融合蛋白疫苗的制作方法

本发明属于疫苗领域，具体地涉及蛋白疫苗及其应用。

背景技术：

1、亚单位疫苗是一种含有纯化的病原体抗原部分，或引起保护性免疫反应所必需的部分的疫苗。亚单位疫苗不像减毒活疫苗或灭活疫苗那样包含全部病原体，而只包含抗原部分，如蛋白质、多糖或肽。由于该疫苗不包含病原体的“活”成分，因此不存在引入该疾病的风险，而且比含有完整病原体的疫苗更安全、更稳定。亚单位疫苗的其他优势包括成熟的技术和适用于免疫功能低下的个体。蛋白疫苗是亚单位疫苗中的一种，含有从病原体(病毒或细菌)中分离出来的蛋白质。重组蛋白疫苗，是将病原体的某个关键片段，整合到细菌、酵母、动物或昆虫细胞中，在体外大量培养，然后收集纯化后添加佐剂制成疫苗。重组蛋白亚单位疫苗仅有病原体主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病。

2、重组蛋白疫苗的缺点之一是免疫原性较低。重组蛋白疫苗中使用的特定抗原可能缺乏病原体常见的病原体相关的分子结构。这些分子结构可以被免疫细胞用来识别危险，所以没有它们，免疫反应会更弱。重组蛋白疫苗的缺点之二是缺乏细胞免疫应答。重组蛋白亚单位疫苗不会感染细胞，其诱导的免疫反应主要是抗体介导的体液免疫应答，而缺乏重要的细胞免疫应答，不利于有效的清除病原体和长期的免疫保护。为了增强重组蛋白疫苗的免疫原性，亚单位疫苗需要配合佐剂使用。这不仅增加了重组蛋白疫苗对佐剂的依赖，同时也提高了疫苗免疫程序的复杂性以及疫苗的商用成本。

技术实现思路

1、本发明提供了免疫效果增强的融合蛋白疫苗，所述融合蛋白疫苗包含抗原结构域和免疫细胞靶向结构域。本发明的免疫效果增强的融合蛋白疫苗具有增强的免疫效果，增强了重组蛋白疫苗诱导的免疫应答，降低重组蛋白疫苗对佐剂的依赖性。

2、第一方面，本发明提供了含有抗原结构域和免疫细胞靶向结构域的融合蛋白。

3、所述免疫细胞靶向结构域为选自如下的一种或多种结构域：

4、结构域a：能够结合免疫细胞表面蛋白的抗体或多肽或其活性片段；

5、结构域b：能够激活免疫细胞的细胞因子或其活性片段；

6、结构域c：能够激活免疫细胞的pan表位(padre)或其活性片段；

7、结构域d：能够结合免疫细胞的免疫球蛋白fc。

8、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含抗原结构域和结构域a；抗原结构域与结构域a和结构域b的融合蛋白；抗原结构域与结构域a，结构域b和结构域c的融合蛋白；抗原结构域与结构域a，结构域b，结构域c和结构域d的融合蛋白；抗原结构域与结构域b的融合蛋白；抗原结构域与结构域b和结构域c的融合蛋白；抗原结构域与结构域b，结构域c和结构域d的融合蛋白；抗原结构域与结构域c的融合蛋白；抗原结构域与结构域c和结构域d的融合蛋白；或抗原结构域与结构域d的融合蛋白。

9、所述融合蛋白可以是抗原结构域与结构域a和/或结构域b和/或结构域c和/或结构域d的任意排列方式，例如，所述融合蛋白中抗原结构域和/或结构域a和/或结构域b和/或结构域c和/或结构域d相对于彼此位于c端或者n端。

10、所述结构域a包括但不限于针对cd274(pdl1)，pdcd1lg2(pdl2)，clec9a，ly75(dec205)，cd40，tnfsf9(4-1bb-l)和/或tnfsf4(ox4ol)的抗体，或其配体的活性片段。

