细胞生态位工程化平台、由其产生的多路复用生物芯片及其使用方法

发明领域本发明一般涉及用于细胞生态位研究和工程化的生物芯片系统和细胞生态位生物芯片，及其制备和使用方法。

背景技术：

0、发明背景

1、细胞生态位是调节天然组织中常驻细胞命运和功能的局部微环境。生态位因子代表细胞生态位的组成成分，包括但不限于局部微环境的机械性能、细胞外基质(ecm)、可溶性因子、细胞间相互作用分子和拓扑特征。这些细胞生态位因子特定于组织和细胞类型，并共同作用来决定包括但不限于细胞的表型维持、粘附、迁移、增殖、分化和凋亡的命运。

2、几十年来，在研究、制药和生物技术行业中，细胞通常以2d单层形式在塑料或玻璃制成的平坦且刚性的培养皿上培养，因为它们易于处理且成本相对较低。然而，已经认识到，这种人工环境在许多方面与组织中的天然微环境显著不同，包括但不限于机械顺应性、拓扑特征、ecm组分、可溶性因子和细胞-细胞相互作用分子。因此，体外培养细胞的命运和行为在许多方面与天然组织中的细胞显著不同，包括但不限于形态、粘附、表型维持、分化、增殖、细胞骨架组织、迁移、存活以及对药物和有毒物质的响应。以表型维持为例。在平坦和刚性的培养板上培养为2d单层时称为去分化的现象证明人工或非生理培养环境对维持表型进而对细胞命运的负面影响。具体而言，许多细胞类型包括但不限于软骨细胞、肝细胞、髓核细胞(npc)和肿瘤细胞在平坦和刚性的培养板上以2d单层培养时，失去了它们的生理表型(其统称为形态学)、基因和蛋白质水平中表型标志物的表达、细胞活性(如迁移特性、增殖能力和分化状态)和细胞功能(如某些可溶性因子的分泌和某些ecm组分的沉积)。结果，这些培养的细胞在用于下游研究和应用(包括但不限于基础科学研究、药物筛选、毒性测试、组织工程和再生医学)之前不能维持其生理表型，换句话说，是去分化的，从而破坏下游结果。

3、使用表型丢失的去分化细胞可能导致不相关的结果和研究资源的浪费。用于表型维持的不同方法包括使用不同的3d模型重建天然细胞生态位，如npc示例中的细胞沉淀、藻酸盐珠、胶原微球、聚乳酸(pla)等。然而，最佳的天然细胞生态位通常是复杂的，具有多因素生态位信号，并且单一材料或3d维度无法充分再现用于表型维持的细胞生态位因子的最佳组合。因此，在定义和重建用于表型维持的最佳组合细胞生态位之前，对筛选多重细胞生态位因子(单独或组合)在培养物中维持npc表型的能力进行系统研究至关重要，但这远未阐明。因此，需要用于多重细胞生态位因子的高通量筛选平台，如用于多重细胞生态位因子筛选的生物芯片和用于最佳表型维持的生物芯片。

4、为了制造或生产这些生物芯片，微加工和微图案化技术是必要的。大多数常规技术要么用于微加工，如静电纺丝和复制品重塑，要么用于微图案化，如吸附涂层和微接触印刷。微加工技术通常与微图案化技术结合使用，以实现表面功能化微结构的微加工。然而，这些技术存在内在限制。例如，复制成型和静电纺丝等微加工技术难以制造任意的微结构，如具有独特拓扑、机械和化学特征的微结构，甚至难以以足够的分辨率制造悬垂结构。吸附涂层和微接触印刷(印章转移)等微图案化技术几乎无法在足够的分辨率和精度下使具有空间和定量异质性的3d微小微结构的表面功能化。基于3d打印的技术(如微喷墨打印)可以在同一平台上同时提供微加工和微图案化功能。然而，微喷墨打印的典型分辨率为数十到数百微米，这对于细胞生态位工程来说是不够的。此外，微喷墨打印很难制造出具有足够复杂性和任意性的微结构，因为它在预制层内部或下方添加结构或涂层的能力存在内在的物理限制。

