使用微生物代谢途径生产2,4-二羟基丁酸或l-苏氨酸的方法1.本发明涉及使用微生物代谢途径生产2,4-二羟基丁酸(dhb)(其可以以2,4-二羟基丁酸盐的形式存在，或者以酸2,4-二羟基丁酸的形式存在)或l-苏氨酸的方法。2.通过实现生物基燃料和化学品的生物可持续生产，减少对化石原材料的依赖具有重要的生物经济和生态利益。在这种情况下，由于(l)-2,4-二羟基丁酸(dhb)作为合成用于动物营养的甲硫氨酸类似物的起始材料的重要性，该行业在生物合成(l)-2,4-二羟基丁酸(dhb)方面的努力也大大增加。3.氨基酸甲硫氨酸和甲硫氨酸类似物(d/l)-2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(hmtb)主要用作养鸡的饲料添加剂，在市场上的年营业额为约30亿欧元。甲硫氨酸目前仅由化石原材料石油和天然气进行生产。氨基酸苏氨酸被用作猪育肥的饲料添加剂。甲硫氨酸制造商对将其化学甲硫氨酸生产工艺转化为可持续的微生物生产工艺有着浓厚的兴趣，因为随着化学工艺co2排放价格的上涨，预计这些工艺的成本将大幅增加。4.氨基酸l-苏氨酸目前通过微生物生产工艺从糖类的葡萄糖或蔗糖在工业规模上进行制备。可以等效使用的氨基酸d/l-甲硫氨酸和类似物d/l-2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(hmtb)目前仅由石油和天然气在工业规模上进行生产。5.从石油和天然气化学合成甲硫氨酸是不可持续的，并且必须替换为使用可再生原材料的工艺。从糖类进行微生物合成苏氨酸和甲硫氨酸明显更具可持续性。然而，这些工艺与食品生产有着竞争关系。6.本发明所基于的目的在于提供如下方法，该方法为制备氨基酸甲硫氨酸和苏氨酸的可持续方法开辟了道路。7.本发明的目的通过具有权利要求1的特征的方法实现。在从属权利要求中陈述了进一步的发展。8.解决方法是使用微生物代谢途径生产2,4-二羟基丁酸或l-苏氨酸的方法，该方法至少包括以下步骤：9.使用苏糖醛缩酶将乙醇醛经酶促转化为苏糖的步骤，10.使用苏糖脱氢酶将苏糖经酶促转化为苏糖酸-1,4-内酯的步骤，11.使用苏糖酸-1,4-内酯酶将苏糖酸-1,4-内酯经酶促转化为苏糖酸的步骤，以及12.使用苏糖酸脱水酶将苏糖酸经酶促转化为2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)的步骤，13.其中代谢途径还包括使用ohb还原酶将ohb经酶促转化为2,4-二羟基丁酸的步骤或使用l-高丝氨酸转氨酶将ohb经酶促转化为l-高丝氨酸的步骤，然后是在atp消耗下使用高丝氨酸激酶将l-高丝氨酸经酶促转化为o-磷酸-l-高丝氨酸的步骤，以及使用l-苏氨酸合酶将o-磷酸-高丝氨酸经酶促转化为l-苏氨酸的步骤，其中代谢途径在微生物生产菌株中表达，该微生物生产菌株通过以适当的方式将所述酶表达所需的至少一个基因引入生产菌株中而事先相对于其天然形式(野生型)被修饰。根据本发明的概念，代谢途径通过乙醇醛进行，乙醇醛可以通过不同的方式获得。因此，乙醇醛可以通过合成代谢途径由木糖提供，如cam等人/2016/acssynthbiol/5/607-618中所述。此外，乙醇醛也可以由乙二醇表示。这又可以容易地从合成气中回收，这与从co2排放中回收合成气一样是现有技术。此外，乙二醇也可以通过糖的化学氢解获得，如zheng等人/2017/acscatal/7/1939-1954中所述。将糖氢解为乙二醇是用于化学消化植物废物的创新方法，其可能比传统的基于酸或酶的消化方法更有效。最后但并非最不重要的是，乙二醇是塑料聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的主要成分，因此根据本发明的方法也为塑料废物的回收利用开辟了道路。14.根据本发明的概念，开发了如下代谢途径，其能够将乙醇醛(其又容易从乙二醇获得)保碳转化为l-苏氨酸或hmtb。15.另一个实质性优点是，在基于乙二醇的生产中仅形成很少的副产物。这是可以预期的，因为用于生产的代谢途径与自然代谢更好地分离。由于基于乙二醇的工艺中存在很少的副产物，因此可以按相对简单的方式纯化所得的有价值物质苏氨酸和dhb。16.在本发明中，可以实现自然界中不以这种形式存在的代谢途径。这种代谢途径部分基于迄今为止尚不清楚的酶活性。令人惊讶的是，这两种未知的酶活性可以通过筛选发现。此外，新发现的酶活性以及来自各种其他微生物的已知活性可以在单个生产菌株中一起表达。因此，构建了先前未知的反应顺序或先前未知的代谢途径。根据本发明的有利实施例，生产菌株已经具有其天然形式的代谢途径所需的一种或多种酶。有利地，大肠杆菌(escherichiacoli)种菌株可用作生产菌株，优选大肠杆菌δyqhdδalda。这种菌株有利地适合作为生产菌株，因为它具有醛脱氢酶(alda)和乙醇醛还原酶(yqhd)的失活，这些酶与乙醇醛转化为d-苏糖竞争。此外，恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)种的菌株也是合适的，特别是因为该种的菌株具有非常合适的乙二醇脱氢酶。17.在本发明的一个实施例中，使用d-苏糖醛缩酶将乙醇醛转化为d-苏糖。因此，然后使用d-苏糖脱氢酶将d-苏糖经酶促转化为d-苏糖酸-1,4-内酯。接下来是使用d-苏糖酸-1,4-内酯酶将d-苏糖酸-1,4-内酯经酶促转化为d-苏糖酸的步骤。在该实施例的下一步骤中，使用d-苏糖酸脱水酶将d-苏糖酸经酶促转化为2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)。18.在根据本发明的方法的一个特别优选的实施例中，将表达来自石竹副伯克霍尔德菌(paraburkholderiacaryophylli)(pc.tadh)和/或来自油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)(xc.fdh)的酶d-苏醛糖-1-脱氢酶的遗传信息引入生产菌株的基因组中，用于在生产菌株中表达d-苏糖脱氢酶。类似地，为了在生产菌株中提供d-苏糖脱氢酶，可以将表达来自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(sc.ara1)或来自燕麦食酸菌(acidovoraxavenae)(aa.tadh)的酶d-阿拉伯糖脱氢酶的遗传信息或表达来自多食伯克霍尔德菌(burkholderiamultivorans)(bm.fdh)的酶l-岩藻糖脱氢酶的遗传信息引入生产菌株的基因组中。因此，d-苏糖脱氢酶可以由氨基酸序列seqidno.113、seqidno.117、seqidno.123、seqidno.125和seqidno.131中的一个表示。19.d-苏糖酸脱水酶在生产菌株中的表达可以有利地实现，因为将表达来自燕麦食酸菌(aa.arad)和/或赫氏草螺菌(herbaspirillumhuttiense)(hh.arad)和/或含羞草副伯克霍尔德菌(paraburkholderiamimosarum)(pm.arad)和/或来自优化突变体hh.aradc434s的酶d-阿拉伯糖酸脱水酶的遗传信息引入生产菌株的基因组中。因此，以下氨基酸序列可以表示d-苏糖酸脱水酶：seqidno.151、seqidno.153、seqidno.155和seqidno.159。20.为了在生产菌株中表达d-苏糖醛缩酶，优选将表达来自大肠杆菌(ec.fsaa)的酶d-果糖-6-磷酸醛缩酶的遗传信息和/或突变变体ec.fsaal107y:a129g(ec.fsaata)的遗传信息引入生产菌株的基因组中。因此，d-苏糖醛缩酶可以由氨基酸序列seqidno.109或seqidno.111中的一个表示。21.为了在生产菌株中表达苏糖酸-1,4-内酯酶，可以将表达来自thermoguttaterrifontis(tt.lac11)的酶葡糖酸内酯酶的遗传信息和/或特别优选地，该酶的截短变体(tt.lac11v1)的遗传信息(其导致表达的显著改善)引入生产菌株的基因组中。因此，苏糖酸-1,4-内酯酶可以由氨基酸序列seqidno.133和seqidno.135中的一个表示。22.根据本发明方法的一个特别有利的设计，除了各自代谢途径的酶之外，苏糖酸导入酶在生产菌株中表达。例如，这可以通过将表达来自钩虫贪铜菌(cupriavidusnecator)(re.kdgt)的d-苏糖酸导入渗透酶的遗传信息引入生产菌株的基因组来实现。因此，苏糖酸导入酶可以例如由氨基酸序列seqidno.165表示。23.根据本发明，ohb还原酶用于将ohb转化为dhb。在本发明的一个实施例变体中，从c.j.r.；topham,c.m.；malbert,y.；j.m.；walther,t.rationalengineeringofamalatedehydrogenaseformicrobialproductionof2,4-dihydroxybutyricacidviahomoserinepathway[通过高丝氨酸途径微生物生产2,4-二羟基丁酸的苹果酸脱氢酶的合理工程化].biochem.j.