11、所述结构域b包括但不限于白介素(interleukin，il)和/或集落刺激因子(colony-stimulating factor，csf)，或其活性片段。

12、优选地，所述白介素包括il2，il12，il15和/或il21，或其活性片段。

13、优选地，所述集落刺激因子包括csf1，csf2和/或csf3，或其活性片段。

14、优选地，所述结构域c具有akfvaawtlkaaa所示的氨基酸序列。

15、所述结构域d可以为来自igg，igm，iga，ige或igd的fc或其突变体，所述fc为突变体以形成异源二聚体蛋白。在一些实施方案中，所述fc是经修饰的fc，例如二聚体的两个fc结构域分别具有fc knob修饰和fc hole修饰。

16、在一些实施方案中，所述抗原结构域(antigen)可以为能够诱导针对病原微生物的免疫反应的免疫原性蛋白或其免疫原性片段。

17、所述病原微生物可以为sars-cov-2，sars，巨细胞病毒cmv，疱疹病毒，呼吸道合胞病毒rsv，流感病毒，ebola病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒ebv，登革热病毒，zike病毒，hiv病毒，狂犬病毒，疟原虫配子体，带状疱疹病毒hzv，乙肝病毒hbv，丙型肝炎病毒hcv，丁肝病毒hdv，hpv，结核分枝杆菌，幽门螺旋杆菌等。

18、所述抗原结构域可以为能够诱导针对癌症细胞的免疫反应的免疫原性蛋白，或其免疫原性片段。

19、在一些实施方案中，所述抗原结构域可以为肿瘤抗原结构域，例如melana/mart1、癌-种系抗原、gp100、酪氨酸酶、cea、psa、her-2/neu、存活蛋白、端粒酶，或其免疫原性片段。

20、在一些实施方案中，所述抗原结构域与免疫细胞靶向结构域之间，和/或免疫细胞靶向结构域之间可以通过连接片段进行连接。

21、在一些实施方案中，所述连接片段可以是柔性连接片段、刚性连接片段或体内剪切连接片段。其中柔性连接片段的氨基酸序列可以是(g)n，(gs)n，(ggs)n，(gggs)n，或(ggggs)n。

22、在一些实施方案中，所述融合蛋白是同源二聚体或异源二聚体。

23、在一些实施方案中，所述融合蛋白包含抗原结构域和结构域d，所述融合蛋白构成类似抗体形式的同源二聚体或异源二聚体。所述融合蛋白由两个fc结构域的二硫键构成同源二聚体或异源二聚体。优选地，所述融合蛋白包括第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包括抗原结构域和结构域d，所述第二多肽链包括抗原结构域和结构域d。所述第一多肽链与所述第二多肽链经第一多肽链的结构域d和所述第二多肽链的结构域d的二硫键连接形成同源二聚体或异源二聚体。优选地，所述第一多肽链还包括结构域b和/或结构域c，所述第二多肽链还包括结构域b和/或结构域c。例如，所述第一多肽链还包括结构域b，所述第二多肽链还包括结构域b，从而构成同源二聚体。或者，所述第一多肽链还包括结构域b，所述第二多肽链还包括结构域c，从而构成异源二聚体，反之亦然。所述抗原结构域和/或结构域b和/或结构域c可以连接在结构域d的c端或n端。例如，所述第一多肽链还包括结构域b和结构域c，所述第二多肽链还包括结构域b和结构域c，从而构成同源二聚体。

24、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域a，从而构成同源二聚体，反之亦然。

25、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域b，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域b，从而构成同源二聚体，反之亦然。

26、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域a，从而构成同源二聚体，反之亦然。

27、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域b，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域b，从而构成同源二聚体，反之亦然。

28、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域b，结构域d，抗原结构域，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域b，结构域d，抗原结构域，结构域a，从而构成同源二聚体。

29、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域b，结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域b，结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域a，从而构成同源二聚体，反之亦然。

