用于测定病毒例如冠状病毒的RNA分离和相关技术的制作方法

用于测定病毒例如冠状病毒的rna分离和相关技术
1.相关申请
2.本技术要求chait等于2021年3月17日提交的题为“rna separation and related techniques for determining viruses such as coronaviruses”的美国临时专利申请序列号63/162,485的权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开内容的某些方面一般地涉及用于测定病毒例如冠状病毒的系统和方法。


背景技术：

4.冠状病毒是在哺乳动物和鸟类中导致疾病的一组病毒。在人中，冠状病毒导致通常轻微的呼吸道感染，例如普通感冒，但是较罕见的形式如sars、mers和covid-19可以是致命的。冠状病毒是具有正义单链rna基因组和螺旋对称核壳的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小为约27至34千碱基。冠状病毒这个名字来源于拉丁语corona，意思是“皇冠”或“光环”，其是指病毒颗粒的特征外观：它们的边缘让人联想到皇冠或日冕。
5.发明概述
6.本公开内容的某些方面一般地涉及用于测定病毒例如冠状病毒的系统和方法。在一些情况下，本公开内容的主题涉及相互关联的产品、特定问题的替代解决方案和/或一个或更多个系统和/或制品的多种不同用途。
7.在一组实施方案中，该方法包括在水性多相分配系统中分配包含病毒和游离核酸的生物流体，以及在分配系统内测定病毒。在一些情况下，至少95％的游离核酸分配在分配系统的第一相中。
8.在另一组实施方案中，该方法包括在水性多相分配系统中分配包含病毒和游离核酸的生物流体，移出第一相的等分试样，以及对等分试样内的游离核酸进行测序。在一些情况下，至少95％的游离核酸分配在分配系统的第一相中。
9.在另一个方面中，本公开内容包括制造本文所述的一个或更多个实施方案的方法。在又一个方面中，本公开内容包括使用本文描述的一个或更多个实施方案的方法。
10.当结合附图考虑时，本公开内容的其他优点和新的特征将从以下对本公开内容的多种非限制性实施方案的详细描述中变得显而易见。
11.附图简述
12.将参考附图以示例的方式描述本公开内容的一些非限制性实施方案，这些附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在图中，所示出的每个相同或几乎相同的组件通常由单一附图标记表示。为清楚起见，在不需要图示以使得本领域普通技术人员能够理解本公开内容的情况下，并非在每幅图中都标记了每个组件，也没有示出本公开内容的每个实施方案的每个组件。在图中：
13.图1示出了根据某些实施方案的用于测定病毒的示例性装置；
14.图2示出了在一个实施方案中用于不同病毒的分配系统的一个实例。
15.图3示出了在另一个实施方案中对两种不同的病毒进行不同地分配的分配系统的另一个实例。
16.图4示出了在又一个实施方案中的分配系统的另一个实例，在该分配系统中相并非全部基本上均匀分布；以及
17.图5示出了在又一个实施方案中将核酸分配至一个相的分配系统的又一个实例。
18.发明详述
19.本公开内容的某些方面一般地涉及用于测定病毒例如冠状病毒的系统和方法。例如，一些方面涉及使用分配系统来测定病毒的系统和方法。在该分配系统内，游离rna或其他核酸可以优先分配至一个相中，而完整的病毒可以存在于另一个相或同时存在于两个相中。因此，在一些情况下，例如与病毒内存在的完整的rna或其他核酸相比，可以优先移出游离的rna或其他核酸。在一些情况下，可以测定包含完整病毒的相以测定例如来自对象的样品的感染性。这可用于例如将能够传播感染的对象与不具有感染性的对象区分开。
20.本公开内容的一个方面涉及在生物样品中检测完整病毒颗粒，所述生物样品包含所述完整病毒颗粒、可被分子检测系统(例如rt-pcr)识别为属于病毒的其他病毒组分例如rna(或其他核酸)、以及不被分子检测系统识别为属于所述病毒的其他生物或非生物组分的混合物。一些实施方案包括用于使用相同分子检测系统区分完整病毒颗粒和病毒组分的阳性分子检测的技术。这可以提供用于测定能够进一步感染的样品和不能进一步感染的样品，这可以例如可用于在临床上将能够传播感染的患者与患病但相反地没有感染性的患者分离。
21.某些实施方案依赖于完整病毒颗粒与相同病毒的其他组分(例如rna)的空间分离。虽然完整病毒颗粒可以在分配系统(例如水性多相分配系统)的水相之间分配，但游离核酸(例如rna)(例如，不包含在病毒中)可以优先分配至一个相，例如主要是由于它们的净负电荷。水性多相分配系统可以包括两个相或更多个相，例如如本文所讨论的。在一些情况下，如果样品包含来自死亡病毒的游离rna和能够进一步感染的完整功能性病毒体二者，则可以通过对其中基本上不存在游离rna的相进行简单的分子测试来检测该样品。如果在该相发现rna，则它可以有助于测定样品中完整的功能性病毒体的存在。
22.在一些实施方案中，可能不需要测定或以其他方式定量使用水性多相分配系统的分配系数。例如，分配系统本身可以能够例如通过优先将游离rna分配至分配系统的一个相中而将游离rna(例如，从死亡或受损病毒中释放的)与完整的功能性病毒颗粒分离。然后可以分析基本上不含rna的其他相，例如以测定病毒颗粒的存在。当然，应当理解，在另一些实施方案中，可以测定游离rna和/或病毒颗粒的分配系数，例如如本文所述。
23.在一组实施方案中，完整病毒可以分布到两个相。然而，在另一些实施方案中，完整病毒可以选择性地或优先地分配例如至分配系统的相之一。例如，在分配系统的每个相中可以存在至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的病毒。另外，在一些实施方案中，游离rna(或其他核酸)可以优先分配至分配系统的相之一。例如，分配系统内游离核酸分子的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％等的游离rna(或其他核酸)可以存在于一个相中。
24.在某些实施方案中，对分配系统的一个(或更多个)相的测定可用于测定核酸的存在。这样的测定的实例包括但不限于rt/pcr或本领域普通技术人员已知的其他测序技术。
可以使用的测序和其他测定技术包括本文所述的那些中的任一种。在一些实施方案中，可移出分配系统的相的等分试样以用于分析，但是在另一些实施方案中，可在分配系统本身内原位测定相，即不需要移出分配系统的相的等分试样并使用它们进行分析。
25.在本公开内容的一些方面中，描述了用于测定病毒的系统和方法。可以测定的病毒的实例包括但不限于冠状病毒、流感病毒或其他病毒，例如本文所述的那些。在一组实施方案中，使用了分配系统，例如水性多相分配系统。可以对例如取自对象的生物流体的样品进行分析以测定是否存在某种类的病毒(例如，sars、mers、covid-19等)和/或是否存在某类型的病毒(例如，冠状病毒)。也可以从对象收集生物流体。在一些情况下，生物流体可被加工以供进一步使用。在某些实施方案中，可以测定生物流体中的特定病毒。下文描述了病毒的另一些非限制性实例。另外，在一些情况下，不同类型的病毒可彼此区分(例如，冠状病毒与流感病毒)。
26.生物流体样品可以包含流体，例如全血、血清、血浆、唾液、鼻液、痰、尿、cns液、乳房乳头抽吸液、脑脊髓液、精液等。从中提取生物流体的对象可以是人或非人，例如非人哺乳动物。非人哺乳动物包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、灵长类、大鼠和小鼠。在一些情况下，对象是怀疑感染了病毒的对象。例如，对象可先前曾暴露于带有病毒的人，或者可至少被怀疑可能带有病毒。另外，在某些实施方案中，对象可不被怀疑可能带有病毒(例如，流体可以在常规筛查期间收集)。
27.根据多个实施方案，可以测定多种不同的病毒。病毒(包括感染性病毒)的非限制性实例包括冠状病毒或流感病毒。其他非限制性实例包括腺病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、单纯疱疹病毒(1型和2型)、巨细胞病毒、疱疹病毒(8型)、hiv、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳头状瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒等。
28.在一些实施方案中，可以测定冠状病毒。冠状病毒的实例包括但不限于hcov-229e、hcov-oc43、sars-cov、hcov-nl63、hku1、mers-cov或sars-cov-2。如本文所讨论的，在一些情况下，冠状病毒的一种或更多种蛋白质可用于测定病毒，例如，通过与能够结合蛋白质的结合部分或靶向物质(例如本文所讨论的)相互作用。病毒上的这样的蛋白质的实例包括但不限于包膜子粒(peplomer)、包膜蛋白、膜蛋白、核壳、刺突糖蛋白、血凝素-酯酶二聚体(he)等。另外，在一些情况下，病毒的核物质(例如rna)可以例如通过与结合部分或靶向物质相互作用等等来测定。
29.在一些实施方案中，可以测定流感病毒。流感病毒包括属例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒属(isavirus)、索戈托病毒(thogotovirus)和夸兰扎病毒(quaranjavirus)。甲型流感病毒的实例包括但不限于h1n1、h1n2、h2n2、h3n1、h3n2、h3n8、h5n1、h5n2、h5n3、h5n8、h5n9、h7n1、h7n2、h7n3、h7n4、h7n7、h7n9、h9n2、h10n7等。乙型流感病毒的实例包括但不限于victoria和yamagata。在一些情况下，流感病毒的一种或更多种蛋白质可用于测定病毒，例如通过与结合部分或靶向物质(例如本文所讨论的)相互作用。这样的病毒蛋白的非限制性实例包括血凝素、神经氨酸酶、膜蛋白、糖蛋白、核壳等。另外，在一些情况下，病毒的核物质(例如rna)可以例如通过与病毒结合部分或靶向物质相互作用来测定。
30.在一组实施方案中，生物流体在分配系统，例如两相分配系统或其他多相系统(例如具有3相或更多相)中分配。多相分配系统中可以存在两相、三相、四相或更多相。在一些实施方案中，分配系统是水性的，例如其中每种流体都是水性的。这样的水性分配系统可以包括由以下形成的水相：水和不同类型的聚合物(例如葡聚糖和peg或葡聚糖和ficoll)、具有不同分子量的相同类型的聚合物(例如葡聚糖-70和peg-600或葡聚糖-70和peg-8,000)、相同聚合物但含有不同类型和/或浓度的盐添加剂、不同ph和浓度的不同缓冲液等。本文更详细地描述了分配系统的另外的实例。然而，应当理解在另一些实施方案中，可以使用其他类型的多相系统，例如含有非水相。