[生物化学杂志]2018,475(23),3887–3901已知的nadh依赖性ohb还原酶ec.mdh5q用作ohb还原酶。ohb还原酶可以由氨基酸序列seqidno.163表示。[0024]令人惊讶的是，在ohb还原为dhb的过程中，可以通过使用辅助因子nadph而不是nadh来改善ohb还原为dhb。通过将突变引入nadh依赖性ec.mdh5q酶中，可以改变其辅助因子特异性以有利于nadph。值得注意的是，到目前为止还不存在nadph依赖性ohb还原酶。[0025]在本发明的有利实施例中，ec.mdh5q酶的nadph依赖性变体在dhb生物合成中在生产菌株中表达，该变体在位置d34或i35的至少一个中具有突变。也就是说，为了在生产菌株中表达偏好nadph的ohb还原酶，将表达来自大肠杆菌的酶l-苹果酸脱氢酶(ec.mdh)的突变变体的遗传信息引入生产菌株的基因组中，其中除了相对于野生型酶ec.mdh突变的变体ec.mdh5q(ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d)的五个点突变之外，其中在位置12处的异亮氨酸被缬氨酸取代(i12v)，在位置81处的精氨酸被丙氨酸取代(r81a)，在位置85处的甲硫氨酸被谷氨酰胺取代(m85q)，在位置86处的天冬氨酸被丝氨酸取代(d86s)以及在位置179处的甘氨酸被天冬氨酸取代(g179d)，该突变酶在位置d34和i35的至少一个中具有另一个突变。这样，d34表示对应于野生型酶中被天冬氨酸占据的位置34的位置，并且i35表示对应于野生型酶中被异亮氨酸占据的位置的位置。优选地，为了在生产菌株中表达偏好nadph的ohb还原酶，将表达以下酶中一种的遗传信息引入生产菌株的基因组中：[0026]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g(ec.mdh5qd34g)，其中位置34的天冬氨酸被甘氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.173表示，[0027]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:i35s(ec.mdh5qi35s)，其中位置35的异亮氨酸被丝氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.175表示，[0028]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35k(ec.mdh5qd34gi35k)，其中位置34的天冬氨酸被甘氨酸取代，位置35的异亮氨酸被赖氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.177表示，[0029]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35r(ec.mdh5qd34gi35r＝ec.mdh7q)，其中位置34的天冬氨酸被甘氨酸取代，位置35的异亮氨酸被精氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.179表示，[0030]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35s(ec.mdh5qd34gi35s)，其中位置34的天冬氨酸被甘氨酸取代，位置35的异亮氨酸被丝氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.181表示，以及[0031]ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35t(ec.mdh5qd34gi35t)，其中位置34的天冬氨酸被甘氨酸取代，位置35的异亮氨酸被苏氨酸取代，由氨基酸序列seqidno.183表示。[0032]在本发明的一个特别有利的实施例中，酶ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35r(ec.mdh7q)被表达为nadph依赖性ohb还原酶。[0033]具有2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)还原酶活性的ec.mdh5q酶的相应nadph依赖性变体也代表了具有上述实施例的本发明中的一个独立目的，该变体催化2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)转化为2,4-二羟基丁酸(dhb)并代表来自大肠杆菌的l-苹果酸脱氢酶(ec.mdh)的突变体，并且与野生型酶相比，除了五个点突变i12v、r81a、m85q、d86s和g179d之外，在位置d34和i35的至少一个中具有另一个突变。这同样适用于使用这种酶将ohb转化为2,4-dhb，其中该酶的用途也包括在使用除上述以外的产生dhb的代谢途径的方法中，但像这些一样，还包括使用ohb还原酶将2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)经酶促转化为2,4-二羟基丁酸(dhb)，例如，根据wo2014/009435a1的方法。通常，相应修饰的微生物将催化所选dhb产生代谢途径的步骤所需的基因表达为制备2,4-二羟基丁酸(dhb)的生产菌株。由于这些代谢途径中的每一个都包括使用ohb还原酶将2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)经酶促转化为2,4-二羟基丁酸(dhb)，因此可以将表达上述酶中每一种的遗传信息引入微生物的基因组中以表达ohb还原酶。[0034]替代地，从乙醇醛开始，也可以将乙醇醛转化为l-苏糖而不是d-苏糖。为此，可以使用选自已知酶类d-苏氨酸醛缩酶(酶类4.1.2.42)、l-别苏氨酸醛缩酶(4.1.2.49)、l-苏氨酸醛缩酶(4.1.2.5)、4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(4.1.3.16)和2-脱氢-3-脱氧-d-戊酸醛缩酶(4.1.2.28)的醛缩酶活性。直至2-酮基-4-羟基丁酸的上述代谢途径的所有进一步阶段都可以与l-形式类似。所以，kim,sukmin,hyunseunglim,和sunboklee.“discoveryofarubisco-likeproteinthatfunctionsasanoxygenaseinthenoveld-hamamelosepathway[发现在新型d-金缕梅糖途径中作为加氧酶的rubisco样蛋白].”biotechnologyandbioprocessengineering[生物技术和生物工艺工程]23.5(2018):490-499已经可以证明l-苏糖脱氢酶活性与来自人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)(oa.hamh)的金缕梅糖脱氢酶。例如，在westlake,a.“thermostableenzymesimportantforindustrialbiotechnology[对工业生物技术重要的耐热酶].”(2019)中描述了对l-苏糖酸-1,4-内酯具有活性的内酯酶。在那里，来自thermoguttaterrifontis(tt.ara11)的葡糖酸内酯酶显示出相应的活性。对l-苏糖酸具有活性的脱水酶是已知的，例如来自硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)的二羟基酸脱水酶，如出版物kim,s.；lee,s.b.catalyticpromiscuityindihydroxy-aciddehydratasefromthethermoacidophilicarchaeonsulfolobussolfataricus[来自嗜热嗜酸古菌硫化叶菌的二羟基酸脱水酶的催化混杂性].j.biochem[生物化学杂志].2006,139(3),591–596中所述。[0035]根据本发明的进一步设计，上述方法包括至少一个进一步的先前步骤，用于例如从乙二醇、甲醇或木糖微生物生产乙醇醛。这样，乙醇醛可以通过代谢途径从乙二醇衍生，对于乙二醇的转化，该代谢途径使用吡咯喹啉醌(pqq)依赖性乙二醇脱氢酶(膜结合)的酶活性，由mückschel,b.；simon,o.；klebensberger,j.；graf,n.；rosche,b.；altenbuchner,j.；pfannstiel,j.；huber,a.；hauer,b.ethyleneglycolmetabolismbypseudomonasputida[恶臭假单胞菌的乙二醇代谢].appl.environ.microbiol[应用与环境微生物学].2012,78(24),8531–8539报道，或nad(p)依赖性乙二醇脱氢酶(胞质)，已知来自lu,z.