30、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域b，从而构成异源二聚体，反之亦然。

31、或者，所述第一多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域a，所述第二多肽链从c端至n端包括结构域d，抗原结构域，结构域c，结构域b，从而构成异源二聚体，反之亦然。

32、优选地，在异源二聚体的情况下，结构域d分别具有fc knob修饰和fc hole修饰。

33、所述抗原结构域与所述免疫细胞靶向结构域可以用任意形式排列组合。所述抗原结构域与所述免疫细胞靶向结构域a，结构域b，结构域c，结构域d可以任意形式排列组合。

34、抗原与免疫细胞靶向分子a可以任意形式排列组合。抗原与免疫细胞靶向分子b可以用任意形式排列组合。抗原与免疫细胞靶向分子c可以用任意形式排列组合。

35、在一些实施方案，所述融合蛋白具有选自如下的结构：

36、αpdl1-antigen-fc；

37、clec9a binding peptide-antigen-fc；

38、αdec205-antigen-fc；

39、antigen-fc-clec9a binding peptide；

40、αpdl1-linker-antigen-linker-fc；

41、αpdl1-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

42、clec9a binding peptide-linker-antigen-linker-fc；

43、clec9a binding peptide-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

44、αdec205-linker-antigen-linker-fc；

45、αdec205-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

46、antigen-linker-fc-linker-clec9a binding peptide；

47、antigen-(g)3-fc-(gs)3-clec9a binding peptide；

48、il2-antigen-fc；

49、il12-antigen-fc；

50、il15-antigen-fc；

51、il21-antigen-fc；

52、csf2-antigen-fc；

53、antigen-fc-csf2；

54、il2-linker-antigen-linker-fc；

55、il2-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

56、il12-linker-antigen-linker-fc；

57、il12-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

58、il15-linker-antigen-linker-fc；

59、il15-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

60、il21-linker-antigen-linker-fc；

61、il21-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

62、csf2-linker-antigen-linker-fc；

63、csf2-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc；

64、antigen-linker-fc-linker-csf2；

65、antigen-(ggggs)3-fc-(g)3-csf2；

66、αpdl1-pan-antigen-fc；

67、clec9a binding peptide-pan-antigen-fc；

68、αdec205-pan-antigen-fc；

69、αpdl1-linker-pan-antigen-linker-fc；

70、αpdl1-(ggggs)3-pan-antigen-(g)3-fc；

71、clec9a binding peptide-linker-pan-antigen-linker-fc；

72、clec9a binding peptide-(ggggs)3-pan-antigen-(g)3-fc；

73、αdec205-linker-pan-antigen-linker-fc；

74、αdec205-(ggggs)3-pan-antigen-(g)3-fc；

75、il2-pan-antigen-fc；

76、il12-pan-antigen-fc；

77、il15-pan-antigen-fc；

78、il21-pan-antigen-fc；

79、csf2-pan-antigen-fc；

80、pan-antigen-fc-csf2；

81、il2-linker-pan-linker-antigen-(g)3-fc；

82、il2-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-linker-fc；

83、il12-linker-pan-linker-antigen-linker-fc；

84、il12-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc；

85、il15-linker-pan-linker-antigen-linker-fc；

86、il15-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc；

87、il21-linker-pan-linker-antigen-linker-fc；

88、il21-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc；

89、csf2-linker-pan-linker-antigen-linker-fc；

90、csf2-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc；

91、pan-linker-antigen-linker-fc-linker-csf2；

92、pan-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-csf2；

93、αpdl1-antigen-fc-il12；

94、αpdl1-antigen-fc-il21；

95、αpdl1-antigen-fc-csf2；

96、clec9a binding peptide-antigen-fc-il12；

97、clec9a binding peptide-antigen-fc-il21；

98、clec9a binding peptide-antigen-fc-csf2；

99、αpdl1-linker-antigen-linker-fc-linker-il12；

100、αpdl1-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il12；

101、αpdl1-linker-antigen-linker-fc-linker-il21；

102、αpdl1-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il21；

103、αpdl1-linker-antigen-linker-fc-linker-csf2；

104、αpdl1-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-csf2；

105、clec9a binding peptide-linker-antigen-linker-fc-linker-il12；

106、clec9a binding peptide-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il12；