31.在一个方面中，分配系统例如本文所讨论的那些可用于分配可能存在于样品中的游离核酸，例如来自死亡或受损病毒体颗粒的游离核酸。例如，分配系统可用于例如在分配系统的相之一内分离或浓缩游离核酸(例如dna或rna)。可以使用的分配系统包括本文所述的系统中的任一种。另外，在一些情况下，可以测定样品中游离核酸的量或浓度，并任选地与存在于完整病毒中的rna(或其他核酸)进行比较。一个或更多个相内的rna(或其他核酸)的类型、量和/或浓度可以使用任何合适的技术来测定，例如通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、测序和/或其他测定技术(包括本文所述的那些)等来测定。作为非限制性实例，如本文所讨论的，完整病毒可以分配在多于一个相中，而不存在于完整病毒中的rna(或其他核酸)可以优先分配至单个相。
32.分配系统的一个或更多个相内的完整病毒(例如，病毒体颗粒)可以使用任何合适的技术(包括本文所讨论的那些)来测定。用于测定完整病毒和游离核酸的技术可以相同或不同。例如，可以例如在分离之后从病毒中提取核酸(例如，rna和/或dna)，并以某种方式例如通过聚合酶链式反应(pcr)、测序技术(包括本文描述的那些)等对其进行测定。
33.作为非限制性实例，如果分配系统中的游离核酸(例如，来自病毒)的分配行为是已知的，则可以将核酸的分配行为与对照(例如所述游离核酸)的分配行为进行比较。该比较可用于测定样品中的完整病毒中所含的核酸。例如，样品可以在分配系统内被分配，并且分配系统的一个或更多个相可以被移出或分离，例如用于使用例如本文所述的那些的技术进行分析。该一个或更多个相可以在测定病毒之前移出，或者可以在测定病毒之后移出。在移出或分离之后，可对相内的完整病毒进行加工以提取它们的核酸，例如提取到溶液中。然后可以测定分配系统的相中核酸的量和/或浓度，并且在一些情况下，将其用于测定分配系数。在一些情况下，分配系数可以与分配系统中仅游离核酸的预期值进行比较，并且任何差异都可用于除游离核酸之外还测定样品中完整病毒的存在，以及例如量或浓度。另外，在一些实施方案中，可测定例如本文所述的分配系统的单个相而例如无需测定其他相或计算分配系数。例如，游离rna(或其他核酸)可以优先分配至如本文所述的分配系统的一个相中，同时可以测定分配系统的其他相例如以测定其rna含量，这可以指示完整的病毒。然而，应当理解，测定分配系数不是必需的，并且在一些实施方案中，可以不测定分配系数，例如，因为仅分析分配系统的单个相。
34.在某些实施方案中，例如本文描述的那些的技术可以允许测定样品中的完整病毒。在一些情况下，这可与疾病的严重程度、疾病的阶段、对象的感染性等相关。相反，在许多其他技术中，不可能将完整病毒与已将其核酸释放到例如样品中的病毒区分开。
35.作为非限制性实例，在一个实施方案中，样品可以在合适的分配系统(例如如本文
所述的)的相内分配。在平衡之后，可以取出一个或更多个相的等分试样，并且任选地可以以某种方式对其中的一个或更多个进行加工，例如以使可能存在的任何完整病毒将其核酸释放到溶液中。然而，在一些情况下，病毒可以在分配系统本身内原位测定，即不需要从待分析的分配系统中移出一个或更多个相的等分试样。一个(或更多个)相中的核酸可以例如使用pcr或其它测序技术(例如本文所述的那些)来测定。在一些情况下，可以测定一个或更多个相中特定核酸序列(例如病毒的rna)的量，并将其用于测定样品中完整病毒的存在，例如通过消除或减去由死亡或受损病毒引起的游离核酸(如rna或dna)。这可以特别有用，如果分配系统被选择为选择性地对游离核酸优先，例如以使得至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％等的游离核酸存在于一个相中，例如如本文所讨论的。在一些实施方案中，可以量化差异并将其用于测定样品中存在的完整病毒的相对量或浓度。
36.在某些实施方案中，分配系统使样品分配以使得完整的病毒(例如，sars-cov-2病毒体，或例如本文所述的其他病毒)出现在两个相中。在某些实施方案中，分配系统还可以使样品分配以使得来自非完整病毒的核酸或抗原仅或基本上出现在一个(例如顶部或底部)相中。然后可以测定一个或更多个相，例如以测定来自病毒的核酸或抗原(例如刺突蛋白抗原)的存在，例如使用pcr技术(例如rt/pcr)来测定核酸的存在，或使用抗原测试来测定抗原的存在。
37.例如，这样的系统可用于区分仅阳性病例(例如，由rna或其他游离核酸的存在测定的)与阳性感染病例(例如，使用游离核酸加完整病毒测定的)。例如，这是可以实现的，因为一个相可包含来自完整病毒的核酸，而另一个相也可包含游离rna或其他核酸(例如dna)。例如，分配系统可以构造成使得高带电物质(例如游离核酸)优先分配在一个相中。例如，分配系统内的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％等的游离核酸分子可以存在于一个相中。因此，在某些实施方案中，例如测定第一相内的完整病毒以及测定第二相内的来自病毒的核酸或抗原可以有利地指示阳性和感染性等。
38.如前所讨论的，具有两相或更多相的水性分配系统可用于本公开内容的多个方面以测定一种或更多种病毒(或其他物质)。例如，如本文所讨论的，可以测定水性两相分配系统中的一种或更多种病毒，例如通过使用例如本文所述的那些的技术测定每个相中病毒的量和/或浓度，同时将游离rna或其他核酸主要分配至其中相之一中，例如由于它们的净负电荷。通常，有助于溶质分配的水性两相分配系统的特性包括如下更详细描述的参数。然而，由于核酸(例如rna)通常是带(负)电荷分子，因此影响其在两相之间分配行为的一个参数是分配系统中相的离子组成的差异，例如通过作为添加剂的盐及其分布。
39.水性多相系统为本领域普通技术人员所公知，并且可以产生于不同水溶性聚合物或单一聚合物和特定盐的水性混合物中。当将两种或更多种特定聚合物(例如葡聚糖(“dex”)和聚乙二醇(“peg”))，或一种或更多种特定聚合物和一种或更多种无机盐(例如聚乙烯吡咯烷酮(“pvp”)和硫酸钠)以一定浓度以上在水中混合时，在一定条件下，混合物可以分离成两个(或更多个)不混溶的水相。在某些情况下，可存在分离任何两相的离散界面边界，例如使得一个相富含一种聚合物而另一相富含另一种聚合物或无机盐。一个或更多个相中的水性溶剂可以提供适用于生物产品的介质。通过使用不同的化学组分，两相系统
也可以概括为多相系统，并且具有十多个或更多个相的水性系统是本领域已知的。
40.当将物质(例如病毒)引入到这样的两相系统中时，它可分布在两相之间，并且该理解可以扩展到三相或更多相。在这个系统和另一些系统中，物质可以在每个相内以不同的浓度存在，或者可以在每个相内以相同的浓度存在。溶质的分配可以通过分配系数“k”来表征，分配系数“k”定义为平衡时两个不混溶相的溶质浓度之比。先前已经表明，水性聚合物系统中的相分离可以是由于两种聚合物(或单一聚合物和盐)对水结构的不同作用(b.zavlavsky,aqueous two-phase partitioning:physical chemistry and bioanalytical applications,marcel dekker,new york,1995)。由于对水结构的不同作用，共存相中水性介质的溶剂特征可彼此不同。相之间的差异可以通过例如介电、溶剂致变色(solvatochromic)、电位和/或分配测量的技术来证明。
41.已显示水性两相系统中溶质分配的基本规则与水-有机溶剂系统(其也可用作本公开内容中的系统)中的那些相似。然而，相对于在水-有机溶剂系统中观察到的那些差异，在水性聚合物系统中两相的特性确实存在的差异通常非常小，正如对于具有相同(水性)性质的溶剂对所预期的那样。可以修改水性两相或多相系统中的相的溶剂特征之间的小差异以放大在存在某些结构特征时产生的观察到的分配。
42.已知每一相的聚合物和盐组合物通常取决于水性两相系统的总聚合物和/或盐组合物。给定相的聚合物和/或盐组合物进而通常控制该相中水性介质的溶剂特征。这些特征包括但不限于介电特性、溶剂极性、溶剂参与与溶质的疏水水合相互作用的能力、溶剂参与与溶质的静电相互作用的能力以及溶剂的氢键酸性和碱性。共存相中水性介质的所有这些和其他溶剂特征可以通过选择水性两相系统的聚合物和盐组合物来操作。介质的这些溶剂特征可以控制给定水性两相系统对受体中特定类型的溶剂可接近的化学基团的敏感性。例如，两种不同蛋白质中溶剂可接近的基团的这种敏感性、类型和形貌可以测定在给定的水性两相系统中分离蛋白质的可能性。
43.在一些情况下，可能需要特别敏感的系统，即对两个非常相似的物质非常敏感并能够测定相对于两个非常相似物质的相互作用的相对量度或分配系数的系统。例如，当检测到由密切相关化合物的结合诱导的受体的构象变化之间的细微差异时，这种敏感性可能是重要的。在一组实施方案中，本公开内容提供了用于筛选水相组合物以鉴定和/或放大两种混合物的组合物之间的差异的有效且成功的系统和方法。如本文所述，通过利用多种不同的条件来筛选每个分子，可以可靠地获得不同的分配行为，而无需完全理解水性两相分配的基本理论或任何其他相关或可替代的技术。
44.当置于这样的系统中时，病毒可分布在两个或更多个相之间。例如，在使用成相聚合物的情况下，包含两种聚合物中的一种或更多种和病毒的溶液可以混合在一起，使得成相聚合物和病毒二者混合。分离(resolve)所得溶液并形成两相系统。任选地，可以使用离心来增强相的分离。本领域普通技术人员将认识到，病毒的分配行为可受许多变量的影响，例如ph、使用的聚合物、使用的盐、与系统组成有关的因素，以及其他因素，例如温度、体积等。这些因素对期望作用的优化可以通过相关领域普通技术人员的常规实践结合本公开内容来实现。另外，如前所讨论的，可以例如使用能够与病毒(例如选择性地)结合的靶向物质来改变病毒的分配行为。
45.相反，在一些实施方案中，不包含在病毒颗粒内的rna、dna或其他核酸可以主要分
配至一个或有限数量的相中。如本文所讨论的，这可能是例如由于例如与病毒颗粒相比核酸的相对高的净负电荷引起的。因此，在一些实施方案中，这样的游离核酸可主要存在于一个或有限数量的相中，而病毒颗粒可存在于其他相中。通过分析不具有游离核酸的相，可以测定病毒颗粒，例如如本文所讨论的。
46.在本公开内容的一些实施方案中，对来自病毒分配的数据的评价可以涉及分配系数的使用。然而应该理解，分配系数并不总是需要的。例如，病毒的分配系数可以看成是双相系统中第一相中病毒与第二相中病毒的比率。当形成多相系统时，可以有多个独立的分配系数，每个分配系数可在任意两相之间进行定义。将认识到，如果给定病毒所经受的两相系统的条件和组成保持恒定，则给定病毒的分配系数可以是恒定的。因此，如果在添加潜在的结合配偶体(例如，抗体)后观察到病毒的分配系数发生变化，则可以推测这些变化是由与病毒形成复合物引起的病毒结构变化引起的。本文中使用的分配系数k是如本文进一步描述的具体数学定义的量，并且该术语包括表示物质(例如病毒)与至少两种相互作用组分之间相互作用的相对量度的系数。还应该认识到，两种或更多种混合物中不同物质的分配系数之间的差异，除了表明可能的结构变化外，还可表明这样的物质与混合物中的其他物质结合或缺乏结合。