；cabiscol,e.；obradors,n.；tamarit,j.；ros,j.；aguilar,j.；lin,e.c.evolutionofanescherichiacoliproteinwithincreasedresistancetooxidativestress[具有增加的对氧化应激的抗性的大肠杆菌蛋白的进化].j.biol.chem[生物化学杂志].1998,273(14),8308–8316，和zhang,x.；zhang,b.；lin,j.；wei,d.oxidationofethyleneglycoltoglycolaldehydeusingahighlyselectivealcoholdehydrogenasefromgluconobacteroxydans[使用来自氧化葡糖杆菌的高选择性醇脱氢酶将乙二醇氧化为乙醇醛].j.mol.catalysisb[分子催化杂志b]2015,112,69–75。[0036]乙醇醛也可以通过代谢途径从甲醇衍生，该代谢途径依次使用甲醇脱氢酶的酶活性以将甲醇转化为甲醛，并使用乙醇醛合酶以将甲醛转化为乙醇醛，如出版物lu,x.；liu,y.；yang,y.；wang,s.；wang,q.；wang,x.；yan,z.；cheng,j.；liu,c.；yang,x.；等人constructingasyntheticpathwayforacetyl-coenzymeafromone-carbonthroughenzymedesign[通过酶设计从单碳构建乙酰辅酶a的合成途径].natcommun[自然通讯]2019,10(1),1378中所述。[0037]乙醇醛也可以通过多阶段代谢途径从木糖衍生，该多阶段代谢途径依次使用木糖异构酶的酶活性以将d-木糖转化为d-木酮糖，使用木酮糖-1-激酶以将d-木酮糖转化为d-木酮糖-1p，以及使用木酮糖-1p-醛缩酶以将木糖-1p-醛缩酶转化为乙醇醛，从cam等人/2016/acssynthbiol[acs合成生物学]/5/607-61中得知。[0038]使用甲醇的一个优点是，就像乙二醇一样，它可以容易地从合成气衍生。因此，从乙二醇通过dhb生物合成苏氨酸或hmtb可以被恰当地描述为一种特别可持续的生产方法。[0039]本发明实施例的进一步细节、特征和优点源于附图和以下示例性实施例的描述。其中[0040]图1：显示了用于将乙醇醛转化为dhb的五阶段代谢途径草案的示意图，[0041]图2：显示了筛选候选酶的nad(p)依赖性d-苏糖脱氢酶活性的结果的柱状图，[0042]图3：显示了筛选候选酶的d-苏糖酸脱水酶活性的结果的柱状图，[0043]图4：显示了表示表达各种乙二醇脱氢酶的大肠杆菌菌株的生长模式的图表，以及[0044]图5：显示了基于13c的代谢流分析结果的柱状图，显示了通过合成代谢途径从乙醇醛(ga)生物合成l-苏氨酸。[0045]在图1中，示意性地表示了使用微生物代谢途径从乙醇醛制备2,4-二羟基丁酸(dhb)或l-苏氨酸的各种方法，其中所有这些微生物代谢途径共有四个反应阶段，它们相继进行并由苏糖醛缩酶、苏糖脱氢酶、苏糖酸-1,4-内酯酶和苏糖酸脱水酶催化。[0046]代谢途径在微生物生产菌株中表达，优选大肠杆菌型，其通过将所述酶表达所需的至少一个基因引入生产菌株中而事先相对于其天然形式(野生型)被修饰。[0047]在生产l-2,4-二羟基丁酸的情况下，两个乙醇醛分子可以通过上述四个连续反应阶段转化为2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)，最后通过随后的第五反应阶段转化为l-2,4-二羟基丁酸(dhb)，而不损失碳。[0048]在生产l-苏氨酸的情况下，乙醇醛首先通过这四个连续反应阶段转化为2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)，然后是将2-酮基-4-羟基丁酸经酶促转化为l-高丝氨酸的步骤，将l-高丝氨酸经酶促转化为o-磷酸-l-高丝氨酸(o-p-l-高丝氨酸)的步骤和将o-磷酸-l-高丝氨酸经酶促转化为l-苏氨酸的步骤。[0049]两种代谢途径都与使用乙二醇、甲醇或d-木糖作为起始材料相容。产生乙醇醛的反应在图1中显示为虚线箭头。代谢途径的不同酶或酶活性在图1中用罗马数字表示。[0050]乙醇醛可以通过多阶段代谢途径从木糖衍生，该多阶段代谢途径连续使用木糖异构酶(i)的酶活性以将d-木糖转化为d-木酮糖，使用木酮糖-1-激酶(ii)以将d-木酮糖转化为d-木酮糖-1p以及使用木酮糖-1p-醛缩酶(iii)以将d-木酮糖-1p转化为乙醇醛。[0051]乙醇醛可以通过代谢途径从乙二醇衍生，该代谢途径使用pqq依赖性乙二醇脱氢酶(膜结合)(iv)或nad(p)依赖性乙二醇脱氢酶(胞质)(v)的酶活性来转化乙二醇。[0052]乙醇醛可以通过代谢途径从甲醇衍生，该代谢途径连续使用甲醇脱氢酶(vi)的酶活性以将甲醇转化为甲醛，以及使用乙醇醛合酶(vii)以将甲醛转化为乙醇醛。[0053]通过设计具有五个连续反应阶段的代谢途径，可以在大肠杆菌中从乙醇醛生产代谢产物dhb，这五个连续反应阶段由d-苏糖醛缩酶(viii)、d-苏糖脱氢酶(ix)、d-苏糖酸-1,4-内酯酶(x)、d-苏糖酸脱水酶(xi)和ohb还原酶(xv)的酶活性催化。在第一阶段，两个乙醇醛(ga)分子结合形成分子d-苏糖。然后，所得的四碳糖被d-苏糖脱氢酶(ix)氧化为d-苏糖酸-1,4-内酯，其在d-苏糖酸-1,4-内酯酶(x)催化的反应中被转化为相应的糖酸或d-苏糖酸。在最后两个酶促步骤中，d-苏糖酸通过d-苏糖酸脱水酶(xi)脱水为ohb，其最终在ohb还原酶(xv)催化的反应中还原为dhb。[0054]在l-苏氨酸的生产中，乙醇醛首先通过上述连续的四个反应阶段转化为2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)，然后是使用l-高丝氨酸转氨酶(xii)将2-酮基-4-羟基丁酸经酶促转化为l-高丝氨酸的步骤，然后是通过atp消耗并使用l-高丝氨酸激酶(xiii)将l-高丝氨酸经酶促转化为o-磷酸-l-高丝氨酸的步骤，以及使用l-苏氨酸合酶(xiv)将o-磷酸高丝氨酸经酶促转化为l-苏氨酸的步骤。[0055]所提到的大多数酶活性都是已知的，可以将必要的基因(如果尚未包含在生产菌株中)以适当的方式引入生产菌株中，但其他基因必须通过筛选来鉴定。[0056]d-苏糖醛缩酶和ohb还原酶活性已经在文献中描述过。特别地，根据出版物szekrenyi,a.；soler,a.；garrabou,x.；guérard-hélaine,c.；parella,t.；joglar,j.；lemaire,m.；bujons,j.；clapés,p.engineeringthedonorselectivityofd-fructose-6-phosphatealdolaseforbiocatalyticasymmetriccross-aldoladditionsofglycolaldehyde[工程化d-果糖-6-磷酸醛缩酶的供体选择性以用于乙醇醛的生物催化不对称交叉羟醛加成].chemistry[化学]2014,20(39),12572-12583，在来自大肠杆菌的d-果糖-6-磷酸醛缩酶(ec.fsaa)的情况下，已经显示了乙醇醛可逆酶促同羟醛加成到d-苏糖的体外催化。此外，已知突变变体ec.fsaal107y:a129g(ec.fsaata)具有与野生型相比增加三个数量级的用于生产d-苏糖的活性。因此，这种突变酶可以有利地用于上述代谢途径。此外，通过在大肠杆菌的l-苹果酸脱氢酶中引入5点突变(ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d)而获得的突变苹果酸脱氢酶ec.mdh5q在出版物c.j.r.；topham,c.m.；malbert,y.；j.m.；walther,t.rationalengineeringofamalatedehydrogenaseformicrobialproductionof2,4-dihydroxybutyricacidviahomoserinepathway[通过高丝氨酸途径微生物生产2,4-二羟基丁酸的苹果酸脱氢酶的合理工程化].biochem.j[生物化学杂志].2018,475(23),3887–3901中描述为具有高度活性。因此，可以选择该酶作为ohb还原酶，以催化dhb合成途径的最后一个转化步骤。[0057]通过文献中的参考，还可以确定如下酶，除其他外，该酶还具有d-苏糖酸-1,4-内酯酶活性。westlake,a.thermostableenzymesimportantforindustrialbiotechnology[对工业生物技术重要的耐热酶].日期:2019年6月10日报道，来自thermoguttaterrifontis的葡糖酸内酯酶，此处缩写为tt.lac11，对大量内酯具有活性。这些酶也被描述为对d-苏糖酸-1,4-内酯具有活性，尽管仅报道了低反应速率。