107、clec9a binding peptide-linker-antigen-linker-fc-linker-il21；

108、clec9a binding peptide-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il21；

109、clec9a binding peptide-linker-antigen-linker-fc-linker-csf2；

110、clec9a binding peptide-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-csf2；

111、αpdl1-pan-antigen-fc-il12；

112、αpdl1-pan-antigen-fc-il21；

113、αpdl1-pan-antigen-fc-csf2；

114、clec9a binding peptide-pan-antigen-fc-il12；

115、clec9a binding peptide-pan-antigen-fc-il21；

116、clec9a binding peptide-pan-antigen-fc-csf2；

117、αpdl1-csf2-pan-antigen-fc；

118、αpdl1-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-il12；

119、αpdl1-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il12；

120、αpdl1-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-il21；

121、αpdl1-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il21；

122、αpdl1-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-csf2；

123、αpdl1-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-csf2；

124、clec9a binding peptide-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-il12；

125、clec9a binding peptide-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il12；clec9a binding peptide-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-il21；

126、clec9a binding peptide-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-il21；clec9a binding peptide-linker-pan-linker-antigen-linker-fc-linker-csf2；

127、clec9a binding peptide-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc-(gs)3-csf2；αpdl1-linker-csf2-linker-pan-linker-antigen-linker-fc；

128、αpdl1-(ggggs)3-csf2-(gs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc；

129、αpdl1-antigen-fc knob/csf2-antigen-fc hole；

130、clec9a binding peptide-antigen-fc knob/csf2-antigen-fc hole；

131、αpdl1-linker-antigen-linker-fc knob/csf2-linker-antigen-linker-fchole；

132、αpdl1-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc knob/csf2-(ggggs)3-antigen-(g)3-fchole；

133、clec9a binding peptide-linker-antigen-linker-fc knob/

134、csf2-linker-antigen-linker-fc hole；

135、clec9a binding peptide-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc knob/

136、csf2-(ggggs)3-antigen-(g)3-fc hole；

137、αpdl1-pan-antigen-fc knob/csf2-pan-antigen-fc hole；

138、clec9a binding peptide-pan-antigen-fc knob/csf2-pan-antigen-fc hole；αpdl1-linker-pan-linker-antigen-linker-fc knob/

139、csf2-linker-pan-linker-antigen-linker-fc hole；

140、αpdl1-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc knob/

141、csf2-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc hole；

142、clec9a binding peptide-linker-pan-linker-antigen-linker-fc knob/csf2-linker-pan-linker-antigen-linker-fc hole；

143、clec9a binding peptide-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc knob/

144、csf2-(ggggs)3-pan-(gs)3-antigen-(g)3-fc hole。

145、在一些实施方案中，所述抗原结构域为sars-cov-2的s蛋白或其片段。优选地，所述s蛋白为预融合稳定的s蛋白。在一些实施方案中，所述预融合稳定的s蛋白包含双脯氨酸(s2p)突变或六脯氨酸(s6p)突变。

146、在一些实施方案中，所述抗原结构域为sars-cov-2的s蛋白的rbd结构域。

147、本发明的融合蛋白可以作为重组蛋白疫苗。

148、第二方面，本发明提供了用于编码第一方面的融合蛋白的核酸分子。

149、第三方面，本发明提供了用于表达第一方面的融合蛋白或包含第二方面的核酸分子的载体。

150、所述载体可以为质粒载体，腺病毒载体或慢病毒载体。

151、第四方面，本发明提供了用于表达第一方面的融合蛋白或包含第二方面的核酸分子，或第三方面的载体的宿主细胞。

152、所述宿主细胞可以为例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)，幼年仓鼠肾细胞(bhk细胞)，cos细胞，小鼠nso胸腺瘤细胞，小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0细胞)，人胚胎肾细胞hek293细胞。

