工程化CRISPR-Cas13f系统及其用途的制作方法

本文所公开的主题通常涉及用于利用包含工程化cas13f多肽的系统进行靶rna修饰和编辑的系统、方法和组合物。特别地，本公开提供包含新型工程化cas13f多肽和至少一种靶向核酸组分的rna靶向组合物。

背景技术：

1、crispr-cas13正迅速成为一种广泛采用的rna编辑技术。该系统可以使用其序列特异性指导rna选择性地修饰(例如，经由内切核酸酶活性切割(cut或cleave))靶rna，如mrna。与通过基于dna的编辑引入的永久性基因组变化相比，rna在转录水平控制基因表达，从而提供更安全且更可控的基因疗法方法。由于crispr-cas13系统的rna编辑效率高，它们已广泛用于多种生物中，包括酵母、植物、哺乳动物和斑马鱼(参见abudayyeh等人,2017；aman等人,2018；cox等人,2017；jing等人,2018；konermann等人,2018)。crispr-cas13d的直系同源物casrx可以在体内介导rna敲低，并有效缓解各种小鼠模型中的疾病表型(he等人,protein cell[蛋白与细胞]11:518-524,2020；zhou等人,cell[细胞]181:590-603e516,2020；以及zhou等人,national science review[国家科学评论]7:835-837,2020)。

2、然而，目前鉴定的这些cas13蛋白的一个缺点是，它们在通过基于crrna的靶序列识别激活后全部都具有非特异性/旁切(collateral)rna酶活性。这种活性在cas13a和cas13b中特别强烈，并且仍然例如以可检测的方式存在于cas13d中以及在较小程度上存在于cas13e中。虽然这种特性可以有利地用于核酸检测方法中，但这些cas13蛋白的非特异性/旁切rna酶活性也会导致不希望的邻近rna的旁切降解，并对它们的体内应用(例如在基因疗法中)施加了巨大的障碍。

3、另一方面，对于依赖旁切活性进行灵敏检测的实际效用(如sherlock)，具有表现出甚至比野生型cas13f更高的旁切活性的突变体cas13f效应蛋白可以是有益的。

4、因此，本领域需要进一步优化野生型cas13以用于不同目的，例如，降低旁切活性，使其具有针对某些用途(如治疗应用)的可接受的中靶切割活性；或增强/增加旁切活性，使其具有针对某些其他用途(如诊断应用)的可接受的中靶切割活性。

5、在本技术中对任何文献的引用或标识均不是承认该文献可作为本公开的现有技术获得。

技术实现思路

1、本公开的一个方面提供工程化cas13f多肽，其中所述工程化cas13f多肽：

2、(1)包含在空间上接近以下的区域中的突变：a)(例如，seq id no:1的)参考cas13f多肽的n-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序(例如，n-末端内切核酸酶催化rnfysh基序)，和/或b)所述(例如，seq id no:1的)参考cas13f多肽的c-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序(例如，c-末端内切核酸酶催化rnkalh基序)；

3、(2)基本上保留(例如，具有至少约50％、60％、70％、72.5％、75％、77.5％、80％、82.5％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的)所述(例如，seqid no:1的)参考cas13f多肽对与间隔序列互补的靶rna的间隔序列特异性切割活性；以及

4、(3)基本上缺乏(例如，具有不超过约50％、45％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或更少的)所述(例如，seq id no:1的)参考cas13f多肽对不与所述间隔序列结合的非靶rna的间隔序列非依赖性旁切活性。

5、在一些实施方式中，所述区域包括距离所述n-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序或所述c-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序的任何残基在140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个氨基酸以内的残基。

6、在一些实施方式中，所述区域包括距离所述n-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序或所述c-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序的任何残基在100、110、120或130个残基以外，但在空间上在所述n-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序或所述c-末端内切核酸酶催化rxxxxh基序的任何残基的约1埃至约10埃以内或约5埃的残基。

7、在一些实施方式中，所述区域包含对应于seq id no:1的所述参考cas13f多肽的以下结构域的残基、基本上由其组成、或由其组成：hepn1结构域(例如，残基1-168)、idl结构域(例如，残基168-185)、helical1结构域(例如，helical1-1(hel1-1)结构域(例如，残基185-234)、helical1-2(hel1-2)结构域(例如，残基281-346)、helical1-3(hel1-3)结构域(例如，残基477-644))、helical2结构域(例如，残基346-477)、或hepn2结构域(例如，残基644-790)。

8、在一些实施方式中，所述突变包含在所述区域内的一段约8个至约20个(例如，约9个或约17个)连续氨基酸内的以下、基本上由其组成、或由其组成：

9、(a)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)非ala(a)残基至ala(a)残基的取代；

10、(b)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)带电荷的残基、含氮侧链基团的残基、大的(如f或y)残基、脂肪族残基、和/或极性残基至电荷中性的短链脂肪族残基(如a、v或i)的取代；

11、(c)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)ile(i)和/或leu(l)残基至ala(a)残基的取代；和/或

12、(d)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)ala(a)残基至val(v)残基的取代。

