心条件为4℃，1900g，5min，固液分离处理后，弃去上清液，获得包裹诺如病毒的沉淀。

13、其中，步骤3)所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，所述螯合剂的用量为0.1g，加入金属螯合剂后进行加热处理，促进絮体溶解释放诺如病毒，加热处理温度为50-60℃，优选60℃；加热处理时间为5-10min，优选为10min。

14、其中，步骤4)所述核酸提取方法为磁珠法，核酸提取过程按照核酸提取试剂盒的操作方法进行。

15、其中，步骤4)中所述核酸定量方法选择荧光定量pcr法。

16、其中，荧光定量pcr法测定过程中，分别以质粒浓度的10底对数和对应的扩增ct值为横纵坐标绘制标准曲线，代入诺如病毒提取液的扩增ct值获得诺如病毒核酸浓度，然后计算样品中诺如病毒回收率。