一种卡利比克迈耶氏酵母及其应用的制作方法

本发明涉及一种新型的卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica），还涉及该卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）在余甘子果发酵中的应用以及所得的余甘子果发酵产品在化妆品中的应用，属于生物发酵。

背景技术：

0、技术背景

1、余甘子，中药名，为大戟科植物余甘子phyllanthusemblical.的果实，富含丰富的多种维生素，供食用，可生津止渴、润肺化痰、治咳嗽、喉痛、解河豚鱼中毒等。余甘子初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”，其树根和叶供药用，能解热清毒，治皮炎、湿疹、风湿痛等。余甘子临床使用历史悠久且安全性好，在很多医书中均有记载，如《新修本草》：“主风虚热气”；《本草拾遗》：“主补益，强气力”；《海药本草》：“主丹石伤肺，上气咳嗽。久服轻身，延年长生”；《本草衍义》：“解金石毒，为末作汤点服”；《福建中草药》：“消食化滞。治食积呕吐，腹痛，泄泻”。余甘子收载于《中国药典》，属于藏族习用药，主治培根病、赤巴病、血病、高血压病等。近年研究结果表明，余甘子具有抗炎，抗氧化，抗衰老，保肝等作用。

2、现代植物化学研究表明，余甘子主要含有以下化学成分：多酚类、有机酸类、糖类、维生素、氨基酸等物质以及微量元素zn、mn、fe、ca和se等，其中，显著特征是含有大量的多酚及丰富的维生素c。多酚类物质主要有：葡萄糖没食子鞣质、没食子酸、并没食子酸、鞣云实精、原诃子酸、粘酸和油柑酸等。现代药理学研究表明，余甘子主要具有抗氧化、抗病原微生物、抗诱变、抗致畸、抗肿瘤、降脂、降血压等作用。

3、余甘子药食两用，收载于卫生部2002年公布的《既是食品又是药品的物品名单》，在民间有生食余甘子鲜果的习惯。目前，关于余甘子的研究也越来越多。中国专利cn108186456b公开了“一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法”，其特征在于该发明以余甘子果为原料，通过低温提取、过滤、提取液低温浓缩、固液分离、大孔吸附树脂纯化、洗脱液浓缩、低温干燥，得到余甘子提取物，该提取物祛斑美白活性显著、无皮肤刺激性。中国专利cn111944870a公布了“余甘子萃取发酵物及其制备和应用”，其特征在于先萃取余甘子得到余甘子萃取物，然后使用酿酒酵母和胚芽乳酸杆菌对萃取物进行第一步发酵，再使用醋酸菌进行第二部发酵，得到产物中含有几种特定化合物中的至少一种，可加入医药、食品或保养品中，具有使个体不易形成体脂肪、美白、及/或抗肌肤老化的用途。文献“余甘子提取物抗氧化能力分析和对酪氨酸酶活性的影响”中提到，余甘子果实水提物中多酚和黄酮含量分别为22.95 mg/g dw和34.61mg/g dw，清除 dpph、abts+和羟自由基的ic50值分别为4.58μg/ml、9.61μg/ml、1.99 mg /ml。余甘子果实提取物对酪氨酸酶的作用与浓度有关，0.2、0.6 mg/ml 提取物对于酪氨酸酶有一定的激活作用；1.8mg/ml提取物则对酪氨酸酶活性表现出抑制作用。综上所述，关于余甘子提取物在化妆品中的应用研究多是美白祛斑、抗氧化抗衰方面的研究。

4、卡利比克迈耶氏酵母是迈耶氏酵母（ meyerozyma）属的微生物，原产地为中国，主要用于果酒发酵研究。文献“生姜猕猴桃自然酒精发酵醪微生物多样性研究”中提到， myerozyma是生姜猕猴桃自然酒精发酵醪初期和中期的优势酵母菌群。西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心举行的2021-2022学年第2期学术活动中，刘琨毅以“fermentation of coffea canephora inoculated with yeasts: microbiological,chemical, and sensory characteristics”为题，汇报了与传统发酵相比，在咖啡豆中接种卡利比克迈耶氏酵母进行强化发酵，有助于对发酵过程中丝状真菌的控制，并获得优良的感官特征，使得接种卡利比克迈耶氏酵母的咖啡在市场上具有较大的潜力。文献“酿造酒中非酿酒酵母的研究进展”中提到，非酿酒酵母种类丰富，有迈耶氏酵母（ meyerozyma）等，广泛存在于酿造原料、发酵剂及酿酒环境中, 其代谢产物及分泌的酶类对酿造酒的香气、风味具有重要的影响。从上述文献中可以看到，将卡利比克迈耶氏酵母等非酿酒酵母应用于酿造原料越来越引起人们的注意。