153、第五方面，本发明提供了含有第一方面的融合蛋白，或第二方面的核酸分子，或第三方面的载体，或第四方面的宿主细胞的组合物。

154、在一些实施方案中，所述组合物不包含可药用佐剂。

155、在一些实施方案中，所述组合物还包含可药用佐剂。所述可药用佐剂包括但不限于铝佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝，或cpg佐剂。

156、第六方面，本发明提供了用于预防或治疗与病原微生物感染或肿瘤的方法，所述方法包括向对象给药第一方面的融合蛋白，第二方面的核酸分子，第三方面的载体，第四方面的宿主细胞或第五方面的组合物的步骤。

157、所述对象为人类或动物。所述动物包括但不限于牛，羊，猫，犬，马，兔，猴，小鼠，大鼠，羊驼，骆驼等。

158、在一些实施方案中，所述对象为免疫功能低下的人或动物。

159、在一些实施方案中，所述对象患有慢性肺病，例如慢性阻塞性肺疾病或哮喘。

160、在一些实施方案中，所述患者患有基础疾病，例如心脏病，糖尿病或肺病。

161、第七方面，本发明提供了第一方面的融合蛋白，第二方面的核酸分子，第三方面的载体，第四方面的宿主细胞或第五方面的组合物在制备用于预防或治疗对象与病原微生物感染或肿瘤相关的药物中的应用。

162、所述对象为人类或动物。所述动物包括但不限于牛，羊，猫，犬，马，兔，猴，小鼠，大鼠，羊驼，骆驼，鸡，鸭，鹅，等。

163、在一些实施方案中，所述对象为免疫功能低下的人或动物。

164、在一些实施方案中，所述对象患有慢性肺病，例如慢性阻塞性肺疾病或哮喘。

165、在一些实施方案中，所述患者患有基础疾病，例如心脏病，糖尿病或肺病。

166、所述癌症可以为前列腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肾细胞癌，脑癌，黑色素瘤，急性髓细胞性白血病，胰腺癌，结直肠癌，头颈部鳞状细胞癌，皮肤鳞状细胞癌，腺样囊性癌，胶质母细胞瘤，乳腺癌，间皮瘤，卵巢癌，神经胶质瘤，膀胱癌，肝癌，骨癌，骨髓癌，胃癌，甲状腺癌，淋巴癌，宫颈癌，子宫内膜癌，喉癌，急性淋巴细胞性白血病等。

167、在一些实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包括但不限于5t4,aim2,akap4 2,art-4,auraa1(aurka),aura b1(aurkb),bage,bcan,b-周期素,bsg,ccnd1,cd133,cdc45l,cdca1(ttk),cea,chi3l2(几丁质酶3样2),cspg4,epcam4,epha2,ephx1,ezh2,fabp7,fosl1(fra-1),gage,galt-3,g250(ca9),gbk,glast,gnt-v,gp100,hb-egf,her2,hnprl,ho-1,htert,igf2bp3,il13-ra2,imp-3,iqgap1,itgav,kif1c,kif20a,kif21b,kifc3,kk-lc-1,lage-1,lck,lrrc8a,mage-1(magea1),mage-2(magea2b),mage-3,mage-4,mage-6,mage-10,mage-12,mage-c1(ct7),mage-c2,mage-c3,mart-1,melk,mrp3,muc1,napsa,nlgn4x,nrcam,ny-eso-1(ctag1b),ny-sar-35,ofa/ilrp,pcna,pik3r1,prame,prkdc,pth-rp,ptprz1,pttg1 2,prkdc,ran,rgs1,rgs5,rhamm(rhamm-3r),rpl19,sart-1,sart-2,sart-3,sec61g,sgt-1,sox2,sox10,sox11,sp17,spanx-b,sqstm1,s.s.x-2,stat1,stat3,生存素,tara,tnc,trag-3,trp-1,trp2,酪氨酸酶,urlc10(ly6k),ube2v,wt1,xage-1b(gaged2a),ykl-40(chi3l1),acrbp,scp-1,s.s.x-1,s.s.x-4,ny-tlu-57,caix,brachyury,ny-br-1,erbb,间皮素,egfrviii,il-13ra2,msln,gpc3,fr,psma,gd2,l1-cam,vegfr1,vegfr2,koc1,ofa,sl-701,突变体p53,depdc1,mphosph1,ont-10,gd2l,gd3l,tf,pap,brca1 dlc1,xpo1,hif1a,adam2,calr3,sage1,scp-1,ppmapkkk,whsc,突变体ras,cox1,cox2,foxp3,ido1,ido2,tdo,pdl1,pdl2和pge2。

