用于生产岩藻糖基乳糖的糖基转移酶缺陷型棒状杆菌的制作方法

背景技术：

技术实现思路

1、考虑到现有技术，本发明的技术问题是提供替代的和/或改进的方法以在转基因细菌中生产岩藻糖基乳糖。此外，期望提供使用谷氨酸棒状杆菌来生产生物分子的手段和方法，其减少细菌培养物的泡沫产生，从而促进这些细菌的培养用于工业应用，理想地具有增加的产量。

2、本发明的根本问题通过独立权利要求的特征来解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。

3、本发明涉及具有生产岩藻糖基乳糖所需的染色体整合转基因的遗传修饰的棒状杆菌的方面

4、因此，本发明涉及用于生产岩藻糖基乳糖的经遗传修饰的(或工程化的)棒状杆菌，其中所述棒状杆菌已被修饰以从外源核酸序列表达用于乳糖输入的通透酶、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合酶(wcag)和岩藻糖基转移酶(fuct)，其特征在于，编码用于乳糖输入的通透酶、gmd、wcag和fuct的外源核酸序列整合在染色体上。

5、与现有技术相比，本发明的遗传修饰的棒状杆菌的开发是非常有利的。本发明的细菌能够在不存在任何抗生素的情况下以工业规模高效生产岩藻糖基乳糖，例如用于随后的营养应用。此外，棒状杆菌、特别是优选的谷氨酸棒状杆菌对人类不具有致病性，并且已被认为是用于工业生产生物分子，例如特别是l-谷氨酸和l-赖氨酸的公认安全(gras)宿主。

6、通常需要调节微生物宿主中天然基因和异源基因的表达水平，以开发高性能的生产菌株。大多数代谢工程工作都使用多拷贝质粒，因为它们提供了一种快速构建不同基因表达水平原型的简单方法，但也有几个缺点。由于质粒的结构和分离不稳定，一些细胞可能会失去质粒。对于稳定群体中的质粒来说，质粒拷贝数不是恒定的。此外，细胞需要抗生素等选择压力来维持质粒，并且可能并不总是有效地维持质粒。质粒还通过转移核糖体和其他细胞资源来维持细胞的代谢，从而给细胞带来代谢负担。

7、重要的是，大多数已知的在gras宿主中生产岩藻糖基乳糖的方法都使用质粒携带的基因的表达来在宿主中表达该途径的异源酶。复制质粒主要用于重组基因的克隆和过度表达、给定蛋白质的最大过量生产或短期实验室规模的产品合成。然而，对于在细菌宿主中体内合成非天然产物(例如岩藻糖基乳糖)来说，必须表达多个基因，使用表达质粒有几个缺点。不同的质粒根据复制起点表现出不同的拷贝数，因此，多酶途径基因的差异表达导致通量失衡，从而导致产物产量低。此外，多拷贝质粒分离不稳定，不利于工业规模的制造过程。特别是在高细胞密度发酵和连续发酵条件下，由于细胞和培养物稀释分别导致抗生素降解，抗生素活性降低，因此会偶然损失选择压力。营养缺陷型菌株虽然可以在没有抗生素和选择压力的情况下维持携带必需基因的质粒，但由于补充产物从携带质粒的细胞中泄漏，也容易受到质粒损失的影响。因此，基因的表达在细胞群体中经常波动，从而导致群体变异。

8、此外，质粒复制的代谢负担和某些基因的强烈过表达可能导致生长速度降低以及额外途径对能量和代谢物的需求增加。质粒或转座子插入表达基因的结构不稳定或由于多个载体之间重组引起的基因丢失导致培养物被具有失活基因的质粒接管。

9、最重要的是，在以人类营养为目标的过程中，抗生素的使用要么是法律禁止的，要么是出于安全原因未指明或不利的，要么是出于成本原因而不希望使用抗生素。此外，在下游加工中去除抗生素的过程复杂且昂贵。