5、不同酵母菌的发酵状态、代谢产物等等肯定有所差异，因此筛选出一株发酵性能优良的酵母菌是十分有必要的，而且酵母菌发酵后活性成分比较丰富，发酵结束后通过菌体破碎使其胞内物质充分释放出来，十分具有生产化妆品的应用前景。如果将酵母菌和余甘子进行有效的结合，得到有效成分更为丰富的发酵产物，对余甘子在各个领域的应用都有很好的推动作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型的发酵性能优异的卡利比克迈耶氏酵母，为酵母菌提供了一种新的选择。该菌种发酵性能优异，在发酵余甘子果中表现出了很大的优势，使用这株卡利比克迈耶氏酵母制备余甘子果提取物时，生产周期短、产品稳定，且活性物质含量高、安全健康，符合化妆品原料的要求。所得余甘子果发酵提取物具有良好的抗氧化、美白、抗炎等功效，在化妆品中具有很好的应用前景。

2、本发明从余甘子鲜果中自行筛选得到了一株性能优异的卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica），该酵母命名为卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz，该卡利比克迈耶氏酵母为发明人自行筛选得到，已于2022年09月23日在中国典型培养物保藏中心（简称cctcc）进行保藏，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 20221480。卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）的26s rdna基因序列如seq id no：1所示。

3、进一步的，本发明还提供了一种菌剂，该菌剂中包含上述卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz。该菌剂中可以仅含有卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma  caribbica）y-ygz这一种微生物，也可以含有其他的微生物。

4、进一步的，所述菌剂既可以为固体制剂，也可以为液体制剂。

5、本发明还提供了上述卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz或者上述菌剂在制备发酵产品中的应用。该应用中，一般是将卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma  caribbica）y-ygz或者上述菌剂加入培养基中进行发酵，得到发酵产品。

6、在现有技术中公开了卡利比克迈耶氏酵母在多种领域的发酵用途，本发明卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz在这些现有公开的领域中均可以使用，用于替换现有的酵母菌得到发酵产物。

7、优选的，本发明卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz或者上述菌剂用于发酵制备余甘子果发酵产品，所述余甘子果发酵产品是用上述卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz或者上述菌剂对余甘子果进行发酵得到的发酵产物，也可称之为余甘子果提取物。余甘子果在发酵过程中一般打成果浆，根据发酵的需要，可以在果浆中加入发酵所必须的碳源、氮源、无机盐等成分。

8、进一步的，该卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz在使用时，可以通过培养基进行扩大培养，以得到所需数量的菌种，其最佳培养温度为20℃-30℃。在本发明某一具体实施方式中，卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz菌种通过液体的种子培养基进行扩大培养，扩大培养后离心去除上清液，得到卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz；优选的，种子培养基的配方为：碳源2-5 wt %、氮源1.5-3wt %、无机盐0.2-0.7 wt %，水余量。所述碳源为微生物培养常用碳源，如果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精等，所述氮源为微生物培养常用氮源，如蛋白胨、酵母粉、黄豆粉等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁等。

9、本发明提供了一种余甘子果提取物，该余甘子果提取物由上述卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz对余甘子果发酵而得。

10、本发明提供了一种余甘子果提取物的制备方法，该方法包括采用上述卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz发酵余甘子果的步骤。

11、进一步的，上述方法包括以下步骤：

12、（1）将余甘子果打浆，所得果浆静置，自然发酵至ph不再变化；

13、（2）将上述自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含果浆的培养液；

14、（3）将卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz加入上述含果浆的培养液中，发酵至ph不再变化，得发酵液；

15、（4）将发酵液除杂、除菌，得到余甘子果提取物。

16、进一步的，步骤（1）中，以整个余甘子果为原料，在打浆之前，可以将余甘子果进行清洗，洗干、晾干的余甘子果可以采用榨汁机等器械进行打浆，所得果浆利用其内生菌进行自然发酵。静置的温度为15~25℃，自然发酵至ph不再变化时停止自然发酵，所需时间一般为1~3d。