47.在一种分配系统的一个非限制性实例中，已知水性多相系统可由多种物质形成。例如，为了测定待分析病毒(或病毒混合物)的分配系数，所有组分(聚合物1，例如葡聚糖；聚合物2，例如peg、聚乙烯吡咯烷酮、盐等)在水中的浓缩储备溶液可以单独制备。相聚合物、盐等的储备溶液可以以适当的量和条件(例如，ph约3.0至约9.0，温度约4℃至60℃，盐浓度0.001至5mol/kg)混合以使系统达到所期望的组成，并剧烈摇动。然后可以允许系统平衡(使相分离)。平衡可以通过让溶液保持不受干扰来完成，或者可以通过离心(例如在约1000g至4000g或更高下离心2至30分钟)来加速。可以从上方的相和/或下方的相(或从一个或更多个相，如果存在多个相的话)中取出每个沉降(分离)相的等分试样。可以针对一个或更多个相测定相内的病毒浓度。
48.可以使用不同的测定方法来测定分配系统的相内的物质，例如本文所述的那些。例如，这样的测定可用于测定多相系统的每个相中的病毒浓度。测定通常取决于病毒或存在的其他病毒的身份和类型。合适的测定技术的实例包括但不限于光谱、免疫化学、化学、荧光、放射和酶测定。在一些情况下，可以通过测定与病毒相关的肽或蛋白质来测定病毒。非限制性实例包括冠状病毒的包膜子粒、包膜蛋白、膜蛋白、核壳等，或流感病毒的血凝素或神经氨酸酶。这样的肽或蛋白质可例如使用能够与这些肽或蛋白质相互作用的合适抗体来测定。例如，在一些情况下可以使用某些免疫化学测定，例如elisa。另外，在某些实施方案中可以使用其他肽或蛋白质检测技术。这些包括但不限于直接分光光度法(例如，监测280纳米处的吸光度)和与考马斯蓝g-250或荧光胺、邻苯二甲醛或其他染料和/或试剂的染料结合反应。游离核酸也可以使用测序和其他技术(如本文所述的那些)来测定。
49.在一些实施方案中，一种或更多种流体操作可发生在微流体装置内。本文中使用的“微流体”是指包括截面尺寸小于约1mm的至少一个流体通道的装置、制品或系统。通道的“截面尺寸”以垂直于通道内的净流体流动的方向测量。因此，例如制品中的一些或所有流体通道的最大截面尺寸可以小于约2mm，并且在一些情况下小于约1mm。在一组实施方案中，制品中的所有流体通道都是微流体的和/或最大截面尺寸不超过约2mm或约1mm。在某些实
施方案中，流体通道可以部分地由单个组件(例如，经蚀刻的基底或模制单元)形成。当然，在本公开内容的另一些实施方案中，可以使用更大的通道、管、腔、储器(reservoir)等来操纵。在一组实施方案中，制品中通道的最大截面尺寸小于约1mm、小于约500微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约75微米、小于约50微米、小于约30微米、小于约25微米、小于约20微米、小于约15微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约3微米、小于约2微米、小于约1微米、小于约500nm、小于约300nm、小于约100nm或小于约50nm。在一些情况下，可以很容易地商购获得合适的微流体装置。
50.如上所述，本公开内容的某些方面一般地涉及病毒状态的调查，但是本公开内容不仅限于病毒。另一些实施方案可以应用于基本上任何分子种类和/或相互作用，无论是生物的、生物化学的、化学的还是其他种类，并且本领域普通技术人员将理解如何可将本公开内容用于其他分子的情况下。因此，应当理解，每当在本文的描述中使用“病毒”时，也可以在另一些实施方案中使用或研究任何其他生物或非生物分子。
51.一些实施方案涉及用于测定关于怀疑含有病毒的组合物和/或能够与病毒相互作用的分子的信息的技术。所述组合物可以来自生物流体(或其他样品)，例如人临床样品或其他生物流体、组织、细胞、对象等，或者混合物可以是合成混合物。混合物可以来自生物系统(例如，对象)，其包括但不限于人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、灵长类、大鼠和小鼠。
52.一些实施方案涉及开发和测定例如使用多相分配通过加工获得的混合物的特征(定量和/或定性)，这可以反映可能存在于样品中的病毒的某些结构和功能特征。例如，这些特征可以用于建立样品的组合物与样品的生物来源的生理状态(例如对象(例如人对象)的健康或疾病状态)之间的关系。这些特征也可用于设计实验条件，以用于随后将混合物分离(fractionation)成富集目的分子的亚组以用于分析目的，同时在一些情况下同时减少不同分子的总数。某些系统和方法也可用于检测、分类和/或预测含有病毒的样品的变化。例如，样品可以是与活有机体的特定疾病或生理状态相关的样品、细胞、组织或生物液体。某些系统和方法也可用于检测生物样品中病毒的变化，并且这些变化可进一步用于检测与这样的变化相关的诊断并对其进行分类。
53.混合物中这样的变化的实例可以是混合物的病毒特性的差异，例如其构象、结构和/或相对于另外的分子的相互作用倾向(例如，相对于另外的分子的其结合亲和力或其他相互作用特征)的差异。例如，如果混合物包含病毒，则这样的变化可以通过以下来诱导：一级序列修饰，通过化学、热或其他降解机制降解病毒，与其他分子和/或生物分子的相互作用，与低分子量化合物(如激素、肽、维生素、辅因子等)的相互作用，改变混合物成分的相对含量或浓度，反应例如酶促反应，等。在某些情况下，可以使用一些系统和方法来检测、分析和/或表征生物物质(因为其与病毒相互作用)，包括但不限于多肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、多核苷酸、脂质、固醇及其混合物或衍生物，例如用于检测特定疾病或生理状态或者其发作、监测其进展、治疗等目的。
54.本公开内容的多个实施方案所涉及的比较和分类步骤可以利用与本公开内容的分析方法不一定相关(并非直接来源于本公开内容的分析方法)的另外信息。例如，血压、体温、血糖水平和/或基本上任何其他可测量的生理状况可以与本公开内容的多种技术结合使用以分析一种或更多种疾病或病症。
55.本领域普通技术人员将认识到，这些生物物质可以以任何合适的形式存在，例如以来自天然来源的提取物、生物液体、通过组合化学或生物化学技术产生的分子集合、及其组合、合成产生的形式存在。在一组实施方案中，生物物质来自生物流体(例如，从对象中取出)，并且这样的生物物质可以包括一种或更多种怀疑存在于对象体内的病毒，例如所述对象可被怀疑感染了一种或更多种病毒。在一些实施方案中，病毒可不被怀疑存在于生物物质中，例如在常规筛查期间。
56.在一个实施方案中，本公开内容提供了测定特定条件的方法，在该条件下可以检测代表不同物质(例如，病毒)或物质混合物的样品之间的变化，即测定一组标准和/或系统组分作为“工具”或工具的一部分以用于测定信息以及工具的后续使用。例如，系统测定物质(例如病毒)与可以定义系统的一个或更多个相的一种或更多种相互作用组分之间相互作用的相对量度或分配系数的能力可以用作重要的工具或这样的工具的组分。具体地，作为一个实例，样品成分在具有不同化学或生物化学亲和力或其他特性(例如溶剂结构)的两相之间的分配可以通过该成分对不同特性或组成的介质的相对亲和力来分离该成分。因此，该分离技术可以包括或者作为替代地可以不同于通常用于蛋白质组学的那些或类似技术，例如2-d凝胶电泳，其中电荷和大小差异是用于分离样品成分的两个维度。一些实施方案提供了在相同或不同条件下进行顺序或连续分配的能力，这可导致经分级样品差异的另外放大。这些级分可以使用标准蛋白质组学技术进一步进行分析。
57.如本文别处所述，水性多相(例如，两相)分配系统非常适合用于本公开内容的许多或大多数实施方案，但也可以使用其他分配系统。在使用术语例如“水性两相分配”或“水性多相分配”的情况下，应理解在另一些实施方案中可以使用其他系统，例如本文所述的那些。生物聚合物在水性两相系统中的分配可取决于其三维结构、暴露于溶剂的化学基团的类型和形貌等。由一些作用(例如通过配体结合的结合或通过结构降解)引起的受体3-d结构的变化也可以改变生物分子中溶剂可接近的化学基团的形貌，或者溶剂可接近的基团的形貌和类型二者。这些变化的一个结果可以是生物分子或其他物质的分配行为的改变。
58.可以测定病毒以诊断或测定潜在的生理状况或疾病。本领域普通技术人员可容易地获得快速且特异性的量化技术，其可用于直接在生物样品中使用标准方法和技术量化病毒的浓度，例如使用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)中的抗体。每个系统的两个相互作用组分中的浓度可用于计算分配系数的值。因此，分配系数的各个值的变化可指示病毒的某些变化。在一些情况下，一种或更多种病毒的分配系数的变化可以导致对疾病或病症的明确诊断。在另一些情况下，在多个系统中分配样品并执行上述步骤，然后观察一种或更多种病毒的值模式，可以提供构建灵敏且特异的诊断方法的替代方式。
59.因此，例如，样品可以从对象获得，并在一个或更多个水性两相(或多相)分配系统中分配。可以测定一种或更多种病毒的分配系数，并将其用于测定对象的生理状况，例如测定对象中病毒的存在和/或风险水平。在一些情况下，分配系数可以与参考分配系数(例如先前针对取自患有和不患有疾病或病症(例如病毒感染)的对象的生物分子测定的参考值)进行比较。
60.例如，关于某些实施方案，可以进行多种研究。例如，研究可以包括测定涉及从单个对象或多个对象采集样品的分析程序。例如，可怀疑对象被病毒感染。例如，在一个实施
方案中，可以如本文所述测定病毒的类型。例如，冠状病毒可以是与流感或其他类型的病毒可区别的。
61.类似地，可以使用其他系统和方法来检测变化，所述系统和方法对溶剂可接近的基团的形貌和/或类型具有潜在的依赖性。这样的其他方法的实例包括但不限于柱液-液分配色谱(llpc)、异质两相系统或多相异质系统。在一些情况下，可以生成表观分配系数，其表示(例如病毒的)第一相和第二相之间平均分配的相对变化。例如，在llpc中，受体的保留体积可以用作表观分配系数。
62.在某些实施方案中，分配系统可包含含有例如能够与病毒结合的结合部分的试剂。这样的试剂可以通过病毒结合部分和/或靶向物质附接至样品中的靶病毒，例如通过附接至病毒内的一种或更多种蛋白质，例如蛋白质例如包膜子粒、包膜蛋白、膜蛋白、核壳、刺突糖蛋白、血凝素-酯酶二聚体(he)等。例如，在一些实施方案中，病毒结合部分可以与病毒(例如冠状病毒，例如covid-19)的蛋白质(例如包膜子粒)结合。在一些情况下，例如，结合部分可以包含能够附接至蛋白质的抗体。
63.在一些情况下，所述试剂还可以包含颗粒，例如纳米颗粒。在一些实施方案中，至少一些颗粒可以部分或完全涂覆有病毒结合部分，例如rna或抗体或其他病毒结合部分，例如本文所述的那些。所述试剂还可以包含其他部分，例如信号传导部分和/或其他部分，例如本文所述的那些。
64.在一些情况下，结合部分也可以附接至颗粒，例如金纳米颗粒或其他纳米颗粒，这可导致在病毒周围形成颗粒复合物。作为另一个实例，复合物本身可以含有例如附接至颗粒的信号传导部分，或者颗粒本身可以含有信号传导部分。在一些情况下，复合物本身可以是可检出的，例如作为颜色变化，甚至在一些实施方案中，没有信号传导部分。因此，例如，如果信号传导部分是染料或者是荧光的，则可以例如使用荧光、吸光度、读板仪或通过目视检查(即目视)来测定分配系统的相中的信号传导部分的量或浓度。在一些实施方案中，颗粒本身是荧光的。另外，在一些情况下，可以使用这样的系统来测定超过一种类型的病毒。例如，结合部分可对冠状病毒具有选择性，但对流感病毒没有选择性，或反之亦然，使得相对于一种病毒或包含该病毒的复合物，结合部分可以显著改变另一种病毒或包含该病毒的复合物的分配行为。以这样的方式，病毒可以很容易地彼此区分开。