发明人最近分析了动力学特性，并对天然底物l-岩藻糖酸-1,4-内酯和d-苏糖酸-1,4-内酯都测定了令人惊讶的可比催化活性。由于该酶对d-苏糖酸-1,4-内酯具有高亲和力(km＝2.92mm)，因此适用于根据本发明使用的代谢途径。[0058]已知几种酶催化乙二醇nad依赖性氧化为乙醇醛。这些包括来自大肠杆菌的1,2-丙二醇脱氢酶(ec.fuco)，参见boronat,a.；caballero,e.；aguilar,j.experimentalevolutionofametabolicpathwayforethyleneglycolutilizationbyescherichiacoli[大肠杆菌利用乙二醇代谢途径的实验进化].j.bacteriol[细菌学杂志].1983,153(1),134–139，和来自氧化葡糖杆菌的醇脱氢酶gox0313(go.adh)，参见zhang,x.；zhang,b.；lin,j.；wei,d.oxidationofethyleneglycoltoglycolaldehydeusingahighlyselectivealcoholdehydrogenasefromgluconobacteroxydans[使用来自氧化葡糖杆菌的高选择性醇脱氢酶将乙二醇氧化为乙醇醛].j.mol.catalysisb[分子催化杂志b]2015,112,69–75。此外，已知通过ec.fuco在位置ile6leu和leu7val的突变，可以实现所得酶(ec.fucoi6l:l7v)的更高耐氧性，参见lu,z.；cabiscol,e.；obradors,n.；tamarit,j.；ros,j.；aguilar,j.；lin,e.c.evolutionofanescherichiacoliproteinwithincreasedresistancetooxidativestress[具有增加的对氧化应激的抗性的大肠杆菌蛋白的进化].j.biol.chem[生物化学杂志].1998,273(14),8308–8316。所得酶也被称为ec.fucoor，其中or是耐氧性的缩写。[0059]作为具有l-高丝氨酸转氨酶活性的酶，用于将2-酮基-4-羟基丁酸经酶促转化为l-高丝氨酸的步骤(xii)，已知来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(ec.aspc)和突变变体ec.alaca142p:y275d的谷氨酸-丙酮酸转氨酶，参见bouzon,m.；perret,a.；loreau,o.；delmas,v.；perchat,n.；weissenbach,j.；taran,f.；marlière,p.asyntheticalternativetocanonicalone-carbonmetabolism[典型单碳代谢的合成替代方案].acssynthbiol[acs合成生物学]2017,6(8),1520–1533。用于将l-高丝氨酸转化为o-磷酸-l-高丝氨酸的步骤(xiii)的具有l-高丝氨酸激酶活性的酶也是已知的，特别是来自大肠杆菌的高丝氨酸激酶(ecthrb)。来自大肠杆菌的苏氨酸合酶(ec.thrc)具有l-苏氨酸合酶活性，用于将o-磷酸-l-高丝氨酸经酶促转化为l-苏氨酸的步骤(xiv)。[0060]示意性地表示上述代谢途径的酶活性并在图1中表示，具有d-苏糖脱氢酶活性(ix)和d-苏糖酸脱水酶活性(xi)的那些尚未被描述。然而，通过筛选候选酶的选择，可以鉴定出这些活性。[0061]关于所使用的材料和方法，应注意以下：[0062]所有化学品和溶剂均购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，除非说明其他公司。限制性核酸内切酶和dna修饰酶是从新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs(neb))公司获得的，并按照制造商的说明书使用。dna质粒分离通过neb公司的质粒小型制备试剂盒进行。从琼脂糖凝胶中提取dna和聚合酶链式反应(pcr)(一种体外扩增遗传物质(dna)的方法)产物的纯化通过来自neb公司的dna凝胶提取试剂盒进行。dna测序由eurofinssas公司(德国埃伯斯贝格(ebersberg))公司进行。[0063]表1中列出了构建并用于研究的所有质粒和宿主菌株。表2和表12中列出了引物。[0064]表1：使用的菌株和质粒[0065][0066][0067][0068][0069][0070]表2：所用引物的序列[0071][0072][0073][0074][0075][0076]在表2中，引物序列中的限制性位点加下划线，编码起始/终止序列以粗体表示，rbs序列以斜体表示。通过分别使用引物对224/223、222/223和315/226对ec.fuco野生型、ec.fucoi6l:l7v和密码子优化的go.adh基因进行pcr扩增来构建质粒pext20-ec.fuco、pext20-ec.fucoi6l:l7v和pext20-go.adh。来自大肠杆菌mg1655的基因组dna和合成基因作为衍生自ec.fuco和go.gox0313的基因的模板dna。所有引物都引入了位于各自基因两侧的某些限制性位点。此外，引物紧邻编码序列之前引入了核糖体结合序列(rbs)。[0077]大肠杆菌k-12底物mg1655δyqhdδalda被用作构建苏氨酸生产菌株的起始菌株。内源性thrbc和rhtb基因的表达通过用合成组成型和分离启动子proddavis,j.h.；rubin,a.j.；sauer,r.t.:design,constructionandcharacterizationofasetofinsulatedbacterialpromoters[一组绝缘细菌启动子的设计、构建和表征].于:nucleicacidres[核酸研究].,2011,3,第1131-1141页取代每个操纵子或基因的天然染色体5'-utr而制成组合型的。prod序列之前是氯霉素抗性盒(frt-cat-frt-pprod)，其元件首先用表2中列出的引物从质粒ptopo-prod和pkd扩增。pcr产物用dpni消化，使用与基因组靶基因座侧翼区具有约50bp同源性的引物通过融合pcr进行纯化和组装。将所得dna片段转化到各自的靶菌株中，其表达来自pkd46质粒的λ-红色重组酶，以取代这些菌株中的天然基因启动子。在富含抗生素的lb琼脂平板上选择氯霉素抗性克隆，并通过pcr分析(引物参见表2)证实它们含有相应的插入片段大小。通过dna测序检查整合的启动子序列的正确测序。通过表达来自pcp20质粒cherepanovp.p.；wackernagel,w.:genedisruptioninescherichiacoli:tcrandkmrcassetteswiththeoptionofflp-catalysedexcisionoftheantibiotic-resistancedeterminant[大肠杆菌中的基因破坏：tcr和kmr盒，选择flp催化切除抗生素抗性决定簇].于:gene[基因],1995,158(1),第9-14页的flp重组酶从基因组中去除cat盒，并使用基因座特异性引物通过pcr检查盒的正确切除(表2)。在标准方案的帮助下，将质粒转化到靶大肠杆菌菌株中。[0078]使用引物对209/284扩增高拷贝质粒pext20。用xhol/xbal限制酶消化pcr产物，并使用t4dna连接酶(neb公司)连接到载体骨架中。[0079]通过使用引物对326/327扩增ec.fsaa野生型和ec.fsaal107y:a129g基因来构建质粒pext20-ec.fsaa和pext20-ec.fsaata。大肠杆菌mg1655的基因组dna和合成基因作为模板dna。所得pcr产物和pext20表达载体用bamhi/xbai消化并连接。通过分别使用引物对326/328和303/304对ec-fsaal107y:a129g和密码子优化的合成pc.tadh基因进行pcr扩增来构建质粒ec.fsaata-pc.tadh。所得pcr产物分别用bamhi/swai和swai/xbai限制酶消化，并连接到用bamhi/xbai消化的pext20载体中。[0080]类似的程序用于pact3-ec.fsaata-pc.tadh的构建，但其中中拷贝质粒pact3用作骨架。通过使用引物对438/439扩增密码子优化的合成tt.lac11基因构建质粒pact3-ec.fsaata-pc.tadh-tt.lac11。然后用xbai/sali限制酶消化pcr产物和pact3-ec.fsaata-pc.tadh载体并连接。tt.thte1497op基因的较短版本也用pcr扩增，其中n末端周质输出的信号序列(1:115-1,068nt；2:154-1.068nt)缺失。[0081]为了构建质粒pact3-ec.fsaata-aa.tadh-tt.lac11v1、pact3-ec.fsaata-xc.fdh-tt.lac11v1和pact3-ec.fsaata-ppi.tadh-tt.lac11v1，在引物对667/668、671/672或716/717的帮助下对基因aa.tadh、xc.fdh和ppi.tadh进行pcr扩增。