5、包括微接触印刷和静电纺丝在内的常规微加工平台已被用于重建细胞生态位，仅列出几个实例，us20150057184a1和wo2013037836a1中提出的二维微阵列以及us20160355780a1、kr20160005122a和kr101720378b1中通过静电纺丝或封装的纤维网。一些研究还报告了拓扑线索筛选，如bssa(wo2006114097a2)、topochip(us20110009282a1)和marc。然而，这些技术不能重建异质细胞微环境，如微图案化在同一微加工系统中的机械和生化信号异质性。可实现的微结构主要是2d结构，而不是复杂的架构。因此，仍然需要单一稳健的细胞生态位工程化或编程技术，该技术能够微加工和微图案化具有独立、定量和空间可控的特征的微结构，同质或异质，单独或组合。

6、在工程化或编程细胞生态位时，使用生物相容性材料(如基于蛋白质的材料)在同一平台上以独立可控的方式通过掺入多种细胞生态位因子，包括但不限于机械顺应性、拓扑特征、ecm组分、可溶性因子和细胞间相互作用分子来构建生物芯片是必要的。对于蛋白质等可溶性生物活性因子，构建蛋白质芯片是复杂且具有挑战性的，因为蛋白质在化学处理和固定化时很容易变性。交联策略的一个主要问题是，通过物理、化学或光化学交联反应的共价键合可能导致蛋白质变性，以及蛋白质的随机定向固定化，限制了其出于细胞生态位工程目的在体外重建天然组织中存在的蛋白质-蛋白质相互作用中的应用。因此，需要改进的将可溶性蛋白质附着到微结构表面上的方法，同时保留蛋白质的生物活性。

7、细胞生态位工程化或编程的主要目标是以可预测的结果操纵和控制细胞命运。除了npc示例中的表型维持外，其他类型的细胞命运，特别是干细胞特有的细胞命运，如操纵胚胎干细胞(esc)中的不对称细胞分裂(acd)取向，也很难实现。甚至更具挑战性的是对细胞生态位进行精确工程化，以低至单个干细胞水平操纵细胞命运。鉴于局部生态位信号的复杂性及其在定义细胞命运特化中的重要性，以及干细胞的差异细胞命运是通过适当的分裂极性和acd取向介导的事实，了解个体局部生态位因子在影响细胞分裂极性和acd取向方面的属性对于开发通过以单细胞精度或分辨率通过工程化干细胞的局部生态位信号来操纵细胞命运的策略至关重要。然而，大多数现有研究通过体内模型操纵干细胞命运，其中多个生态位信号(包括几何、基质和相邻细胞)共存和串扰，使得难以描述个体细胞生态位因子的贡献及其相互作用。此外，这些模型通常被基因操纵以过度表达某些调节蛋白。因此，不可能在空间和定量上控制个体局部生态位因子以重现复杂且各向异性的细胞微环境，如用于细胞命运操纵的顶端-基底和前-后生态位。需要方法、设备和最终产品，其能够筛选细胞生态位因子，然后重建最佳的细胞生态位因子，这些因子可以以单细胞分辨率在体内相关，以便在体外操纵单个干细胞的命运。

8、提供系统化、高通量最佳细胞生态位工程化或编程平台。

9、公开了制造掺入模拟单个细胞或细胞组(一个或多个测试细胞)的体内环境或为单个细胞或细胞组(一个或多个测试细胞)提供人工微环境，从而产生细胞的最佳结果或命运的多重个体生态位因子或组合生态位的生物芯片的方法。

10、还提供了掺入生态位因子的生物芯片。

11、还提供了将可溶性因子掺入微生态位的方法。

12、还提供了具有可控且可工程的局部细胞生态位因子的单细胞3d微生态位平台。

13、还提供了使用掺入细胞生态位因子的生物芯片的方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、公开了使生物芯片掺入模拟细胞或细胞组(一个或多个测试细胞)体内环境的最佳生态位因子的方法，并且生物芯片掺入细胞特异性最佳生态位因子。细胞生态位因子包括但不限于拓扑因子、机械因子、细胞外基质因子、细胞-细胞粘附分子和可溶性蛋白质/生物活性因子。示例性拓扑因子包括但不限于因子如平坦基质(bsa/fm)、微柱阵列(mpa)、纤维珠微结构(fb)、厚光栅(tkg)、薄光栅(tng)、平行光栅层次(ghpl)、垂直光栅层次(ghpp)、凸面(cv)和凹面(cc)。