65.可以选择病毒结合部分以结合病毒或其至少一部分，例如病毒的蛋白质、病毒rna等。在一些情况下，结合可以是特异性的。例如，病毒结合部分对病毒的一部分的结合亲和力可以小于1mm、小于100nm、小于10nm或小于1nm。在一些情况下，病毒结合部分与病毒的至少一部分的结合程度可比与其他分子的结合程度显著更高。例如，结合亲和力可以是存在于例如生物流体样品中的任何其他分子的至少10
×
、100
×
或1000
×
大。在一些情况下，结合可基本上是不可逆的，但是在另一些情况下不需要如此。因此，例如在受体/配体结合对的情况下，配体将特异性地和/或优先地从分子的复合混合物中选择其受体，或反之亦然。酶将与其底物特异性地结合，核酸将与其补体特异性地结合，抗体将与其抗原特异性地结合等。
66.在一些实施方案中，一种或更多种试剂与病毒结合。例如，在一些实施方案中，至少1种、至少2种、至少4种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种或更多种试剂与病毒结合。在一些实施方案中，至多500种、至多200种、至多100种、至多50种、至多10
种、至多5种、至多4种或至多2种试剂与病毒结合。这些范围的组合是可以的。例如，在一些实施方案中，至少1种且至多500种试剂可以与病毒结合。
67.结合相互作用可以是例如氢键、范德华力、疏水相互作用、共价偶联等。另外，在一些实施方案中，可以选择病毒结合部分以相对于第二病毒选择性地与第一病毒结合。例如，病毒结合部分可以相对于流感病毒能够选择性地结合冠状病毒，或反之亦然。病毒结合部分可包含例如抗体(例如，能够与蛋白质(例如本文针对冠状病毒、流感病毒等描述的蛋白质)结合)或核酸(例如，能够与来自病毒的核酸(例如rna或dna)结合，例如使得病毒结合部分包含与病毒基因组的一部分基本上互补的核酸序列)。例如，抗体可以是iga。其他非限制性实例包括igg、igm、igd和ige。
68.在一些情况下，抗体是由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或更多种多肽组成的蛋白质或糖蛋白。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链可以包括κ或λ。重链可以包括γ、μ、α、δ或ε，它们继而包括免疫球蛋白类别，例如igg、igm、iga、igd或ige。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元可以包含四聚物。每个四聚物由两个相同的多肽链对构成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50至70kd)。每条链的n末端定义了具有大约100到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语轻链可变(vl)和重链可变(vh)分别指这些轻链和重链。抗体作为以下存在：完整的免疫球蛋白或许多良好表征的片段，例如其可以通过用多种肽酶消化来产生。因此，例如，胃蛋白酶可以在铰链区中二硫键下方(即，朝向fc结构域)消化抗体以产生fab的二聚体f(ab)'2，其本身是通过二硫键连接到vh-ch1的轻链。f(ab)'2可以在温和条件下被还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将(fab')2二聚体转化为fab'单体。fab'单体本质上是带有部分铰链区的fab。虽然根据完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但这样的片段也可以从头合成，例如通过利用重组dna方法学、通过“噬菌体展示”方法等化学地从头合成。抗体的实例包括单链抗体，例如单链fv(scfv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。
69.信号传导部分(如果存在的话)可以是可以测定的任何实体，例如以测定病毒的分配。例如，在病毒结合部分与病毒结合之后，可以在分配系统中定性和/或定量地测定信号传导部分，例如以允许测定病毒在分配系统内的分配。信号传导部分可以是例如有色的、荧光的、放射性的等。信号传导部分的非限制性实例包括染料、荧光染料、化学发光实体、放射性标记、同位素例如非放射性同位素或可通过质谱检出的同位素、可作为标记抗体的特异性结合配偶体的配体、酶、可作为用于标记配体的特异性结合配偶体的抗体、抗原、具有特异性反应性的基团，和/或电化学可检出部分。染料或荧光信号传导部分的非限制性实例包括荧光素、钙黄绿素、罗丹明、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)等。本领域普通技术人员将知道容易商购获得的其他荧光实体。
70.在一些情况下，可以使用合适的检测器来测定信号传导部分，但是在某些实施方案中，可以无外援地(unaided)例如用肉眼来测定信号传导部分。合适的检测器的实例包括但不限于显微镜(例如荧光显微镜)、读板仪、elisa读取器、盖革计数器(geiger counter)、质谱仪、照相机(例如在智能手机或手机中)等。检测器的其他实例包括本文所述的那些中的任何一个。在一些情况下，信号传导部分可以通过比色法测定(例如在分配系统的相内)。在一些实施方案中，还可以通过测定分配系统的至少一个相中的颜色变化来测定信号传导
部分。在一些实施方案中，信号传导部分也可以通过荧光测定。在一些情况下，可以使用elisa(例如，在分配系统的相内)测定信号传导部分。
71.在一些情况下，试剂的结合也可改变病毒的分配。例如，所述试剂可以通过病毒结合部分与病毒结合，从而改变病毒的有效结构，并且至少在一些情况下，改变病毒的分配。因此，在病毒结合部分与病毒结合之后，试剂的分配可显示出变化，这可以例如通过测定信号传导部分在分配系统内的分配变化来测定。在一些情况下，分配的变化可相对较大。例如，分配的变化可以使得在存在(或不存在)病毒的情况下，试剂分配以使得至少50％(按数量计)、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％等的试剂在分配系统的单相中。
72.在一些情况下，这种分配改变可以是有意的。例如，在某些实施方案中，试剂可以包含分配行为可改变(例如在与病毒结合之后)的其他组分。
73.可以使用多种方法来测定病毒在分配系统内的一个或更多个相中的分配。例如，在一组实施方案中，可以例如如本文所讨论的来测定信号传导部分。然而，在另一组实施方案中，可以使用其他方法，例如如果不存在信号传导部分的话。例如，在一组实施方案中，病毒的聚集可以被测定为在分配系统的一个或更多个相内的颜色或清晰度等的变化。多种系统可用于通过比色法测定颗粒和/或相，例如通过测定颗粒本身和/或信号传导部分等，例如如本文所讨论的。例如，可以基于信号传导部分在分配系统的相内的分配来测定颗粒。作为另一个实例，可以通过将试剂暴露于包含信号传导部分和能够与该试剂和/或病毒结合的结合部分的第二试剂来测定颗粒。在一些实施方案中，可以通过测定光散射的变化而在分配系统的相内测定颗粒。
74.在一些情况下，可以使用合适的检测器来测定病毒在分配系统内的一个或更多个相中的分配，但是在一些实施方案中，可以在没有检测器的情况下例如通过使用肉眼来测定分配。合适的检测器的实例包括但不限于显微镜(例如荧光显微镜)、读板仪、elisa读取器、盖革计数器、质谱仪、照相机(例如在智能手机或手机中)等。其他实例包括本文所述的任何检测器。在一些情况下，可以通过比色法测定病毒。
75.在一些情况下，检测器可以是手持设备或便携式设备，例如图1中所示的实例。作为一个实例，可以使用智能手机或手机来测定信号传导部分。作为另一个实例，手机或智能手机可以用作比色检测器。例如，智能手机上的app或程序可用于测定分配系统的一个、两个或更多个相，并且如果这些相的颜色或其他特征满足某些标准(例如，不同的颜色、不同的光散射比、不同的强度等)(例如由于在相中形成复合物)，则可以测定病毒。
76.作为又一个实例，可以通过将试剂暴露于包含信号传导部分和结合部分的第二试剂来测定试剂，其中该结合部分能够结合复合物。例如，结合部分可能够与病毒(例如病毒结合部分)结合，和/或与颗粒结合。例如，在一组实施方案中，第二试剂可以包含信号传导部分和病毒结合实体。第二试剂的病毒结合实体可以与例如如上所述的试剂的病毒结合实体相同或不同。
77.作为另一个实例，第二试剂可以包含信号传导部分和复合物结合实体，例如能够与病毒和试剂的复合物结合，如上所述。例如，可以选择复合物结合实体以例如特异性地与复合物结合。例如，复合物结合部分对复合物的一部分，例如对颗粒、对病毒等的结合亲和力可以小于1mm、小于100nm、小于10nm或小于1nm。在一些情况下，复合物结合部分与复合物
的一部分的结合程度可比与(例如样品中的)其他分子的结合程度显著更高。例如，结合亲和力可以是存在的任何其他分子或实体的至少10
×
、100
×
或1000
×
大。在一些情况下，结合可基本上是不可逆的，但是在另一些情况下不需要如此。因此，例如，在受体/配体结合对的情况下，配体将特异性地和/或优先地从分子的复合混合物中选择其受体，或反之亦然。酶将与其底物特异性地结合，核酸将与其补体特异性地结合，抗体将与其抗原特异性地结合，等等。结合相互作用可以是例如氢键、范德华力、疏水相互作用、共价偶联等。另外，在一些实施方案中，可以选择复合物结合实体以相对于第二病毒的复合物与第一病毒的复合物选择性地结合。例如，复合物结合部分可相对于流感病毒复合物能够选择性地结合冠状病毒复合物，或反之亦然。示例性的复合物结合部分可以包括但不限于抗体(例如，能够与蛋白质(例如本文针对冠状病毒、流感病毒等描述的蛋白质)结合)或核酸(例如，能够与来自病毒的核酸(例如rna或dna)结合，例如使得病毒结合部分包含与病毒基因组的一部分基本上互补的核酸序列)。例如，抗体可以是iga。其他实例包括igg、igm、igd和ige。
78.在某些实施方案中，靶向物质能够与可能存在于例如分配系统中的病毒结合。在一些实施方案中，靶向物质可以与试剂(例如第一试剂和/或第二试剂)分开。在某些实施方案中，病毒可暴露于分配系统(例如第一水性多相分配系统、第二水性多相分配系统)内的靶向物质。可以允许靶向物质与病毒结合或以其他方式相互作用(例如特异性地)。在一些实施方案中，靶向物质与病毒的结合改变了病毒在分配系统中的分配。例如，这可用于帮助区分第一病毒和第二病毒，例如冠状病毒和流感病毒。例如，靶向物质可以具有病毒结合部分(例如，如本文所讨论的)，其能够仅识别第一病毒而不识别第二病毒。因此，靶向物质与第一病毒的结合可以改变第一病毒的分配行为，但不改变第二病毒的分配行为，因为第二病毒不可被靶向物质识别(或可识别，但程度要小得多)。因此，病毒可以在存在靶向物质的情况下表现出显著不同的分配行为，这可以例如使用例如本文所述的那些的试剂或技术来测定。然而，应当理解，靶向物质不是必需的，并且在另一些实施方案中，病毒可以表现出可区别的分配行为，即在没有任何靶向物质的情况下，和/或试剂本身可以改变分配行为，例如在与病毒结合之后。