10、为了避免这些缺点，将重组基因稳定插入本发明的棒状杆菌的染色体中。染色体整合允许稳定维持基因表达盒，而无需在菌株中使用选择标记。

11、基因的染色体整合和表达是构建稳定和稳健的生产菌株并减少诱导表达系统泄漏的有效替代方案，这是大规模和长期生产过程非常理想的特性。尽管染色体整合具有巨大的潜力，并且有用于靶向整合的遗传工具的可用性，但从染色体实现高基因表达水平仍然比使用质粒操纵表达更具挑战性，即使是在大肠杆菌等经过充分研究的细菌物种中也是如此。此外，原核生物和真核生物的研究证据表明，染色体位置可以显着影响异源基因的表达水平。

12、基因盒的染色体位置和空间组织对于维持基因剂量和表达至关重要，但是对棒状杆菌中的这些位置效应缺乏了解，并且现有技术提供的关于如何减轻表达沉默的影响的数据不足(bryant，j.a.等人，“chromosome position effects on gene expression inescherichia coli k-12.”nucleic acids res.42，11383-11392(2014))。

13、lange等人2017年试图确定基因整合的染色体位点，但这些位点的位置效应仍然未知。一项类似的研究从质粒中的异源弱lac启动子表达l-阿拉伯糖基因，在三分之一的时间内(24小时vs.8小时)消耗了11倍的l-阿拉伯糖(15.5mm vs.175mm)(kawaguchi等人，2008)。因此，染色体位置的表征对于基因整合至关重要，不考虑可能显著降低基因表达的因素。

14、此外，虽然表达盒的染色体整合方法已在大肠杆菌中得到很好的建立，但已证明此类技术在其他细菌中、特别是在棒状杆菌和谷氨酸棒状杆菌中难以发挥作用。

15、多种因素调节染色体基因表达。可以操纵遗传构建体的功能组件来优化异源基因表达。这些组件包含启动子、核糖体结合位点、增强子和激活因子。然而，通常来自染色体的相同构建体的表达比来自质粒的弱。基因整合的位置是另一个强烈影响染色体基因表达以及基因剂量的因素。根据细胞的生长阶段，染色体的特定片段接受更高的基因剂量，这与这些区域中基因转录的增加相关。此外，dna压缩和接近活性基因也会影响基因表达。因此，基因整合位置的调节并非微不足道，随机整合实现所需表达水平的机会很低。现有技术中还没有可用的可靠方法来预测微生物生产系统中任何多基因生物合成途径所需的个体基因的最佳基因表达水平。

16、因此，不可能简单地或常规地预测给定的生物合成途径基因应该整合到染色体中的位置。此外，该途径中限速酶的表达对于生产至关重要。

17、然而，本文中，发明人用报告基因盒评估了棒状杆菌的基因组区域，并令人惊讶地发现了具有最小染色体效应的位置，并由此提供了将基因盒整合到棒状杆菌染色体区域中的方法，从而对岩藻糖基乳糖的生产产生意想不到的有益效果，如本文详细描述的。

18、如下面的实施例中所示，令人惊讶的是，可以有效构建遗传修饰的棒状杆菌，其包含岩藻糖基乳糖合成途径的所有所需和有利基因的多个表达盒(也称为基因盒)。这是出乎意料的，因为本发明需要将多个表达盒整合到细菌染色体中。然而，众所周知，对于谷氨酸棒状杆菌来说，通过表达盒的整合进行基因组修饰是费力、耗时且低效的，因为质粒基因组整合的罕见事件伴随着在第二次重组后筛选几个菌落以鉴定所需重组事件的罕见事件。当整合多个dna片段时，这个过程常常会出现问题，特别是当表达盒具有同源序列时。不同表达盒中的同源序列在产生菌株时存在问题，因为表达盒可能导致彼此异常重组。小至8至12个碱基对的同源dna片段可引起基因组重组(mateos等人，1996，j bacteriol.，178(19)：5768-75)。因此，在染色体中整合同一基因的多个拷贝是一个限制，而这是调节该途径中多个基因表达的重要先决条件。