菌株燕麦食酸菌dsm7227、油菜黄单胞菌dsm3586的基因组dna和ppi.tadh的合成基因作为模板。将所得pcr产物和载体pact3-ec.fsaata-pc.tadh-tt.lac11v1用swai/xbai消化，然后进行连接。[0082]为了构建质粒pact3-go.adh-ec.fsaata-pc.tadh-tt.lac11v1，在引物对313/314、326/328、303/304和600/439的帮助下扩增基因go.adh、ec.fsaata、pc.tadh和tt.lac11v1。将所得pcr产物用kpni/bamhi、bamhi/swai、swai/xbai或xbai/sali消化，并连接到在kpni/sali中消化的pact3载体中。[0083]质粒pext22-ec.mdh5q通过使用引物对305/258对obh还原酶编码基因ec.mdh5q(合成基因)进行pcr扩增来构建。然后用saci/bamhi消化所得pcr产物和低拷贝载体pext22并连接。[0084]质粒pext22-ec.mdh7q通过使用引物对305/258对编码ohb还原酶的基因ec.mdh7q进行pcr扩增而构建，该基因由如下所述的ec.mdh5q的突变产生。质粒pet28-ec.mdh7q作为模板dna。然后用saci/bamhi消化所得pcr产物和低拷贝载体pext22并连接。[0085]质粒pext22-ec.mdh5q-aa.arad、pext22-ec.mdh5q-hh.arad和pext22-ec.mdh7q-hh.arad分别通过使用引物对551/552和553/554扩增aa.arad和hh.arad基因而构建。燕麦食酸菌dsm7227和赫氏草螺菌dsm10281的基因组dna作为各自的模板dna。将所得pcr产物用bamhi/xbai消化，并单独连接到用bamhi/xbai消化的载体pext22-ec.mdh5q或pext22-ec.mdh7q中的相应位点。质粒pext21-re.kdgt通过使用引物对454/455扩增来自钩虫贪铜菌h16dsm428的基因组dna的re.kdgt基因而构建。将pcr产物和pext21载体骨架用bamhi/hindiii限制酶消化并连接。[0086]为了构建质粒pext22-ec.aspc-hh.arad，首先用引物对805/806或553/554对基因ec.aspc和hh.arad进行pcr扩增。使用的引物列于表1中。大肠杆菌mg1655和赫氏草螺菌dsm10281的基因组dna作为相应的模板。将所得pcr产物用saci/bamhi或bamhi/xbai消化，并单独连接到用saci/xbai消化的载体pext22中的相应位点。[0087]质粒pext22-ec.mdh5q-hh.aradc434s通过使用引物对718/719在模板pext22-ec.mdh5q-hh.arad(在位置434产生从半胱氨酸到丝氨酸的突变)上进行反向pcr来构建。为了构建质粒pext22-ec.mdh5q-ca.arad和pext22-ec.mdh5q-pm.arad，分别使用引物对724/725和732/733对基因ca.arad和pm.arad进行pcr扩增。丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)dsm1731和含羞草副伯克霍尔德菌dsm21841的基因组dna作为模板。将所得pcr产物和质粒pext22-ec.mdh5q-hh.arad用bamhi/xbai消化，纯化并连接。[0088]将所有所得构建体转移到化学感受态大肠杆菌细胞(dh5α，neb)中，并通过dna测序验证靶基因的正确掺入。然后使用标准方法将质粒转化到选择为生产菌株的相应大肠杆菌菌株中，如从sambrook,j.；fritsch,e.f.；maniatis,t.molecularcloning:alaboratorymanual.[分子克隆：实验室手册]mol.cloningalab.manual[分子克隆实验室手册].1989,第2版中已知。[0089]下面描述了酶促试验：[0090]在酶促试验(测定)之前，通过bradfort(-quant,roth)方法测定蛋白质浓度。除非另有说明，否则所有酶促试验均在37℃下在96孔微量滴定板中进行20分钟，总体积为250μl。最大反应速率(vmax)和米氏常数(km)的值通过使至少五个不同底物浓度的动力学数据适应米氏方程来确定。适应通过r2015a中的非线性回归进行。[0091]乙二醇脱氢酶活性的测定：[0092]通过在乙二醇氧化期间在340nm(ε＝6.22mm-1cm-1)下测量nad+的还原，在氧化方向上测定酶活性。用于活性测定的反应混合物含有100mm甘氨酸钠(ph9.5)、0.5mmnad+和相应量的纯化酶或粗蛋白提取物。通过加入相应浓度的底物开始反应。乙二醇脱氢酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmolnad+转化的酶量。[0093]d-苏糖醛缩酶活性的测定：[0094]通过将乙醇醛的同羟醛加成与d-苏糖的nad依赖性氧化偶联来测定酶活性，由来自石竹副伯克霍尔德菌(pc.tadh)的纯化d-苏醛糖-1-脱氢酶催化。用于活性测定的反应混合物含有60mm2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸(hepes)ph8，10mmnad+，100μgml-1辅助酶和适量的纯化酶或粗蛋白提取物。通过加入相应浓度的底物开始反应。d-苏糖醛缩酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmold-苏糖转化的酶量。[0095]糖脱氢酶活性的测定：[0096]通过在候选糖氧化期间在340nm下测量nad(p)+的还原，在氧化方向上测定酶活性。用于活性测定的反应混合物含有50mmhepes(ph8)、10mmnad(p)+和适量的纯化酶或粗蛋白提取物。通过添加各种浓度的(d)-阿拉伯糖或(d)-苏糖(英国卡博森斯公司(carbosynth))开始反应。糖脱氢酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmol糖转化的酶量。[0097]内酯酶活性的测定：[0098]酶活性通过使用比色ph指示剂溴百里酚蓝(ε＝1.14mm-1cm-1)在616nm下测量内酯水解期间从羧酸产物释放的质子的浓度来进行。用于活性测定的反应混合物含有2.5mmhepes(ph7.1)、200mmnacl、1％(v/v)dmso、0.1mm溴百里酚蓝和适量的纯化酶。通过加入不同量的(l)-岩藻糖酸-1,4-内酯或(d)-苏糖酸-1,4-内酯开始反应。内酯酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmol内酯水解的酶量。[0099]糖酸脱水酶活性的测定：[0100]通过将2-酮酸反应产物转化为在250nm下测量浓度的缩氨基脲来测定酶活性。使用丙酮酸作为2-酮酸(ε＝2.24mm-1cm-1)获得校准曲线。用于活性测定的反应混合物含有60mmhepes(ph7.3)、50mmkcl、10mmmgcl2和适量的纯化酶或粗蛋白提取物。通过加入各种糖酸(l-岩藻酸、2r-二羟基戊酸、d-阿卓糖酸、d-酒石酸、d-阿拉伯糖酸或d-苏糖酸)开始1ml反应，并在37℃下孵育。在0、10、20和40分钟后在反应过程中除去200μl等分试样，并与100μl2mhcl混合。然后向样品补充300μl氨基脲溶液(10g*l-1氨基脲盐酸盐和15g*l-1乙酸钠)，并在30℃下孵育10分钟。最后，向衍生化产物中加入500μl蒸馏水，其中立即使用石英比色皿测量吸收。糖酸脱水酶活性(u)的单位u定义为每分钟催化1.0μmol2-酮酸形成的酶量。[0101]d-苏糖酸脱水酶活性的测定：[0102]酶活性通过将d-苏糖酸的脱水与纯化的ohb还原酶ec.mdh5q对2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)的nadh依赖性还原偶联来测定，其从出版物c.j.r.；topham,c.m.；malbert,y.；j.m.；walther,t.rationalengineeringofamalatedehydrogenaseformicrobialproductionof2,4-dihydroxybutyricacidviahomoserinepathway[通过高丝氨酸途径微生物生产2,4-二羟基丁酸的苹果酸脱氢酶的合理工程化].biochem.j[生物化学杂志].2018,475(23),3887–3901中已知。反应混合物含有60mmhepes(ph7.3)、50mmkcl、10mmmgcl2、0.25mmnadh、100μgml-1辅助酶和适量的纯化酶。通过加入不同量的底物开始反应。