79.示例性靶向物质可以包括或包含但不限于抗体(例如，能够与蛋白质(例如本文针对冠状病毒、流感病毒等描述的蛋白质)结合)、或核酸(例如，能够与来自病毒的核酸(例如rna或dna)结合，例如使得病毒结合部分包含与病毒基因组的一部分基本上互补的核酸序列)。例如，抗体可以是iga。其他实例包括igg、igm、igd和ige。
80.另外，在一些情况下，靶向物质可导致病毒聚集。例如，靶向物质可能能够与两种或更多种病毒结合。例如，靶向物质可以包括两种或更多种抗体、核酸或其他能够与病毒结合的物质。
81.这样的系统的一个非限制性实例可以在图2中示意性地看到。在该图中，在左边示出了分配系统，并且添加了样品。样品可以是例如血液、痰、唾液、鼻液或其他生物流体，例如本文所述的那些。在该实例中，作为示意图，示出了两相分配系统，但是在另一些实施方案中，可以有两个或多于两个相。
82.在该实例中，样品可包含两种类型的病毒，以三角形和圆形示意性显示。三角形代表目的病毒，而圆形代表其他类型的病毒(并且在另一些实施方案中可存在超过一种类型的这样的病毒)。例如，在某些情况下，可存在2、3、4或更多种污染病毒和/或其他实体。最
初，样品可在两相之间随机分布，但是经过一些混合，系统可朝着平衡发展。例如，这可以通过以某种方式(例如搅拌、涡旋、离心等)搅动样品来促进。另外，在一些情况下，可以手动进行搅动。这样的搅动可以促进病毒在分配系统的不同相中的分布。这在图2中示意性地显示为完美分离(所有三角形在上方的相中并且所有圆形在下方的相中)，但是实际上，分离不一定总是100％有效。较少量的分离也是可能的，例如如本文所讨论的。在病毒分配到相中之后，可以测定一个或更多个相以(例如定性和/或定量(例如，作为浓度))测定这些相内的病毒。在一些情况下，可以使用信号传导部分来促进病毒的测定。例如，可以通过比色法、使用荧光、基于放射性等来测定病毒。在某些情况下，可以使用肉眼进行测定(例如，通过比色法测定病毒)，但是在一些情况下，可以使用其他测定技术，例如本文所述的那些技术来测定病毒。
83.系统的另一个非限制性实例在图3中示意性地显示。在该图中，病毒(圆圈)显示为无法在两个相之间分配(如“对照”实验中所示)，但是游离rna(三角形)可以分配(如“样品”实验中所示)。
84.可以使用多种技术来测定样品。例如，可以移出实验的底部相并将其用于测定目的病毒是否存在。作为另一个实例，可以测定实验中病毒的分布，顶部相内较高的病毒浓度与目的病毒的存在相关。在一些实施方案中，病毒或核酸可以在分配系统内原位测定，即不移出用于分析的一个或更多个相的等分试样，但是在另一些实施方案中，可从分配系统中移出一个或更多个相的等分试样，并将其用于测定病毒、核酸等。
85.应该理解，虽然分配被证明是一个理想化的系统，但事实上分配可能并不完美。例如，相的大小和/或相内的病毒浓度可以变化，例如在没有实现完美分离或分配的情况下。
86.作为另一个实例，图4中示出了示意图作为非限制性实例。在这种情况下，与底部相相比，顶部相相对较小。这例如在要分析和/或测定病毒的情况下可能是有用的，和/或可用于促进病毒的富集、样品纯化等。例如，在使用该系统之后，病毒可能存在于第一相(例如，底部相)中，而游离rna可能不会沿着目的病毒集中在第一相内。
87.作为又一个实例，图5中示出了示意图作为非限制性实例。在该实例中，允许病毒(三角形)在分配系统(例如水分配系统)的两相之间分配。相反，游离核酸(圆圈)(例如dna或rna)，在混合和平衡之后优先存在于分配系统的一个相中。因此，虽然病毒存在于两个相中，但游离核酸仅存在于单个相中(在该实例中为底部相)。可以测定顶部相以测定病毒，例如没有来自可能已经存在于样品中的游离核酸的干扰(或这种干扰要少得多)。例如，可以例如在分配系统内原位测定顶部相内的病毒，或者可以移出顶部相的等分试样以用于分析，例如如本文所讨论的。另外，在一些情况下，也可以类似地分析底部相，例如原位或使用等分试样，例如以测定病毒和/或游离核酸，但是应该理解这不是必需的。例如，在一组实施方案中，可以测定病毒和/或游离核酸并将其用于测定分配系数，如本文所述。
88.本公开内容的另一个方面涉及用于检测疾病或病症(例如感染)的存在或风险的方法和装置，如与病毒在两种基本上不混溶的液体的部分或相中的差异溶解度行为相关的。在一些实施方案中通常可以使用分配系统，包括水性分配系统，在其中测定病毒的分配行为。在一些情况下，可以区分不同的病毒，例如如本文所讨论的。
89.在一些实施方案中，病毒可以在分配系统(例如水性分配系统)的两种(或更多种)基本上不混溶的液体的相中进行分配。例如，在一些情况下，分配系统的两个相可具有不同
的分子结构。在平衡状态下，病毒与多个相的分子相互作用之间的差异可以使用相之间的分配系数的值来测定。例如，如果病毒的三维结构发生变化，则病毒的分配系数的值可发生变化。
90.可以选择用于制备自然分配成两相或更多相的分配系统的化学成分(例如，如下文所讨论的)，以便提供这种根据病毒的行为差异。一旦一种或更多种病毒被分配，就可以对每个相进行测定，例如通过免疫特异性测定，如elisa。可以测定每个相中的病毒。在一些情况下，分配系数k也可以根据每个相中病毒浓度比率来测定。
91.在一些实施方案中，每种病毒的k值可以选择为显著不同。例如，可以将针对对象测定的k值与先前针对具有已知健康状况(例如感染)的对象测定和记录的相似比率值进行比较。
92.在一组实施方案中，病毒可分配到两种或更多种基本上不混溶的液体的相(例如水相)中。不同的病毒在每个相中可进行差异分配。所述相可以具有不同的分子结构。在平衡状态下，病毒与多个相的分子相互作用之间的差异可以通过相之间病毒的差异溶解度来表现出来。另外，在一些情况下，病毒的分配行为可以使用靶向物质来改变，例如如本文所讨论的。
93.在一些实施方案中，仅分析其中一个相(例如水相)的病毒浓度；可以不使用比率计算，因为第二相用于分配但不用于测定(然而，在另一些实施方案中，可以分析超过一个相的病毒浓度，如本文所讨论的)。
94.在一些实施方案中，分配系统例如本文所述的那些的制备可以包括大规模机器人筛选化学成分，例如可溶性聚合物、盐和其他引起自发相分离(例如分离成两个或更多个相)的添加剂。这种筛选可旨在发现和/或优化这样的配方(formulae)以用于区分可以赋予病毒差异分配的那些。
95.在一些方面中，使得病毒具有差异溶解度的特征是液体分配系统。因此，某些实施方案利用用于在对象中检测疾病或病症的液体分配系统，其包含：两种或更多种液相，所述液相基本上不混溶。在一些情况下，一些或所有液相可具有水性组分。在一些实施方案中，与疾病或病症相关的多种物质可溶解。在一些情况下，相中病毒的浓度可与对象中疾病或病症的存在与否相关。
96.典型但非限制性的水相组分包括聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、以及乙二醇与丙二醇的共聚物中的至少一种。在一些实施方案中，液体分配系统可以包括基本上不混溶的相，其中一些或所有相可以具有水性组分。病毒可与每一层的化学物质(和水)发生不同的相互作用，并从而不同地溶解或分配。本文更详细地讨论了液体分配系统，包括水性液体分配系统和用于形成这样的系统的多种组合物。然而应当注意，本公开内容不仅限于例如如上所述的液-液分配，并且在另一些实施方案中还涵盖色谱(例如，液-液分配色谱)、异质两相系统，或多相异质系统)，以及其他用于产生分配系数或至少是表观分配系数的合适技术。
97.另外，根据本公开内容的某些方面，分子(例如病毒)的状态可受到许多不同因素的影响，所述因素包括但不限于病毒结构的变化、与一种或更多种其他生物分子或配体的相互作用等。不同状态的评价可以用作测定不同潜在物质对病毒等的潜在有效性的一种方法。
98.另外，在一些情况下，病毒在分配系统中的分配可以非常快。例如，在一些情况下，可在少于1小时、少于30分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟中发生显著性的分配。在一些情况下，在这些时间内，可已经发生了足够的分配以允许如本文所讨论的那样测定病毒，例如在分配系统的一个或更多个相中。例如，在这些时间内，可以通过比色法或用肉眼等来测定病毒的分配。
99.在一些方面中，分配系统的一个相可以被移出，并且任选地转移至第二分配系统。第二分配系统可以包括本文所述的任何系统，并且可以与第一分配系统相同或不同。
100.在一组实施方案中，分配系统的一个或更多个相可以包含病毒，其可以例如如本文所讨论的来测定。在一些情况下，可以使病毒变性，例如以从病毒释放核酸到分配系统中，例如以用于测定。例如，核酸可以包含dna和/或rna。例如，为了释放核酸，可以将病毒暴露于变性剂、碱性水解、isoquick、与蛋白酶k联合的裂解缓冲液、苯酚-氯仿提取然后乙醇沉淀、溶剂或洗涤剂灭活(例如，使用triton x-100)、巴氏灭菌(加热例如至至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃等的温度)、酸性(低ph)灭活或本领域普通技术人员已知的其他技术。
101.在又一组实施方案中，多种系统和方法(例如本文讨论的那些)可用于纯化生物流体样品。在一些情况下，生物流体样品可以来自对象，例如怀疑患有或暴露于特定病毒性疾病的对象。例如，在一个实施方案中，可以使用例如本文所述的分配系统从样品中移出游离核酸。
102.在一些情况下，系统和方法(例如本文所讨论的那些)可以在例如本文所述的那些的其他测试(例如鉴定测试如聚合酶链式反应(pcr)、包括本文所述的那些的测序技术等)之前使用。这可能很重要，例如在样品可能被例如来自相似病毒家族的密切相关的rna或dna物质污染的应用中，或对于区分不同类型的病毒(例如冠状病毒与流感病毒)等。在某些实施方案中，作为非限制性实例，来自样品的目的病毒或病毒组分可以被分配到或至少部分富集在分配系统(例如，水性多相分配系统)的一个相中，而其他物质可被分配到不同的相中。然后在一些情况下，包含或富集有目的病毒或其他病毒组分(例如rna，例如游离rna)的相可用于鉴定或测序测试等，例如本文所述的那些。
103.在一些实施方案中，通过选择分配系统的特性，游离rna或其他核酸可集中在分配系统(例如水性多相分配系统)的一个相中，使得该相与其他相之间的体积比较大。例如，可以选择分配系统以使两相的体积比为1:1或更多、1:2或更多、1:3或更多、1:5或更多、1:10或更多，1:20或更多、1:50或更多，或甚至更大，其中较小的体积是含有或富集游离核酸的相。在一些情况下，基本上所有的游离核酸都可存在于分配系统的一个相中。根据某些实施方案，分配系统的一个或更多个相中基本上所有游离核酸的存在可意味着大于或等于80％、大于或等于85％、大于或等于90％、大于或等于95％、或大于或等于97.5％的游离核酸可存在于该一个或更多个相中。