168、在一些实施方案中，所述抗原包括但不限于与任何肿瘤/癌症有关的抗原，例如肺癌(mtfr2 d326y,chtf18 l769v,myadm r30w,herc1 p3278s,fam3c k193e,csmd1g3446e,slc26a7 r117q,pgap1 y903f,helb p987s,ankrd k603t)；黑色素瘤(tmem48f169l,tktr438w,sec24a p469l,akap13 q285k,exoc8 q656p,pabpc1 r520q,mrps5p59l,abcc2s1342f,sec23a p52l,sytl4 s363f,map3k9 e689k,akap6 m1482i,rpbmp42l,hcapg2p333l,h3f3c t4i,gabpa e161k,sept2 q125r,srpx p55l,wdr46t300i,prdx3 p101l,helz2 d614n,gcn1l1 p769l,afmid a52v,plscr4r247c,cenpl p79l,tpx2h458y,sec22ch218y,pola2 l420f,slc24a5 mut)；间皮瘤(notch2 g703d,pde4dipl288m,bap1 v523fs,atp10b e210k,nsd1 k2482t)；胶质瘤/胶质母细胞瘤(idh1 r132h,pole l424v)；乳腺癌(mpalb2,mrobo3,mzdhhc16,mptprs,rbpj h204l)；胆管癌((erbb2ipe805g)；和宫颈癌(mapk1 e322k,pik3ca e545k,pik3ca e542k,ep300 d1399n,erbb2s310f,erbb3 v104m,kras g12d)。