13、在一些实施方式中，所述一个或多个非ala残基和/或所述一个或多个带电荷的或极性残基包含n、q、r、k、h、d、e、y、s、t、l残基或其组合。

14、在一些实施方式中，所述一个或多个非ala残基和/或所述一个或多个带电荷的或极性残基包含n、q、r、k、h、d、y、l残基或其组合。

15、在一些实施方式中，所述一段内的一个或多个y残基被取代。

16、在一些实施方式中，所述一个或多个y残基对应于seq id no:1的所述参考cas13f多肽的y666和/或y677。

17、在一些实施方式中，所述一段内的一个或多个d残基被取代。

18、在一些实施方式中，所述一个或多个d残基对应于seq id no:1的所述参考cas13f多肽的d160和/或d642。

19、在一些实施方式中，所述电荷中性的短链脂肪族残基是ala(a)。

20、在一些实施方式中，所述突变包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：

21、(a)在所述区域内的一段约8个至约20个(例如，约9个或约17个)连续氨基酸中的1、2、3、4或5个所述段内的取代；

22、(b)对应于以下突变(例如，表1-5中的任何一个)或其组合的突变，所述突变导致工程化cas13f多肽具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性和不超过约25％的间隔序列非依赖性旁切活性；和/或

23、(c)对应于表5中的f7v2、f10v1、f10v4、f40v4、f40s22、f40s26、f40s36、f10s21、f10s24、f10s26、f10s27、f10s33、f10s34、f10s35、f10s36、f10s45、f10s46、f10s48、f10s49、f40s23、或f40s27突变或其组合的突变。

24、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽保留seq id no:1的所述参考cas13f多肽对所述靶rna的间隔序列特异性切割活性的至少约50％、60％、70％、72.5％、75％、77.5％、80％、82.5％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。

25、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽具有seq id no:1的所述参考cas13f多肽对所述非靶rna的间隔序列非依赖性旁切活性的不超过50％、45％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或更少。

26、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽具有seq id no:1的所述参考cas13f多肽对所述靶rna的间隔序列特异性切割活性的至少约80％，以及seq id no:1的所述参考cas13f多肽对所述非靶rna的间隔序列非依赖性旁切活性的不超过约40％。

27、在一些实施方式中，所述突变是f40s23(即，y666a/y677a双重突变)。

28、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽包含seq id no:3的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。

29、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽进一步包含对应于表6中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)突变(如，d160a、d642a和/或l641a)的组合的突变。

30、在一些实施方式中，所述突变是表6中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)单一突变(如，d160a、d642a和/或l641a)与f40s23(即，y666a/y677a双重突变)的组合。

31、在一些实施方式中，所述突变是y666a/y677a双重突变与选自d160a、l641a和d642a的1、2或3个突变的组合。

32、在一些实施方式中，所述突变是表7-12中的任何组合突变。

33、在一些实施方式中，所述突变是d160a/d642a/y666a/y677a四重突变。

34、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的工程化cas13f多肽相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

35、在一些实施方式中，所述突变是对应于表13-16中的突变与d160a/d642a/y666a/y677a突变的组合的突变。

36、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽包含seq id no:4的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。

37、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽进一步包含非碱性氨基酸残基至arg(r)残基的氨基酸取代。

38、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽进一步包含对应于表13-16中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)单一突变的组合的突变。

39、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽与seq id no:4的工程化cas13f多肽相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

40、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽与所述seq id no:1的参考cas13f多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％且小于100％的序列同一性。

41、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽进一步包含核定位信号(nls)序列或核输出信号(nes)。

42、在一些实施方式中，所述工程化cas13f多肽进一步包含n-末端和/或c-末端nls。

43、本公开的另一方面提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开的工程化cas13f多肽。

44、在一些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化以在真核生物、哺乳动物如人或非人哺乳动物、植物、昆虫、鸟、爬行动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、鱼、蠕虫/线虫或酵母中表达。

45、本公开的另一方面提供crispr-cas13f系统，所述crispr-cas13f系统包含：

46、a)本公开的工程化cas13f多肽或其多核苷酸编码序列(例如，dna编码序列或rna编码序列)；以及

47、b)指导rna(grna)或其多核苷酸编码序列(例如，dna编码序列或rna编码序列)，所述grna包含：

48、i.能够与所述工程化cas13f多肽形成复合物的同向重复(dr)序列；和

49、ii.能够与靶rna杂交并将所述复合物引导或募集至所述靶rna的间隔序列。

50、在一些实施方式中，所述dr序列具有与seq id no:2中的二级结构基本上相同的二级结构。

51、在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为30个核苷酸。

52、本公开的另一方面提供载体，所述载体包含本公开的多核苷酸。

53、在一些实施方式中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，所述多核苷酸与增强子可操作地连接。

54、在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，广谱启动子(ubiquitous promoter)，或者细胞、组织或器官特异性启动子。

55、在一些实施方式中，所述载体是质粒。

56、在一些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(hsv)载体、aav载体或慢病毒载体。

57、在一些实施方式中，所述aav载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12、aav 13、aav.php.eb或aav-dj的重组aav载体。