19、在本发明的上下文中，通过使用具有编码来自不同生物体的相应基因功能的异源序列的表达盒以及通过最小化启动子和终止序列的多次使用，可以克服整合多个dna片段和避免异常重组的困难。此外，插入位点选择在染色体上必需基因之间，以抑制具有同源序列的表达盒之间的重组。

20、因此，在实施方案中，编码用于乳糖输入的通透酶、gmd、wcag和fuct的染色体整合的外源核酸序列包含整合在不同染色体基因间区域中的多个表达盒。优选地，盒的整合/插入位点位于细菌的不同必需基因之间的不同基因间区域。

21、在实施方案中，本发明的遗传修饰的细菌包含3、4、5、6、7、8、9或10个表达盒。优选地，本发明的遗传修饰的细菌包含至少5、6或8个表达盒。

22、在实施方案中，本发明的转基因细菌的每个表达盒具有不同的启动子序列。在优选的实施方案中，转基因细菌的不超过两个表达盒包含相同的启动子。在实施方案中，转基因细菌的不超过三个表达盒包含相同的启动子。在两个或多个表达盒包含相同启动子的实施方案中，优选存在于两个或多个表达盒中的启动子是tuf和/或tac启动子。

23、在实施方案中，本发明的转基因细菌的每个表达盒具有不同的终止序列(terminator sequence)。在优选的实施方案中，转基因细菌的不超过两个表达盒包含相同的终止子。在实施方案中，转基因细菌的不超过三个表达盒包含相同的终止子。

24、在实施方案中，表达盒包含一个或多个异源启动子。在实施方案中，表达盒包含一个或多个棒状杆菌启动子。在实施方案中，表达盒包含一个或多个异源启动子和一个或多个棒状杆菌启动子。

25、在包含棒状杆菌启动子，例如来自棒状杆菌的tuf和/或glya启动子的实施方案中，包含棒状杆菌启动子的表达盒整合在跨越必需基因的基因间位点。

26、此外，还需要高水平表达选择性通路基因，以提高糖酵解中间体果糖-6-磷酸生产岩藻糖基乳糖的通量，而不损害细胞生长，这需要测试组成和调节启动子。基因剂量和启动子强度是菌株构建过程中需要考虑的重要因素。

27、在本发明的上下文中，通过使用特定选择的诱导型启动子来表达该途径中的调控基因，特别是gmd和manb，可以确保岩藻糖基乳糖生产途径的所有转基因的高表达。例如，在本文描述的优选实施例mb02中，manb_manc和gmd_wcag操纵子经历诱导型表达。还可以优选的是，fuct为可诱导型表达，如本文针对基础菌株mb002中的hpfuct所述。为了实现途径基因的诱导型表达，由laclq启动子驱动的乳糖阻遏基因laci的基因盒被另外引入染色体中。

28、通过其他基因的组成性表达，可以进一步提高2fl的产量。在实施方案中，wcag-gmd操纵子受组成型启动子例如tuf启动子的控制，该启动子带有lac操纵子，以实现iptg诱导型表达，以避免早期和对数期期间的生长损伤。

29、诸如转座酶基因之类的可移动遗传元件对异源蛋白的表达是有害的(choi,jaewoong等人，“enhanced production of recombinant proteins with corynebacteriumglutamicum by deletion of insertion sequences(is elements).”microbial cellfactories，第14卷，第1期，2015年1月，第207-207页)。

30、在本发明的优选实施方案中，选择外源核酸序列的合适染色体整合位点(转基因/表达盒)来整合带有转座酶基因同时缺失的基因盒。可重复的基因表达基于整合的报告基因盒的相对表达来确定来自所选位点的表达，所述报告基因盒例如优选地在组成型lacuv5启动子的控制下的大肠杆菌半乳糖苷酶(lacz)基因。进一步选择lacz表达水平高的位点整合2fl通路基因盒。因此，在实施方案中，遗传修饰的基因棒状杆菌的外源核酸序列的整合位点已经根据使用报告基因表达盒评估的外源基因表达的适用性来选择，并且优选地还适合整合2fl途径基因盒。