169、所述病原微生物相关的疾病包括但不限于：获得性免疫缺陷综合症(aids)(人类免疫缺陷病毒(hiv))；阿根廷提根热(argentineteagan fever)(junin病毒)；星状病毒感染(星状病毒科)；bk病毒感染(bk病毒)；玻利维亚出血热(machupo病毒)；巴西出血热(sabiá病毒)；水痘(水痘带状疱疹病毒(vzv))；基孔肯雅热(chikungunya)(甲病毒)；科罗拉多蜱传热(colorado tick fever)(ctf)(科罗拉多蜱传热病毒(colorado tick fever virus)(ctfv))；普通感冒，急性病毒性鼻咽炎，急性鼻炎(通常是鼻病毒和冠状病毒)；巨细胞病毒感染(巨细胞病毒)；登革热(登革热病毒(den-1，den-2，den-3和den-4)和其他黄病毒，包括但不限于西尼罗河病毒(西尼罗河热)，黄热病病毒(黄热病)；寨卡病毒(寨卡热)和蜱传脑炎病毒；埃博拉出血热(埃博拉病毒(ebov))；肠病毒感染(肠病毒种)；感染性红斑病(第五种病)(细小病毒b19)；幼儿急疹(exanthemsubitum)(第六种病)(人类疱疹病毒6(hhv-6)和人类疱疹病毒7(hhv-7))；手足口病(hfmd)(肠病毒，主要是柯萨奇a病毒和肠病毒71(ev71))；汉坦病毒肺综合征(hantaviruspulmonary syndrome，hps)(sin nombre病毒)；甲型肝炎(甲型肝炎病毒)；乙型肝炎(乙型肝炎病毒)；丙型肝炎(丙型肝炎病毒)；丁型肝炎(丁型肝炎病毒)；戊型肝炎(戊型肝炎病毒)；单纯疱疹(单纯疱疹病毒1和2(hsv-1和hsv-2))；人博卡病毒感染(人博卡病毒(hbov))；人间质性肺炎病毒感染(人间质性肺炎病毒(hmpv))；人乳头瘤病毒(hpv)感染(人乳头瘤病毒(hpv))；人副流感病毒感染(人副流感病毒(hpiv))；爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症(mono)(爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv))；人流感病毒(甲型流感，包括但不限于h1n1，h2n2，h3n2，h5n1，h7n9，乙型流感和正黏病毒科的其他成员)；拉沙热(拉沙病毒)；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv))；马尔堡出血热(mhf)(马尔堡病毒)；麻疹(麻疹病毒)；中东呼吸综合征(mers)(中东呼吸综合征冠状病毒)；传染性软疣(mc)(传染性软疣病毒(mcv))；猴痘(猴痘病毒)；流行性腮腺炎(流行性腮腺炎病毒)；诺如病毒(norovirus)(儿童和婴儿)(诺如病毒)；脊髓灰质炎(脊髓灰质炎病毒)；进行性多灶性白质脑病(jc病毒)；狂犬病(狂犬病病毒)；呼吸道合胞病毒感染(呼吸道合胞病毒(rsv))；鼻病毒感染(鼻病毒)；裂谷热(rvf)(裂谷热病毒)；轮状病毒感染(轮状病毒)；风疹(风疹病毒)；带状疱疹(shingles)(带状疱疹(herpes zoster))(水痘带状疱疹病毒(vzv))；天花(smallpox)(天花(variola))(大天花或小天花)；亚急性硬化性全脑炎(麻疹病毒)；委内瑞拉马脑炎(委内瑞拉马脑炎病毒)；委内瑞拉出血热(瓜纳里托病毒)；病毒性肺炎。

170、本发明的重组蛋白疫苗具有提高的免疫原性，增强的免疫应答，同时降低了重组蛋白疫苗对佐剂的依赖性。

171、该蛋白疫苗中抗原融合表达的设计同样可以应用于其它类型的疫苗，包括但不限于核酸疫苗(如mrna疫苗、环状rna疫苗和dna疫苗等)，病毒载体疫苗(如腺病毒载体疫苗和流感病毒载体疫苗等)，以及纳米颗粒疫苗等。

172、本发明显示了：

173、(1)游离的rbd蛋白免疫原性较弱，当在rbd的基础上加上fc部分时其免疫原性得到了提升，当在rbd-fc的基础上加上细胞因子il12和pan时其免疫原性得到了进一步的提升，当在rbd-fc的基础上加上细胞因子il21和pan时其免疫原性得到了进一步的提升，当在rbd-fc的基础上加上细胞因子csf2和pan时其免疫原性得到了进一步的提升，当在rbd-fc的基础上加上能够结合免疫细胞表面蛋白pdl1的αpdl1抗体和pan时其免疫原性得到了进一步的提升；

174、(2)游离的rbd蛋白免疫原性较弱，当在rbd的基础上加上fc部分时可提高抗体滴度，当在rbd-fc的基础上加上细胞因子csf2时可进一步提高抗体滴度，当在rbd-fc的基础上加上能够结合免疫细胞表面蛋白pdl1的αpdl1抗体时也可进一步提高抗体滴度；

175、(3)游离的gp350蛋白疫苗免疫原性较弱，当在gp350-fc的基础上加上细胞因子csf2时可提高抗体滴度，当在gp350-fc的基础上加上能够结合免疫细胞表面蛋白pdl1的αpdl1抗体时可提高抗体滴度，当在gp350-fc的基础上加上细胞因子csf2和pan时可提高抗体滴度，当在gp350-fc的基础上加上能够结合免疫细胞表面蛋白pdl1的αpdl1抗体和pan时可提高抗体滴度。