17、在本发明某一具体实施方式中，所述静置温度为15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃。

18、在本发明某一具体实施方式中，自然发酵所需时间为1d、1.5d、2d、2.5d、3d。

19、进一步的，步骤（2）中，自然发酵后的果浆进一步与氮源、碳源、无机盐等进行混合，配成用于卡利比克迈耶氏酵母发酵的含果浆的培养液。培养液中的自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐、水的混合顺序随意，可以先将自然发酵后的果浆与水混合，再加入氮源、碳源、无机盐，也可以先将氮源、碳源、无机盐加入水中，再加入自然发酵后的果浆，还可以将自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐同时加入水中。优选的，先将氮源、碳源、无机盐加入水中，灭菌后再加入自然发酵后的果浆，这样既能保护果浆中的营养成分不受破坏，又能灭除杂菌，降低染菌概率，保证纯种发酵，稳定产品质量。灭菌可以采用现有技术中报道的各种可行的灭菌方式，例如湿热灭菌等。

20、进一步的，步骤（2）中，在配好的含果浆的培养液中，自然发酵后的果浆的质量百分含量为1-10%，氮源的质量百分含量为0.1-2%，碳源的质量百分含量为0.1-2%，无机盐的质量百分含量为0.02-0.2%，其余为水。其中，所述氮源为微生物培养常用氮源，如蛋白胨、酵母粉、豆粕提取物等，所述碳源为微生物常用碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糊精等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁等。

21、进一步的，步骤（3）中，卡利比克迈耶氏酵母y-ygz加入含果浆的培养液中用于进一步发酵。卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz菌种的接种量（以卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz细胞计）为含果浆的培养液的0.5-1 wt %。卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz菌种可以通过上述扩大培养的方式得到足够量的菌种。

22、进一步的，步骤（3）中，接入菌种后，在20-30℃进行发酵培养，发酵至ph不变时结束。一般发酵时间为36~42 h。

23、在本发明某一具体实施方式中，具体的发酵温度为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃；发酵时间为36 h、37 h、38 h、39 h、40 h、41 h、42 h。

24、进一步的，步骤（4）中，发酵所得发酵液通过过滤、离心等方式除杂、除菌。

25、进一步的，按照本发明卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz制得的余甘子果提取物与采用其他酵母菌发酵得到的余甘子果提取物相比，抗氧化、美白、抗炎作用更佳，对il-6、tnf-α、il-1β三种炎性因子均具有良好的抑制作用。因此，本发明所得的余甘子果提取物可以用于化妆品中，作为化妆品的抗氧化、美白、抗炎成分。

26、本发明还提供了上述卡利比克迈耶氏酵母（meyerozyma caribbica）y-ygz、上述菌剂或上述余甘子果提取物在制备化妆品中的应用，作为化妆品的抗氧化、美白、抗炎成分。

27、本发明还提供了一种组合物，其包括本发明上述余甘子果提取物。所述组合物优选为化妆品。

28、进一步的，所述化妆品为具有抗氧化、美白、抗炎之中的至少一种功效的化妆品。

29、本发明具有以下优点：

30、1、本发明自行筛选得到了一株发酵性能优异的卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma  caribbica）y-ygz，该菌株在发酵余甘子果中表现出了突出的优势，其能提高余甘子果有效成分的含量，所得发酵产物具有很好的应用价值。

31、2、本发明提供的余甘子果提取物制备方法基于传统发酵技术进行改进，先通过余甘子果内生菌自然发酵将余甘子果中不溶性的蛋白等大分子物质转化成了可溶性小分子氨基酸等，再通过本发明特殊的卡利比克迈耶氏酵母发酵，可产生多种活性成分，所得发酵液的抗氧化、美白、抗炎效果更佳。未经发酵的余甘子果只对炎性因子il-1β、tnf-α有抑制作用，对炎性因子il-6无抑制作用，经本发明发酵后，发酵液对il-6、tnf-α、il-1β炎性因子均有良好的抑制作用，且对il-1β、tnf-α抑制作用大大提高。

32、3、本发明将整个余甘子果进行液体发酵，以发酵提取液作为最终产品，可将余甘子果原料及余甘子果发酵液全部充分利用，工艺简单，操作简便，成本低，能实现大规模生产。

33、保藏信息

34、本发明卡利比克迈耶氏酵母（ meyerozyma caribbica）y-ygz已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no: m 20221480，保藏日期为2022年09月23日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。