d-苏糖酸脱水酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmolohb形成的酶量。[0103]表3中列出了测试d-苏糖脱氢酶或d-苏糖酸脱水酶活性的候选酶。[0104]ohb还原酶活性的测定：[0105]通过在ohb还原为dhb期间在340nm下测量nad(p)h的氧化，在还原方向上测定酶活性。用于活性测定的反应混合物含有60mmhepes(ph7)、5mmmgcl2、50mmkcl、0.25mmnadh或nadph、2mmohb和适量的纯化酶。通过加入ohb开始反应。ohb还原酶活性的单位u定义为每分钟催化1.0μmolnad(p)h转化的酶量。为了确定辅助因子和ohb的km值，适当改变一种底物的初始浓度，而另一种底物的初始浓度保持不变。[0106]表3：测试d-苏糖脱氢酶或d-苏糖酸脱水酶活性的候选酶[0107][0108][0109][0110]表3还说明是否进行密码子优化。[0111]下面描述了候选酶的克隆、表达和纯化：[0112]使用表4中列出的克隆技术和引物对，通过pcr扩增相应的编码基因并将其克隆到表达载体pet28a(novagen公司)的相应位点中，其中n末端六his标签连接到靶序列上。将所得质粒转化到感受态大肠杆菌dh5α细胞(neb)中。在将由此获得的质粒转化到表达菌株大肠杆菌bl21(de3)(neb)之前，通过分离质粒和dna测序来验证正确的插入。根据其适用性，蛋白质在50mllb培养基或自动诱导培养基中表达(studierf.w./2005/protexprpurif/41/207-234/proteinproductionbyauto-inductioninhighdensityshakingcultures[在高密度振荡培养物中通过自动诱导产生蛋白质]))。在足够的孵育时间后，通过离心将细胞从培养基中分离，离心在1700×g和4℃下进行15分钟。将由此获得的细胞沉淀储存在-20℃下直到进一步处理。通过将细胞沉淀溶于1mlhepes缓冲液(50mm，ph7)中并随后以四个间隔(每个间隔20秒)进行超声处理(uds751，topasgmbh，输出40％)来纯化酶。通过在13000×g和4℃下离心15分钟来分离细胞碎片，然后将澄清的上清液转移到新的反应容器中。根据钴树脂(talon)的制造商说明书，通过亲和层析从由此获得的粗蛋白质提取物中纯化靶蛋白质。然后就纯化的酶对天然底物(阳性对照)和靶底物的活性对其进行表征。蛋白质纯化从冷冻细胞球开始进行。[0113]表4：用于将靶基因克隆到pet28表达载体中的引物序列、技术和限制性位点[0114][0115][0116][0117]苏糖以及辅助因子nad+或nadp+测量。缩写“n.d.”的意思是“未检测到”。[0122]表5：候选酶对d-阿拉伯糖和d-苏糖的脱氢酶活性[0123][0124]在总共七种候选酶中，sc.ara1、pc.tadh和bm.fdh与辅助因子nad+或nadp+中的一种一起对d-苏糖显示出可测量的活性，这也从图2和表5中显而易见。由于pc.tadh具有0.27u*mg-1的最高比活性，因此使用该酶进行进一步的动力学分析。测定底物d-苏糖的km值为26.63mm。由于pc.tadh对d-苏糖具有最高的活性，并且在大肠杆菌中具有明确的表达，因此该酶优选用于构建合成的代谢途径。[0125]如所示，在体外测试的帮助下，可以鉴定具有d-苏糖酸脱水酶活性的酶，其结果如下所述。虽然如前所述，对l-苏糖酸具有活性的脱水酶是充分已知的，但到目前为止，在相应的d-立体异构体上还没有报道这种酶活性。因此，类似于用于证明d-苏糖脱氢酶活性的策略，选择对具有(2s,3r)构型的糖酸具有已知活性的候选酶。候选酶的选择包括来自油菜黄单胞菌(xc.fucd)和恶臭假单胞菌(pp.fucd)的l-岩藻酸脱水酶、来自燕麦食酸菌(aa.arad)和赫氏草螺菌(hh.arad)的d-阿拉伯糖酸脱水酶、来自大豆慢生根瘤菌(bj.tard)的d-酒石酸脱水酶和来自大肠杆菌(ec.uxaa)的d-阿卓糖酸脱水酶。此外，来自大肠杆菌(ec.ilvd)和硫化叶菌(ss.ilvd)的d-羟基酸脱水酶也被纳入研究。通过表3和表4中所述的引物和技术将相应的基因克隆到pet28a载体中。在根据上述方法表达和纯化酶后，如上所述测试它们对d-苏糖酸和其他糖酸的活性。[0126]图3显示了筛选上述候选酶的d-苏糖酸脱水酶活性的结果的柱状图。使用上述识别2-酮酸的氨基脲测试，在d-苏糖酸和相应的天然底物上测试所有纯化的候选酶。将底物浓度调节至10mm，但aa.arad和hh.arad除外，其中使用1mm天然底物。在没有活性的情况下，酶标有星号(*)。酶活性在柱状图中以对数标度表示。活性的确切值如表6所示。表6显示了测试的n-his标签酶的比活性。结果表示为至少两个生物复制的平均值(+/-标准偏差)。缩写“n.d.”的意思是“未检测到”。[0127]表6：各种脱水酶对d-苏糖酸及其天然底物的活性[0128][0129][0130]在测试的酶中，hh.arad和aa.arad对d-苏糖酸显示出显著的活性，其中它们分别具有0.30umg-1和0.18umg-1的比活性，如表6和图3所示。[0131]以下描述了在大肠杆菌中具有改进表达的来自t.terrifontis的苏糖酸-1,4-内酯酶tt.lac11的变体的构建。来自t.terrifontis的内酯酶tt.lac11只能在大肠杆菌中非常地困难表达，这导致用于动力学表征的纯化酶的产量低，并且可以预期该酶在生产菌株中的低活性。对内酯酶氨基酸序列的分析确定了n末端信号序列，该信号序列可能影响酶输出到周质中。为了提高tt.lac11的胞质表达，制备了该蛋白的n末端截短变体，并测试了其在大肠杆菌中的表达能力。可以表明，使用截短了38个氨基酸的酶的变体(δ1-38)，可以实现表达增加34倍，如表7所示。该变体在下文中称为tt.lac11v1，而截短了51个氨基酸的变体称为tt.lac11v2，截短了76个氨基酸的变体称为tt.lac11v3。表7显示了多his标签的tt.lac11-内酯酶的截短变体对用pet28在大肠杆菌bl21(de3)中表达的产量和活性。结果对应于两个独立生物重复的平均值和标准偏差。[0132]表7：多his标签的tt.lac11-内酯酶的截短变体对用pet28在大肠杆菌bl21(de3)中表达的产量和活性[0133][0134][0135]通过在生产菌株中同时表达整个代谢途径，证明了dhb从乙醇醛的生物合成。为此，在所有实验中使用起始菌株大肠杆菌tw64(mg1655δyqhdδalda)，并用质粒转化，确保合成代谢途径的全部或部分表达。将细胞在250ml摇瓶中在补充有10％(v/v)lb培养基的矿物盐培养基上，在37℃和220rpm下在培养箱(infors)中培养。在培养物达到约0.6的od600值后加入iptg(0.5mm)。当培养物的od600值为约2.0时，将乙醇醛(20mm)添加到培养物中。孵育时间为48小时。结果表示为至少两个生物重复的平均值(+/-标准偏差)。dhb和代谢中间体以及乙醇醛的浓度在配备uv-vis检测器(hp1047a，hewlett-packard，美国)的hplc系统(k-2600，knaur)上测定。注射体积为20μl，在配备securityguard柱(phenomenex，美国)的rezexroa-有机酸h+柱上分离物质，使用0.5mmh2so4作为流动相，流速为0.5ml/min。d-葡萄糖、d-苏糖、乙醇醛、d-苏糖酸和乙酸盐在35℃下测定，dhb和乙二醇在80℃下测定。由于d-苏糖酸内酯和d-苏糖酸不能用这种方法溶解，因此这些代谢物的浓度作为“d-苏糖酸/内酯”的合并值给出。[0136]乙醇醛(ga)生物转化为dhb的实验结果如表8所示。[0137]表8：20mm乙醇醛生物转化为dhb的结果[0138][0139][0140]在菌株tw293中，表达了所有酶活性，这些酶活性根据所提出的代谢途径是将乙醇醛转化为dhb所必需的。令人惊讶的是，在培养48小时后可以检测到中间阶段d-苏糖和d-苏糖酸/内酯，但没有dhb(表8)。[0141]由于内酯酶tt-lac11具有可能影响该酶转运到周质中的信号序列，因此怀疑内酯向苏糖酸的环裂解发生在周质中，因此需要重新导入所得的d-苏糖酸。为了验证这一假设，除了代谢途径的所有酶外，来自钩虫贪铜菌的d-苏糖酸导入渗透酶(re.kdgt)也在菌株tw304中表达。事实上，该菌株可以从乙醇醛产生0.08mm的dhb。这提供了根据图1所提出的代谢途径的功能证明。[0142]为了消除代谢中间体输出或输入需求，产生了三种截短形式的ttlac11，从中去除了不同长度的n末端序列部分(表7)。内酯酶变体tt.lac11v1(δ1-38aa)在大肠杆菌中的表达提高了34倍，d-苏糖酸-1,4-内酯的比活性提高了10倍。因此选择该构建体是为了在该示例性实施例中在合成途径中提供所需的细胞质内酯酶活性。表达改进的内酯酶的菌株(tw354)能够积累0.16mmdhb。[0143]在乙醇醛向dhb的全细胞生物转化的帮助下鉴定具有d-苏糖脱氢酶活性的酶[0144]在前面的示例性实施例中，表明在所提出的代谢途径的帮助下，在全细胞生物转化中将乙醇醛转化为dhb是可能的。