2、该方法是系统化且高通量的细胞生态位工程化平台，其导致将最佳因子掺入到生物芯片中，以提供多重蛋白质生物芯片，并使用多光子微图案化和微加工(mmm)作为优选的打印方法。使用两阶段筛选过程，确定操纵细胞命运所需的细胞生态位因子的最佳组合，在这种情况下，维持培养物中一个或多个测试细胞的表型。

3、第一阶段包括微加工掺入鉴定为在体内与一个/多个特定测试细胞类型相关的个体生态位因子(例如，通过选择与该一个/多个测试细胞相关的拓扑、机械和ecm(细胞外基质)因子)(即测试生态位因子)的蛋白质微结构并评估它们在体外维持一个/多个测试细胞的选定表型的能力，使用如细胞形态和表型标志物表达等特征作为个体细胞生态位因子的第一线筛选。通过在掺入个体生态位因子的基底上培养一个/多个测试细胞并确定终点(如对一个/多个测试细胞具有特异性的细胞形态学和表型标志物表达)来确定个体生态位因子维持一个/多个测试细胞选定特征的能力。

4、在第二阶段，使用从第一阶段筛选中入围的表型维持细胞生态位因子(例如1个机械因子，2个拓扑因子和2个ecm因子)，重构集成入围细胞生态位因子组合的蛋白质微结构，并用于使用如对一个/多个测试细胞具有特异性的细胞形态和表型标志物表达等终点验证一个/多个测试细胞的最佳表型维持。

5、本文还公开了能够在如玻璃基底的基底上加工具有可控特征的可溶性蛋白质/细胞-细胞粘附分子微结构和微图案的多光子微加工和微图案化(mmm)技术。mmm技术是新兴的微图案化技术，其是：(1)无需精密的玻璃表面和光掩模制备；(2)生物相容性，不涉及有毒试剂；(3)与常用的紫外光相比，双光子吸附具有优越的横向分辨率(≈200nm)；(4)兼容2d和3d模式。

6、本文还公开了无掩模、非接触和生物相容的多光子微加工和微图案化方法，涉及在基底表面上微加工中性蛋白，例如血清白蛋白，优选人血清白蛋白或牛血清白蛋白的微结构；在人或牛血清白蛋白微结构上对亲和力对(如亲和素(特别是中性亲和素))的一个成员的层进行微图案化；将可溶性蛋白质连接到亲和对的第二个成员，例如，当第一个成员是中和亲和素时，对可溶性细胞蛋白进行生物素化；并通过功能掺入到中和亲和素的微图案化层上来微图案化生物素化的可溶性细胞蛋白。可以理解的是，用于与其特定结合配偶体缀合/相互作用的其他接头材料可用于本发明。接头材料及其特异性结合配偶体可以是任何具有高亲和力、特异性和抗原-抗体类型的相互作用和结合的分子对。

7、本文还公开了相关的生物芯片，包括设计、组件、材料、用途、制备和相关分析工具。

8、公开了与最佳细胞生态位因子的组合相关的多路复用生物芯片，如那些模拟天然组织中细胞(单个细胞或细胞群)的体内微环境的多路复用生物芯片。

9、本文还公开了细胞生态位工程平台和生物芯片的应用。

10、由于使用了生物相容性材料，特别是天然存在的蛋白质，并且没有使用苛刻的试剂和条件，生成的细胞生态位是多路复用的并且可以直接使用。

11、本文公开的方法和生物芯片的应用包括将仿生细胞生态位重建为用于生理相关细胞培养和药物筛选的定制细胞培养基底；优化组织工程应用的仿生支架设计；微图案化异质可溶性生态位因子以促进信号传导活性；以及工程化不对称细胞生态位因子，以操纵不对称细胞分裂(acd)方向，从而操纵单个干细胞的子细胞的命运。

12、如本文所例举的，使用小鼠胚胎干细胞，加工了具有用选定的ecm、纤连蛋白(fn)和选定的细胞-细胞相互作用分子e-钙粘蛋白(e-cad)功能化的蛋白质微柱的3d微生态位，以证明将具有空间控制和保留生物活性的生物物理和生化信号掺入到单个细胞的直接微环境中的能力。