104.在某些情况下，可以通过测定来自病毒的核酸来测定病毒。例如，可以使病毒变性，例如如本文所讨论的，以从病毒内部释放核酸。本领域普通技术人员将能够测定核酸，例如使用与核酸结合的抗体等。例如，可以通过比色法测定核酸。在一些情况下，信号传导部分可以附接至核酸结合实体以(例如在分配系统内)促进检测。例如，与核酸结合的信号传导部分可用于测定分配。信号传导部分的非限制性实例包括溴乙锭或单叠氮溴乙锭、花
青染料(例如cy3、cy5等)、碘化丙锭、结晶紫、dutp-缀合探针、dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、7-aad(7-氨基放线菌素d)、hoechst 33258、hoechst 33342、hoechst 34580、yoyo-1、diyo-1、toto-1、dito-1等。信号传导部分的其他实例包括本文讨论的那些。
105.另外，在一些情况下，可以对核酸进行测序。本领域普通技术人员已知的测序技术的实例包括但不限于sanger法或其他合适的技术、链终止测序、杂交测序、maxam-gilbert测序、染料-终止子测序、链终止法、大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing)(lynx therapeutics)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、焦磷酸测序、连接测序、离子半导体测序、dna纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔测序、微流体sanger测序、数字rna测序(“digital rna-seq”)等。
106.在一些情况下，这样的信号传导部分例如本文描述的那些可以无外援地例如用肉眼来测定，但是在某些实施方案中可以使用检测器(例如描述的那些)。合适的检测器的非限制性实例包括显微镜(例如荧光显微镜)、读板仪、elisa读取器等。在一些情况下，信号传导部分可以通过比色测定。
107.作为另一个非限制性实例，信号传导部分可包含颗粒。颗粒可以是纳米颗粒，例如金纳米颗粒，其在一些实施方案中涂覆有病毒结合部分，例如rna。这些可以例如与含有病毒或其他病毒物质的分配系统原位混合。在分配系统中与靶病毒核酸杂交之后，颜色变化可用于指示特定靶病毒核酸的存在。在一些实施方案中，这可由于纳米颗粒的杂交特异性而具有高特异性。另外，在一些情况下，例如如果分配系统的一个相富集了靶病毒核酸，则颜色变化可相对集中在分配系统的一个相中。因此，特定于分配系统中一个相的颜色变化可用于测定靶病毒核酸。另外，在一些情况下，可将颜色变化的程度用于测定浓度。在一些情况下，这种双特异性测试可以达到pcr的诊断特异性，且具有其他比色筛选测定的速度和简单性。
108.在一些情况下，可以使用靶向物质。非限制性实例包括例如本文所述的那些的靶向物质。例如，靶向物质可导致病毒聚集。
109.颗粒可具有任何合适的尺寸。例如，颗粒的直径可大于或等于10nm、大于或等于50nm、大于或等于100nm、大于或等于500nm、大于或等于1微米，或更大。在一些实施方案中，颗粒的直径小于或等于5微米、小于或等于1微米、小于或等于500nm、小于或等于100nm、或更小。这些范围的组合是可以的。例如，在一些实施方案中，颗粒的直径可大于或等于10nm且小于或等于5微米。
110.如本文所述的颗粒可包含任何合适的材料。在一些实施方案中，颗粒可包含金属。例如，颗粒可以包含金、银、钛或任何其他合适的材料。颗粒还可以包含适用于给定实施方案的聚合物或陶瓷材料。
111.另外，根据本公开内容的一些方面，提供了能够自动和/或重复进行本文所述的任何方法的计算机和/或自动化系统。本文中使用的“自动化”装置是指能够在没有人指导的情况下操作的装置，即自动化装置可以在任何人完成采取任何行动以促进功能(例如通过将指令输入计算机)之后的一段时间内进行该功能。通常，自动化设备可以在该时间点之后进行重复功能。可以利用计算机或其他自动化系统的技术的一个具体实例是在这样的过程中，其中系统的生理状况通过测定来自系统的样品的一种或更多种物质与分配系统的多种相互作用组分之间的相互作用的相对量度来测定。在临床环境中，这可以通过抽取血液样
品(毫升大小或非常小的样品，例如一滴或更少)并将血液样品或其亚组(例如血浆)进行多相分配过程来完成。然后可以将该过程的结果与类似系统中标志物的类似行为进行比较，该结果可以采用电子存储数据的形式。
112.本公开内容的多个实施方案也可以专门以硬件，或者以软件和硬件的组合来实现。例如，在一个实施方案中，不是使用传统的个人计算机，而是使用可编程逻辑控制器(programmable logic controller，plc)。如本领域技术人员所知，plc经常用在不需要通用计算机费用的多种过程控制应用中。plc可以以已知方式配置以执行一种或多种控制程序，并且能够以类似于个人计算机的方式接收来自用户或另一装置的输入和/或向用户或另一装置提供输出。因此，虽然本公开内容的一些实施方案是根据通用计算机来描述的，但是应当理解通用计算机的使用仅仅是示例性的，因为可以使用其他配置。
113.本文中使用的“水性”是指溶剂/溶质系统的特征性性质，其中溶剂化物质主要具有亲水特征。水性溶剂/溶质系统的实例包括其中水或含水组合物为主要溶剂的系统。
114.本文中使用的“分配系统”是指具有以下的任何物质：至少两个相、部分、区域、组分等，其中至少两个可与其所暴露的至少一种物质不同地相互作用。例如，分配系统可以包括固体表面的不同区域(其可以与暴露于不同部分的特定分子不同地相互作用)，多相系统例如多相液体系统，例如水性/非水性系统或水性多相系统(如本文所定义)(一种或更多种物质可暴露并任选地溶解于其中，所述物质中的至少一些可与不同相不同地相互作用)。例如，特定物质可对一个相而不是另一个相具有更大的亲和力，以至于多相分配系统可以将物质从混合物中分离出来，或导致物质至少以某种方式在相之间不同地分配。
115.本文中使用的“水性多相系统”是指这样的水性系统，其包括物质可驻留于其中的多于一个水相，并且可用于根据本文所述的方法表征物质的结构状态。例如，水性多相系统可以在平衡时分离成两个、三个或更多个不混溶的相。水性多相系统在本领域中是已知的，并且本文中使用的该短语并不意味着与本领域中接受的含义不一致。本文讨论了多种水性多相系统及其组合物的实例。
[0116]“相互作用组分”意指例如多相系统的相的组分，其可以与物质相互作用并提供关于该物质的信息(例如，对该物质的亲和力)。暴露于物质的多个相互作用组分可以定义一个系统，该系统可以提供每种组分和物质之间的“相互作用的相对量度”。相互作用组分可以是水性或非水性的，可以是聚合的、有机的(例如蛋白质、小分子等)、无机的(例如盐)等，或其任意组合。一组相互作用组分可以形成可用于并部分定义任何实验方法的系统，所述方法用于根据本文描述的方法表征物质的结构状态。通常，相互作用组分的系统可以测量物质与至少两个相互作用组分之间的相对相互作用。水性多相系统是相互作用组分的系统的一个实例，并且应当理解，在本文中使用“水性系统”或“水性多相系统”时，这仅仅是举例，并且可以使用任何合适的相互作用组分的系统。
[0117]
在本文描述水性两相和水性多相系统的情况下，应理解，也可使用如本文所用的其他系统，即与仅包含水溶液或混悬液的系统类似的系统。例如，水性两相系统可以在一个或更多个相中包括在性质上不是液体的非水性组分。在该方面，多相系统还涉及依赖于生物分子对一种介质相对于另一种介质的不同亲和力的相关技术，其中生物分子在一种介质和任选地另一种介质之间的运输发生在水性环境中。这样的多相系统的实例包括但不限于如本领域普通技术人员已知的用于液-液分配色谱的hplc柱或系统。
[0118]
本文中使用的关于特定物质的“相互作用的相对量度”意指物质与另一种物质或与多相系统的相在相对意义上的相互作用的程度。例如，特定物质可对多相系统的一个相而不是另外的相具有更大的亲和力，该特定物质与该相而不是其他相相互作用的程度或驻留于该相而不是其他相中的程度定义了其相互作用的相对量度。在本公开内容的上下文中，相互作用的相对量度通常以比率方式而不是绝对方式来测定。也就是说，当物质可以与两相系统的每一相相互作用但更优选地驻留于一个相中而不是另一相中时，本公开内容通常利用关于两相中的每一相中的物质浓度的比率的信息，但不一定是任一相中物质的绝对浓度。在另一些情况下，相互作用可以是不基于特定物质在特定溶剂或流体载体内的驻留的相互作用，而是具有固体表面(例如色谱柱的固相)的相互作用，其中相对量度本身表现为洗脱时间，或者可以涉及几何或空间相互作用，例如特定物质与多孔基材的相互作用，而不是不同物质或不同基材的相互作用。
[0119]
本文中使用的“分配系数”是指由平衡时多相系统的两相或更多相中的物质的浓度或化学活性的比率定义的系数。例如，物质在两相系统中的分配系数(k)可以定义为物质在第一相中与其在第二相中浓度的比率。对于多相系统，可以有多个分配系数，其中每个分配系数定义了物质在第一选择相和第二选择相中的比率。将认识到在任何多相系统中分配系数的总数将等于相的总数减一。
[0120]
对于异质相系统，本文中使用的“表观分配系数”是指描述了从与相之间的相对分配相关的替代技术获得的信息的系数。例如，如果使用的异质两相系统是hplc柱，则该“表观分配系数”可以是物质的相对保留时间。本领域普通技术人员将认识到，在这样的情况下，物质的保留时间反映了物质在第一流动相和第二固定相之间的平均分配。此外，将认识到，物质的其他类似可测定的特性也可用于量化物质的物理特性的差异(例如在另一些技术中)，并因此适合用作表观分配系数。
[0121]
本文中使用的“结合”意指公知的受体/配体结合，以及生物分子与其结合配偶体之间的其他非随机缔合。本文中使用的“特异性地结合”描述了结合配偶体或其他配体，其基本上不与除指定的一个或更多个生物分子之外的任何生物分子发生交叉反应。通常，优先相互结合的分子称为“特异性结合对”。这样的对包括但不限于抗体及其抗原、凝集素及其结合的碳水化合物、酶及其底物、以及激素及其细胞受体。如通常使用的，术语“受体”和“配体”用于鉴定结合分子对。通常，术语“受体”被分配给特异性结合对的成员，其是一类以其结合活性而闻名的分子，例如抗体。术语“受体”也优先赋予一对中尺寸较大的成员，例如在凝集素-碳水化合物对的情况下赋予凝集素。然而，本领域技术人员将认识到受体和配体的鉴定在某种程度上是任意的，并且术语“配体”可用于指代在其他情况下称为“受体”的分子。有时使用术语“抗配体”来代替“受体”。
[0122]“分子-分子相互作用”，例如生物分子-生物分子相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用等意指通常比“结合”更弱的相互作用，即基于氢键、范德华结合、伦敦力的相互作用和/或有助于一个分子对另一个分子的亲和力的其他非共价相互作用，该亲和力可借助于结构特征，例如一个分子符合另一个分子或另一个分子的一部分的能力。分子-分子相互作用可以涉及结合，但不是必须的。
[0123]
本文中使用的“生物分子”意指通常来源于对象的分子，并且其通常包括构建单元，其包括核苷酸等。实例包括但不限于肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、核苷酸、寡核苷