因此，用于所述代谢途径中的单个反应步骤的替代候选酶的表达并同时测量所得dhb浓度可以用于鉴定具有所需活性的额外的或更合适的酶。根据该策略，首先构建不表达d-苏糖脱氢酶的菌株，但以其他方式包含整个代谢途径，包括苏糖酸渗透酶。此外，还构建了tw354、tw444、tw445和tw446菌株，这些菌株还表达了用于d-苏糖脱氢酶活性的各种候选酶。如上述示例性实施例培养菌株，并在孵育48小时后测量dhb和其他中间体的浓度。[0145]如预期的那样，没有d-苏糖脱氢酶的大肠杆菌tw559菌株不能将乙醇醛合成的d-苏糖转化为dhb或代谢产物d-苏糖酸/内酯，如表9所示的结果所示。如果另外表达候选酶pc.tadh、xc.fdh或aa.tadh，则可以检测到dhb的产生，这表明这些酶具有d-苏糖脱氢酶活性。相比之下，表达ppi.tadh时不能测量到dhb，这表明该酶没有d-苏糖脱氢酶活性，或不能在大肠杆菌中充分表达。[0146]表9：10mm乙醇醛生物转化为dhb的结果，取决于用于d-苏糖脱氢酶活性的各种候选酶[0147][0148](*)括号中显示的值对应于24小时后这些物质的浓度[0149]在乙醇醛向dhb的全细胞生物转化的帮助下鉴定具有d-苏糖酸脱水酶活性的酶[0150]类似于前面的实例，通过定量生产菌株中hh.arad被其他候选酶交换后乙醇醛上的dhb形成，可以鉴定d-苏糖酸脱水酶。鉴定改进的d-苏糖酸脱水酶的另一个标准是d-苏糖酸降解速率。根据该策略，在生产菌株tw452、tw453和tw454中分别表达突变体hh.aradc434s、ca.arad和酶pm.arad而不是先前使用的hh.arad，并研究它们对苏糖酸降解速率和dhb形成速率的影响。从表10中所示的结果可以看出，酶pm.arad不提供任何d-苏糖酸脱水酶活性或不能在大肠杆菌中充分表达，因为使用该酶时在生产菌株中不能检测到dhb产生。相比之下，突变体hh.aradc434s和pm.arad允许产生dhb，这证明了它们的d-苏糖酸脱水酶活性。此外，结果表明突变体hh.aradc434s更快地降解d-苏糖酸，从而导致dhb的产生增加。[0151]表10：20mm乙醇醛生物转化为dhb的结果，取决于用于d-苏糖酸脱水酶活性的各种候选酶[0152][0153]合适的nad依赖性乙二醇脱氢酶的鉴定[0154]为了在所述代谢途径的帮助下实现乙二醇(eg)转化为dhb或苏氨酸，必须通过允许乙二醇氧化为乙醇醛的反应来扩展代谢途径。如前所述，已知有几种酶催化乙二醇向乙醇醛的nad依赖性氧化。为了测试哪种酶最适合补充所述代谢途径，采用了生长依赖性测试系统，其中测试菌株的生长速率取决于乙二醇脱氢酶的体内活性。众所周知，大肠杆菌不能天然表达乙二醇脱氢酶，因此不能生长乙二醇作为底物上的唯一碳源。然而，乙二醇脱氢酶的表达允许乙二醇转化为乙醇醛，从而在该底物上生长。因此，在大肠杆菌菌株大肠杆菌δyqhd和大肠杆菌δyqhdδalda中借助pext20载体表达三种候选酶go.adh、ec.fuco和ec.fucoi6l:l7v。基于双突变体大肠杆菌δyqhdδalda的构建体作为对照，因为这些菌株由于乙醇醛脱氢酶alda的缺失而不能在乙二醇上生长。将测试菌株在与上述实验具有相同组成的矿物盐培养基上孵育。在这种培养基中，只有葡萄糖作为唯一的碳源被100mm乙二醇替代。将测试菌株在微量滴定板(每孔250μl培养基)中以880rpm的振荡频率和37℃的温度在微量滴定板读数仪(tecan)中孵育。生长速率通过定期测量od600来确定。如图4所示，乙二醇脱氢酶go.adh使生长最快，其次是ec.fucoi6l:l7v和ec.fuco。因此，go.adh随后被用作乙二醇脱氢酶，用于在所述代谢途径的帮助下将乙二醇转化为dhb。[0155]从乙二醇开始合成dhb的证明[0156]通过在生产菌株中同时表达包括乙二醇脱氢酶的整个代谢途径来证明从乙二醇生物合成dhb。为此，所有实验均使用起始菌株大肠杆菌tw64(mg1655δyqhdδalda)，并用质粒转化，确保包括乙二醇脱氢酶go.adh的合成代谢途径的表达。以这种方式构建的生产菌株tw363的培养以及底物和产物浓度的测量如上述从乙醇醛合成dhb的示例性实施例所述进行。与上述实例相反，没有向培养物中添加乙醇醛，但在od达到0.6后，以各种初始浓度向培养物添加乙二醇。这些实验的结果如表11所示。[0157]表11：tw363菌株将乙二醇(eg)生物转化为dhb的结果[0158][0159]对nadph比nadh具有更高特异性的ohb还原酶的构建[0160]为了构建偏爱辅助因子nadph的ohb还原酶，在已经描述的nadh依赖性ohb还原酶ec.mdh5q中分别或同时在位置d34和i35进行氨基酸交换。模板质粒pet28-ec.mdh5q的构建及其使用的方法在c.j.r.；topham,c.m.；malbert,y.；j.m.；walther,t.rationalengineeringofamalatedehydrogenaseformicrobialproductionof2,4-dihydroxybutyricacidviahomoserinepathway[通过高丝氨酸途径微生物生产2,4-二羟基丁酸的苹果酸脱氢酶的合理工程化].biochem.j[生物化学杂志].2018,475(23),3887–3901中描述。使用表12中列出的引物，使用相同的方法通过反向pcr引入额外的突变。pcr产物用dpni消化以去除模板质粒并转化到大肠杆菌dh5α细胞中。分离所得质粒，并通过测序验证dna序列的正确性。[0161]表12：用于将突变引入模板酶ec.mdh5q的所用引物[0162][0163][0164]如上所述，将由此获得的酶变体在大肠杆菌中表达、纯化并表征其动力学参数。如表13所示，可以表明突变d35g单独或与位置i35的突变组合使ohb还原酶的辅助因子特异性向nadph方向移动。对nadph具有最高活性和特异性的酶变体(ec.mdh5qd35g:i35r)在下文中称为ec-mdh7q。详细测定了该酶的动力学参数，并列于表14中。[0165]表13：ohb还原酶突变体的辅助因子特异性[0166][0167]在恒定初始浓度的底物ohb(2mm)和nad(p)h(0.25mm)下测定比活性。酶ec.mdh5q是已经描述的nadh依赖性ohb还原酶ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d。[0168]已表明，ec.mdh7q对nadph的特异性比起始酶ec.mdh5q高8600倍。[0169]表14：ec.mdh5q和ec.mdh7q(ec.mdhi12v:r81a:m85q:d86s:g179d:d34g:i35r)的ohb还原酶变体的动力学参数分析[0170][0171](a)在恒定ohb浓度(2mm)和不同nad(p)h浓度(2-0.002mm)下测定ohb还原酶活性。[0172](b)在恒定nad(p)h浓度(0.25mm)和不同ohb浓度(10-0.05mm)下测定ohb还原酶活性。[0173]动力学参数km和vmax通过在matlab的帮助下将测量的初始反应速率适应michaelis-menten模型来确定。[0174]通过使用nadph依赖性ohb还原酶增加dhb产生[0175]在下文中，研究了使用nadph依赖性ohb还原酶提高dhb产量的适用性。为此，仅在nadh或nadph依赖性ohb还原酶的表达上不同的菌株tw354和tw469在相同的条件下培养(起始底物10mm乙醇醛，实验和分析条件的进一步细节见上文)，并在48小时后比较dhb积累。可以表明，使用nadph依赖性ohb还原酶显著提高dhb产生，如表15所示。[0176]表15：表达nadh或nadph依赖性ohb还原酶的大肠杆菌菌株将10mm乙醇醛生物转化为dhb的结果[0177][0178]n.d.-未检测到[0179]从乙醇醛(ga)开始合成l-苏氨酸的证明[0180]通过同时表达包括将ohb转化为苏氨酸的酶的整个代谢途径来实现由乙醇醛生物合成l-苏氨酸。为此，所有实验均使用起始菌株大肠杆菌tw64(mg1655δyqhdδalda)，并用质粒转化，确保包括高丝氨酸转氨酶ec.aspc的合成代谢途径的表达。由此产生的菌株被命名为tw612。为了进一步提高苏氨酸产生，在该菌株中过表达苏氨酸输出渗透酶rhtb、高丝氨酸激酶ec.thrb和苏氨酸合酶ec.thrc。这通过用强组成型启动子proddavis,j.h.；rubin,a.j.；sauer,r.t.:design,constructionandcharacterizationofasetofinsulatedbacterialpromoters[一组绝缘细菌启动子的设计、构建和表征].于:nucleicacidres[核酸研究].,2011,3,第1131-1141页替换染色体中相应基因的天然启动子来实现。由此获得的菌株被命名为tw613。[0181]苏氨酸可以通过合成代谢途径和天然代谢途径在生产菌株中合成。