58、在一些实施方式中，所述aav载体是包封rna的aav载体。

59、本公开的另一方面提供递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物(vehicle)，和(2)本公开的工程化cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的crispr-cas13f系统、或本公开的载体。

60、在一些实施方式中，所述递送媒介物是纳米颗粒(例如，lnp)、脂质体、外泌体、微泡或基因枪。

61、本公开的另一个方面提供细胞或其后代，所述细胞或其后代包含本公开的工程化cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的crispr-cas13f系统、本公开的载体、或本公开的递送系统。

62、在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞(例如，非人哺乳动物细胞、人细胞或植物细胞)或原核细胞(例如，细菌细胞)。

63、本公开的另一方面提供非人类多细胞真核生物，所述非人类多细胞真核生物包含本公开的细胞或后代。

64、在一些实施方式中，所述非人类多细胞真核生物是针对人遗传障碍的动物(例如，啮齿动物或灵长类动物)模型。

65、本公开的另一方面提供修饰靶rna的方法，所述方法包括使靶rna与本公开的crispr-cas13f系统、本公开的载体、本公开的递送系统、或本公开的细胞或后代接触。

66、在一些实施方式中，通过由所述工程化cas13f多肽进行切割来修饰所述靶rna。

67、在一些实施方式中，所述靶rna是mrna、trna、rrna、非编码rna、lncrna或核rna。

68、在一些实施方式中，在所述工程化cas13f多肽和所述指导rna的复合物与所述靶rna结合后，所述工程化cas13f多肽不会表现出实质性的(或可检测的)间隔序列非依赖性旁切活性。

69、在一些实施方式中，所述靶rna在细胞内。

70、在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞。

71、在一些实施方式中，所述细胞受感染原感染。

72、在一些实施方式中，所述感染原是病毒、朊病毒、原生动物、真菌或寄生物。

73、在一些实施方式中，所述细胞是神经元细胞(例如，星形胶质细胞、神经胶质细胞(例如，穆勒神经胶质细胞(muller glia cell)、少突胶质细胞、室管膜细胞、施万细胞(schwan cell)、ng2细胞或卫星细胞))。

74、在一些实施方式中，所述crispr-cas13f系统由以下编码：编码所述工程化cas13f多肽的第一多核苷酸，以及包含或编码所述指导rna的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸被引入所述细胞中。

75、在一些实施方式中，通过同一个的载体将所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸引入所述细胞中。

76、在一些实施方式中，所述接触导致以下中的一项或多项：(i)体外或体内诱导细胞衰老；(ii)体外或体内细胞周期停滞；(iii)体外或体内细胞生长抑制；(iv)体外或体内诱导无能(anergy)；(v)体外或体内诱导细胞凋亡；以及(vi)体外或体内诱导坏死。

77、本公开的另一方面提供在有需要的受试者中治疗病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：本公开的crispr-cas13f系统、本公开的载体、本公开的递送系统、或本公开的细胞或后代；其中，在施用后，所述工程化cas13f多肽切割所述靶rna，从而治疗所述受试者的病症或疾病。

78、在一些实施方式中，所述病症或疾病是神经病症、癌症、感染性疾病或遗传障碍。

79、在一些实施方式中，所述癌症是威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或膀胱癌。

80、在一些实施方式中，所述神经病症是青光眼，与年龄相关的rgc丧失，视神经损伤，视网膜缺血，莱伯遗传性视神经病变，与rgc神经元退化相关的神经病症，与有需要的受试者的纹状体中功能性神经元退化相关的神经病症，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，精神分裂症，抑郁症，药物成瘾，运动障碍如舞蹈病、舞蹈徐动症和动作障碍，双相障碍，自闭症谱系障碍(asd)或功能失调。

81、在一些实施方式中，所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。

82、本公开的另一方面提供crispr-cas13f复合物，所述crispr-cas13f复合物包含本公开的工程化cas13f多肽以及包含dr序列和间隔序列的指导rna，所述dr序列与所述工程化cas13f多肽结合，所述间隔序列能够与靶rna杂交并且将所述复合物引导或募集至所述靶rna。

83、在一些实施方式中，所述靶rna由真核dna编码。

84、在一些实施方式中，所述真核dna是非人哺乳动物dna、非人灵长类动物dna、人dna、植物dna、昆虫dna、鸟dna、爬行动物dna、啮齿动物dna、鱼dna、蠕虫/线虫dna、或酵母dna。

85、在一些实施方式中，所述靶rna是mrna。

86、在一些实施方式中，所述crispr-cas13f复合物进一步包含靶rna，所述靶rna包含能够与所述间隔序列杂交的序列。

87、应理解，本文描述的本公开的任何一个实施方式，包括仅在实施例或权利要求中、或仅在下文的一个方面/部分中描述的那些实施方式，可以与本公开的任何其他一个或多个实施方式组合，除非明确否认或认为不当。

88、通过考虑所展示的示例性实施方式的以下详细描述，对于本领域普通技术人员而言，示例性实施方式的这些和其它方面、目的、特征和优点将变得清楚。