molecules”，2004年12月23日公开为国际专利申请公开no.wo2004/111655；美国专利申请公开no.2015-0219655，题为“methods and devices for analyzing species to determine diseases”；2020年5月10日提交的美国专利申请序列号62/987,385，题为“systems and methods for determining viruses such as coronaviruses”；2020年2月28日提交的美国专利申请序列号62/982,880，题为“systems and methods for determining viruses such as coronaviruses”；2020年3月10日提交的美国专利申请序列号62/987,385，题为“systems and methods for determining viruses such as coronaviruses”；2020年8月28日提交的美国专利申请序列号63/071,472，题为“systems and methods for determining viruses such as coronaviruses”；2020年10月14日提交的美国专利申请序列号63/091,849，题为“systems and methods for determining viruses such as coronaviruses”；2020年3月26日提交的美国专利申请序列号63/000,441，题为“determination of viruses such as coronaviruses based on viral proteins”；以及2020年4月1日提交的美国专利申请序列号63/003,843，题为“determination of viruses such as coronaviruses based on viral proteins”。另外，chait等于2021年3月17日提交的题为“rna separation and related techniques for determining viruses such as coronaviruses”的美国临时专利申请序列号63/162,485也通过引用整体并入本文。
[0132]
以下实施例旨在举例说明本公开内容的某些实施方案，但不示例本公开内容的全部范围。
[0133]
实施例1
[0134]
该实施例举例说明了主要基于rna的负电荷而将其仅分配至水性两相系统(aqueous two-phase system，atps)的一个相中。
[0135]
制备以下水性两相系统。
[0136]
atps 1：用葡聚糖-75(平均分子量为75,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)、0.15m nacl和0.01m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0137]
atps 2：用葡聚糖-75(平均分子量为75,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)和0.09m nacl和0.05m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0138]
atps 3：用葡聚糖-75(平均分子量为75,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)和0.11m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0139]
atps 4：用(平均分子量为70,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)和0.01m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0140]
atps 5：用(平均分子量为70,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)、1.00m tmao和0.01m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0141]
atps 6：用(平均分子量为70,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)、1.50m tmao和0.01m磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。
[0142]
rna标准品的分配。将rna标准品用作样品，该rna标准品是1200bp(中等大小)的卡那霉素(kanamycin)抗性基因转录物，其是promega提供的rna系统的标准组分(批次454662)，允许在宽动态范围内准确检测rna。将rna标准品(25微升，100微克/ml)
和相应量(分别为163微升)的1
×
pbs添加至系统中。准备空白系统用于比较。将系统摇动并在具有微板转子的冷冻离心机(universal320r,hettich,germany)中以3,500rpm(1160g)离心30分钟，且将温度维持在23℃以加速相沉降。从离心机中取出微管，并从顶部相和底部相取出75微升等分试样以使用rna系统进行分析。将rna系统用于量化rna的浓度。将两相均用1
×
te缓冲液(rna系统稀释剂)稀释3倍，混合并一式两份转移10微升至含有200微升/孔的rna染料工作溶液(在1
×
te缓冲液中以1:400稀释)的荧光微板。使用板振荡器将板彻底混合，然后将测定在室温下孵育5分钟，同时混合，避光，并使用读板器(fluostar omega酶标仪,bmg labtech,nc,usa)测量荧光(492nm
ex
/540nm
em
)。
[0143]
rna分配。将rna标准品的分配系数测定为顶部相与底部相浓度(以fu为单位)的比率，并且结果在下表中示出(2次重复的平均值)。
[0144][0145][0146]
因此，上面的实施例举例说明了带负电荷的rna通常被分配至水性两相分配系统的一个相中。
[0147]
实施例2
[0148]
该实施例举例说明了主要基于rna的负电荷而将其仅分配至水性两相系统(atps)的底部相中，系统显示将sars-cov-2完整病毒体分配至顶部相和底部相二者中，因此允许
通过随后仅对顶部相进行分子检测来检测其rna来直接检测完整病毒体。
[0149]
用usb提供的平均分子量为75,000的葡聚糖-75(批次119945)、购自sigma的平均分子量为8000的聚乙二醇peg-8000(批次slbw6815)和磷酸钠缓冲液(napb)(ph 7.4)制备水性两相系统。使用hamilton(reno,nv,usa)ml-4000四探针液体处理工作站将适量的聚合物和napb(ph 7.4)储备溶液分配至1.2ml微管中，用于最终系统(样品添加之后，见下文)总重量0.5g(总体积约466微升)。
[0150]
rna标准品的分配。将rna标准品用作样品，该rna标准品是1200bp(中等大小)的卡那霉素抗性基因转录物，其是promega提供的rna系统的标准组分(批次454662)，允许在宽动态范围内准确检测rna。将rna标准品(25微升，100微克/ml)和相应量(分别为163微升)的1
×
pbs添加至系统中。准备空白系统用于比较。将系统摇动并在具有微板转子的冷冻离心机(universal 320r,hettich,germany)中以3,500rpm(1160g)离心30分钟，且将温度维持在23℃以加速相沉降。从离心机中取出微管，并从顶部相和底部相取出75微升等分试样以使用rna系统进行分析。将rna系统用于量化rna的浓度。将两相均用1
×
te缓冲液(rna系统稀释剂)稀释3倍，混合并一式两份转移10微升至含有200微升/孔的rna染料工作溶液(在1
×
te缓冲液中以1:400稀释)的荧光微板。使用板振荡器将板彻底混合，然后将测定在室温下孵育5分钟，同时混合，避光，并使用读板器(fluostar omega酶标仪,bmg labtech,nc,usa)测量荧光(492nm
ex
/540nm
em
)。
[0151]
rna分配。将rna标准品的分配系数测定为顶部相与底部相浓度(以fu为单位)的比率，并且结果在下表中示出(2次重复的平均值)。rna仅存在于底部相中。该rna标准品因其负电荷而被分配至底部相，这是与其他带负电荷的rna共有的特性。
[0152][0153]
完整病毒体分配。测试的病毒是sars-cov-2uthsc第3代(sars相关冠状病毒2分离株usa-wa1/2020)和h1n1(pr8)。病毒储液(stock virus)的滴度为2
×
106pfu/ml(sars cov-2)和1
×
108pfu/ml(pr8)。病毒的接种量是4
×
104pfu(sars cov-2和pr8)。用于噬斑测定的细胞系是vero e6(sars cov2)和mdck(pr8)。
[0154]
用取自顶部相和底部相的等分试样进行标准噬斑测定，如下：
[0155]
顶部相pfu稀释因子顶部pfu/ml底部相pfu稀释因子底部pfu/ml202200442440
[0156]
上述结果表明，如果例如要测试包含sars-cov-2的完整病毒体和相同病毒(死病毒)的游离rna二者以及其他生物物质的临床样品，则在分配之后仅获得顶部相的等分试样，并随后使用特定于病毒rna的分子测试(例如rt-pcr)，将直接检测原始样品中完整病毒体的存在或不存在。
[0157]
实施例3
[0158]
该实施例提供了来自实施方案之一的验证研究的结果，以测定从怀疑携带病毒的患者获得的临床样品的感染性潜力。
[0159]
在克利夫兰诊所(cleveland clinic)对疑似sars-cov-2感染的患者进行筛查，通过将鼻咽拭子置入盐水(utm或vtm)，然后针对orf1a/b非结构区域和e包膜区域进行rt-pcr(roche diagnostics cobas8800)检测限(ct)为约35。将测定为pcr阳性的患者的剩余样品等分到两个或更多个单独的试管中。将样品的400微升等分试样添加至含有atps系统的两个管的每一个中，该atps系统包含葡聚糖-75(平均分子量为75,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)和0.11m磷酸钠缓冲液(napb)(使用了ph 7.4)。将管密封，通过倒置25次轻轻混合，并在小型离心机中离心1分钟直至相分离。将来自顶部相的等分试样(350微升)添加至100微升pbs中并混合，并且随后进行上述标准rt-pcr方案。
[0160]