为了明确证明苏氨酸通过本发明的合成代谢途径合成，一方面，使用仅表达合成代谢途径的不完整且因此无功能变体的菌株tw619进行对照实验。特别是，该菌株不含苏糖酸脱水酶表达的遗传信息。此外，在实验中，使用完全13c标记的乙醇醛(omicronbiochemicals)作为底物，并将培养基中标记和未标记的苏氨酸的比例彼此比较。通过检测完全标记的苏氨酸，可以证明相应的碳衍生自乙醇醛。[0182]茎培养在37℃下在旋转振荡器(inforsht，德国)上以220rpm进行。将预培养物在50mlfalcon管中的5mllb中孵育。约10小时后，使用500μl这些培养物接种第二预培养物(在50mlfalcon管中的10ml90％v/vm9矿物培养基和10％v/vlb)，培养过夜。将生产起始od600为0.2的主要培养物所需的生物量转移到90％(v/v)矿物m9培养基和10％(v/v)lb的培养基中。将抗生素以标准浓度添加到所有培养基中(氯霉素，35μgml-1；卡那霉素，50μgml-1；大观霉素，100μgml-1)。当od600达到约0.6时，加入iptg(0.5mm)。在od600达到2后，加入完全13c标记的乙醇醛。定期采集用于分析细胞外代谢物的样品。将1ml培养物样品离心(以13,000g离心5分钟)，并将上清液储存在-20℃直到进一步使用。测量前用0.2μmptfe膜注射器过滤器过滤样品。[0183]lc/ms分析：将无细胞上清液在10mm乙酸铵溶液(ph9.2)中稀释100倍，该溶液溶解在60％(v/v)乙腈和40％(v/v)水中。lc-ms平台包括xcalibur2.1软件控制的vanquish和thermoscientifictmqexactivetmfocus(均来自加利福尼亚州圣何塞赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))。液相色谱分离使用scientific))。液相色谱分离使用philic(5μm聚合物150×2.1mm)柱进行，流速为0.15mlmin-1。使用a(5％acn，10mm乙酸铵，通过nh4oh为ph9.2)和b(90％acn，10mm乙酸铵，通过nh4oh为ph9.2)的梯度，以获得最佳分离效率。梯度为0min，95％b；2min，95％b；3min，89.4％b；5min，89.4％b；6min，83.8％b；7min，83.8％b；8min，78.2％b；9min，78.2％b；10min，55.9％b；12min，55.9％b；13min，27.9％b；16min，27.9％b；18min，0％b；23min，0％b；24min，95％b；30min，95％b。取样器的温度保持在6℃，注射体积为5μl，烘箱温度保持在25℃。电喷雾电离的设备设置优化为0.15mlmin-1的流速。进一步的参数设置如下：地幔气的流速32(设备专用单位)，辅助气体的流速8(设备专用单位)，吹扫气体的流速0(吹扫专用单位)，喷雾电压-3.5kv，毛细管温度250℃和辅助气体温度200℃。[0184]这些实验的结果如图5所示，其中包括基于13c的代谢物质流分析结果的柱状图，其显示了通过合成代谢途径从乙醇醛(ga)生物合成l-苏氨酸。在培养基中仅发现未标记的苏氨酸(m+0)或完全标记的苏氨酸(m+4)。[0185]对照菌株tw619仅产生少量苏氨酸。此外，在该菌株的培养基中没有检测到标记的苏氨酸，因此表明该菌株中的苏氨酸仅由葡萄糖制备。相反，在表达整个合成代谢途径的菌株tw612和tw613的培养基中发现了完全标记的苏氨酸。通过这些实验，可以毫无疑问地证明合成代谢途径适合生产苏氨酸。[0186]表16分别列出了编码某些酶的基因的dna序列的seqid号和相应酶的氨基酸序列的seqid号。[0187]表16：酶序列[0188][0189][0190]表17列出了不同质粒的dna序列的seqid号。[0191]表17：质粒的dna序列[0192][0193]表18分别列出了编码不同ohb还原酶突变体的基因的dna序列的seqid号和相应ohb还原酶突变体的氨基酸序列的seqid号。[0194]表18：ohb还原酶突变体的序列[0195][0196]质粒pext22-ec.mdh7q-hh.arad的dna序列被分配为seqidno.184。[0197]序列表-独立文本[0198]seqidno.独立文本[0199]1–48:质粒构建的引物序列[0200]49–89:用于将靶基因克隆到pet28表达载体中的引物序列[0201]90–101:用于将突变引入ec.mdh5q酶的引物序列[0202]104：ec.fuco突变体的序列[0203]105：ec.fuco突变体[0204]106：go.adh的密码子优化序列[0205]110：ec.fsaa突变体的序列[0206]111：ec.fsaa突变体[0207]116：pc.tadh的密码子优化序列[0208]118：pl.lgda的密码子优化序列[0209]120：ps.fdh的密码子优化序列[0210]126：ppi.tadh的密码子优化序列[0211]128：ss.adh4的密码子优化序列[0212]132：tt.lac11的密码子优化序列[0213]134,136,138：tt.lac11截短变体的密码子优化序列[0214]135：截短了38个氨基酸的tt.lac11变体[0215]137：截短了51个氨基酸的tt.lac11变体[0216]139：截短了76个氨基酸的tt.lac11变体[0217]142：ss.ilvd的密码子优化序列[0218]144：xc.fucd的密码子优化序列[0219]154：hh.arad突变体的序列[0220]155：位置434处半胱氨酸突变为丝氨酸的hh.arad突变体162,172,174,176,178,[0221]180,182：ec.mdh突变体的序列[0222]163：具有突变i12vr81am85qd86sg179d的ec.mdh突变体168,169,170,171,184：质粒序列[0223]173：具有突变i12vr81am85qd86sg179dd34g的ec.mdh突变体[0224]175：具有突变i12vr81am85qd86sg179di35s的ec.mdh突变体[0225]177：具有突变i12vr81am85qd86sg179dd34gi35k的ec.mdh突变体[0226]179：具有突变i12vr81am85qd86sg179dd34gi35r的ec.mdh突变体[0227]181：具有突变i12vr81am85qd86sg179dd34gi35s的ec.mdh突变体[0228]183：具有突变i12vr81am85qd86sg179dd34gi35t的ec.mdh突变体[0229]使用的参考数字和缩写列表[0230]i木糖异构酶[0231]ii木酮糖-1-激酶[0232]iii木酮糖-1p-醛缩酶[0233]iv乙二醇脱氢酶(膜结合)[0234]v乙二醇脱氢酶(胞质)[0235]vi甲醇脱氢酶[0236]vii乙醇醛合酶[0237]viiid-苏糖醛缩酶[0238]ixd-苏糖脱氢酶[0239]xd-苏糖酸-1,4-内酯酶[0240]xid-苏糖酸脱水酶[0241]xiil-高丝氨酸转氨酶[0242]xiiil-高丝氨酸激酶[0243]xivl-苏氨酸合酶[0244]xv2-酮基-4-羟基丁酸(ohb)还原酶[0245]atcc美国模式培养物保藏所[0246]dh脱氢酶[0247]dhb2,4-二羟基丁酸(2,4-dihydroxybutyrate，2,4-dihydroxybutyricacid)eg乙二醇[0248]hepes2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸[0249]hmtbd/l-2-羟基-4-(甲硫基)丁酸[0250]iptg异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷[0251]lb溶原肉汤(lb)培养基，用于培养细菌的复合营养培养基nad烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[0252]nadh质子化或还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[0253]nadp烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[0254]nadph质子化或还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[0255]od光密度[0256]od600600nm波长下的光密度[0257]ohb2-酮基-4-羟基丁酸盐或酸2-酮基-4-羟基丁酸形式的2-酮基-4-羟基丁酸pcr聚合酶链式反应[0258]hifi高保真聚合酶[0259]rbs核糖体结合序列[0260]re限制酶[0261]uniprot.所有生物体和病毒蛋白质的生物信息学数据库(英语：universalproteindatabase)当前第1页12当前第1页12