roche8800系统是全封闭且自动化的pcr系统，带有用于污染控制的hepa在线过滤器，用于基于全自动样品制备(核酸提取和纯化)随后通过pcr扩增和检测来运行sars-cov-2和甲型/乙型流感测定。靶标特异性正向和反向引物用于sars-cov-2特有的orf1a/b非结构区域以及包膜中的e基因。下表概述了结果解释，其中靶标1是orf1 a/b并且靶标2是e基因。
[0161][0162]
顶部相等分试样的rt-pcr分析的结果解释如下：
[0163]
1.对于大于测定检测限(对于roche cobas 8800为35)的ct，样品中未检测到完整的病毒颗粒。
[0164]
2.对于低于检测限的ct，在样品中检测到完整的病毒颗粒，这可能表明患者能够传播病毒(取决于病毒的类型和传播方式，例如通过气溶胶传播sars-cov-2)。
[0165]
将来自在atps测定之前分离的原始收集管的样品送到美国陆军传染病医学研究所(united states army medical research institute of infectious diseases)((ft.detrick,md)的高生物安全实验室进行病毒培养，以进行基于pcr的感染检测，以作为验证原始样品中完整功能性病毒颗粒的存在或不存在的预测的金标准。
[0166]
将atcc vero76细胞接种在24孔板中，并且在实验开始时为约100％汇合。将样品在生长培养基中以1:100的比率稀释。从板中倒出培养基，并添加病毒接种物。对于阴性对
照，仅向孔中添加培养基，而阳性对照由前面提到的wa-1/2020sars2分离株的1:100接种物组成。该阳性对照输入相当于7.19
×
103pfu/ml或3595pfu/孔的病毒输入。然后将细胞在37℃/5％co2下培养两天，此时从孔中收集200微升上清液并用3:1比例的trizol ls灭活。将初始接种物也以相同方式制备为trizol ls样品，并代表第0天时间点样品。样品以生物学重复制备。
[0167]
使用病毒微型2.0提取试剂盒按照制造商的建议，使用ez1advanced提取机器人提取trizol ls灭活的上清液。然后使用先前报道的旨在检测sars2 e基因的rt-pcr测定对所有提取的样品进行分析。反应在lightcycler 480(roche)上进行，循环条件如下：50℃进行10分钟(1个循环)；95℃进行3分钟(1个循环)；95℃进行10秒/56℃进行15秒/72℃进行5秒(45个循环)；和40℃进行30秒(1个循环)。在每个72℃步骤结束时读取一次荧光读数，并且如果ct值小于40个循环，则认为样品为阳性。一式三份对样品进行技术测定，并对ct进行平均。然后从第0天的值中减去第2天的ct值以测定ct的变化(δct)，并且如果该值为正(即第2天的ct低于第0天的值)，则解释为功能性病毒在样品中复制，并且解释被宣布为阳性或感染性。相反，如果ct(δct)的变化为负或零，则没有观察到生长，并且样品被宣布为功能性病毒含量为阴性或无感染性。将代表sars2 e基因靶序列的合成rna模板用作阳性对照。该测定的检测限为约10,000个基因组拷贝/ml。atps结果的预测结果和数个实验的验证培养结果在下表中示出。
[0168][0169]
实施例4
[0170]
该实施例举例说明了使用某些实施方案进行sars-cov-2临床感染性测试以测定样品中可能存在完整病毒体的一个过程。该过程的步骤包括：
[0171]
1.从患者获得临床样品。在呼吸道病毒例如sars-cov-2的情况下，通常在rt-pcr之前使用鼻咽拭子置入盐水或其他介质中。在血源性病毒(blood-borne virus)的情况下，可以使用全血。其他生物介质可以包括唾液、尿、宫颈液或与感染介质(infective agent)相关的任何其他体液。
[0172]
2.将所述样品引入到atps系统中并按需要根据标准方案对系统进行处理以混合并分离相。
[0173]
3.从已知不含不包含在完整的完整病毒颗粒中的rna的相之一中取出等分试样。
[0174]
4.按照方案进行pcr或其他核酸检测。
[0175]
5.将所述pcr或其他核酸检测的阳性结果解释为指示原始样品中存在完整的完整病毒颗粒，从而指示患者的潜在感染状态。
[0176]
在该实施例中，在克利夫兰诊所对疑似sars-cov-2感染的患者进行筛查，通过将
鼻咽拭子置入盐水(utm或vtm)，然后针对orf1 a/b非结构区域和e包膜区域进行rt-pcr(roche diagnostics cobas8800)检测限(ct)为约35。将样品的400微升等分试样添加至含有atps系统的两个管的每一个中，该atps系统包含葡聚糖-75(平均分子量为75,000)、聚乙二醇peg-8000(平均分子量为8,000)和0.11m磷酸钠缓冲液(napb)(使用了ph 7.4)。将管密封，通过倒置25次轻轻混合，并在小型离心机中离心1分钟直至相分离。将来自顶部相的等分试样(350微升)添加至100微升pbs中并混合，并且随后进行上述标准rt-pcr方案。数位患者的结果在下表中示出：
[0177]
样品idpcr taq路径epcr taq路径orf 1解释122.823.5感染性228.329.8感染性3未检出未检出非感染性
[0178]
虽然本文中已经描述和举例说明了本公开内容的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易地想到用于进行本文中描述的功能和/或获得本文中描述的结果和/或一项或更多项优势的多种其他方式和/或结构，并且这样的变化和/或修改各自均被认为在本公开内容的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易认识到，本文中描述的所有参数、尺寸、材料和配置意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定的应用或本公开内容的教导所用于的应用。本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验测定本文中所描述的公开内容的具体实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅通过举例示出，并且在所附权利要求书及其等同方案的范围内，本公开内容可以以不同于具体描述和要求保护的其他方式实践。本公开内容涉及本文中描述的每个单独的特征、系统、制品、物质、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、物质、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、物质、试剂盒和/或方法的任意组合包含在本公开内容的范围内。
[0179]
在本说明书和通过引用并入的文件包含冲突和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文件相对于彼此包括冲突和/或不一致的公开内容，则以生效日期靠后的文件为准。
[0180]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义的术语的普通含义。
[0181]
除非明确地指出相反，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解成意指“至少一者”。
[0182]
如本文在说明书中和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分开存在的要素。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即所连接要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”从句具体地所指明的要素之外，其他要素任选地存在，不管与具体地所指明的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用可以在一个实施方案中仅指代a(可选地包含除b之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指代b(可选地包含除a之外的元素)；在又一个实施方案中，指代a和b二者(任选地包含其他元素)；等。
[0183]
如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相
同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应理解为包括，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，并且任选地包括另外的未列举项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当用于权利要求时“由其组成”，是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当前面有排他性术语(例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“恰好其一”)时，如本文中使用的术语“或”仅应理解为表示排他性替选方案(即，“一个/种或另一个/种，但并非二者”)。
[0184]
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，短语“至少一者”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表中具体列举的各个和每个要素中的至少一者，也不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可以任选地存在除在短语“至少一个”所提及的要素列表中具体指出的要素之外的要素，无论其与具体指出的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一者”(或等同地，“a或b中的至少一者”，或等同地，“a和/或b中的至少一者”)在一个实施方案中可以指至少一个a，任选地包括多于一个a，而不存在b(并且任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个b，任选地包括多于一个b，而不存在a(并且任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中，可以指至少一个a，任选地包括多于一个a，以及至少一个b，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其他要素)；等等。
[0185]
当在本文中提及数字使用词语“约”时，应理解，本公开内容的另一个实施方案包括未通过存在词语“约”修饰的数字。
[0186]
还应理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于所记载的该方法的步骤或动作的顺序。
[0187]
在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应当分别是封闭式或半封闭式的过渡性短语。