31、本发明的外源核酸序列的优选染色体整合位点已在下面的实施方案中公开。在本发明的上下文中，用于表达盒的优选整合位点包含导致以下转座酶基因缺失的整合：δcgp_2725、δcgp_1213、δcgp_2854、δcgp_3151、δcgp_1178、δcgp_1782、δcgp_2600。

32、报告基因在棒状杆菌中优选的整合位点的表达惊人地增加，如图7所示，并在下面的实施例中进行讨论。

33、如本文所用，术语遗传修饰的棒状杆菌和遗传工程棒状杆菌可互换使用。

34、除了提供外源岩藻糖基转移酶(fuct)外，棒状杆菌还需要加入gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合酶(该酶也称为“gdp-4-酮-6-脱氧-d-甘露糖-3,5-差向异构酶-4-还原酶”，也简称为“wcag”)和用于乳糖输入的通透酶，如乳糖通透酶(lacy)。

35、重要的是，与使用大肠杆菌生产岩藻糖基乳糖的方法相比，大肠杆菌具有编码gmd、wcag和乳糖通透酶(lacy)的基因，而谷氨酸棒状杆菌没有编码这些酶的基因，因此需要提供用于表达这些基因的外部编码核酸序列。

36、在实施方案中，编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因来源于幽门螺杆菌(helicobacter pylori)，编码gmd、wcag和乳糖通透酶(lacy)的基因来源于大肠杆菌。

37、在实施方案中，棒状杆菌还包含用于表达磷酸甘露糖变位酶(manb)和gtp-1-甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manc)的染色体整合的外源核酸序列。

38、谷氨酸棒状杆菌具有编码磷酸甘露糖变位酶(manb)和甘露糖-1-磷酸鸟酰转移酶(manc)的基因，因此可以表达这些基因。因此，这些基因可能不是绝对需要从外源核酸序列进一步表达的。然而，这些酶的表达增加对于岩藻糖基乳糖的大规模生产是有利的，因此，本发明优选包含用于表达manb和manc的染色体整合的外源核酸序列。

39、在优选实施方案中，棒状杆菌另外包含染色体整合的外源核酸序列，例如用于表达乳糖阻遏物的表达盒。乳糖阻遏物(或lac阻遏物；由乳糖阻遏基因编码)是在不存在乳糖或iptg的情况下抑制存在于包含lac操纵子或其部分的表达盒中的本发明转基因的表达的dna结合蛋白。用于诱导型转基因表达的相应诱导型遗传系统是本领域已知的。在本发明的上下文中，lac阻遏物控制的外源基因的诱导表达可以包含使用lac/iptg诱导型启动子，如lac、tac、trc等。在实施方案中，合成化学品iptg也可用于诱导相应的基因。

40、在本发明的上下文中，提供乳糖用于由本发明的转基因细菌合成fl。在本发明的细菌中包含转基因表达的lac阻遏物是有利的。本发明合适的lac阻遏物包含来自大肠杆菌的lacl基因。

41、在实施方案中，本发明的表达盒包含启动子和编码序列。在实施方案中，本发明的表达盒包含启动子、操纵子和编码序列。在实施方案中，本发明的表达盒包含启动子、操纵子、终止序列和编码序列。在实施方案中，本发明的表达盒包含启动子、操纵子、终止序列和/或编码序列。在实施方案中，这样的表达盒可以包含一个以上的编码序列。

42、本发明上下文中使用的优选启动子包含tac启动子、tuf启动子、glya启动子、lac启动子和trc启动子。本发明的优选操纵子包含lac操纵子。优选终止子包含t7终止子和rrnb终止子。

43、用于本发明转基因的优选启动子已在下面的实施例中进行了描述。如本领域技术人员所理解的，在本发明范围内可以独立使用的其中描述的单个表达盒，包含用于单个基因的盒或包含多个基因的盒，例如其中描述的操纵子，不必以下面实施方案中公开的确切组合使用。

44、在用于生产岩藻糖基乳糖的遗传修饰的棒状杆菌实施方案中，manc和manb由在单个操纵子内包含manc和manb编码序列的连续外源核酸序列编码。这样的操纵子可以由单个启动子控制，例如tac启动子。

45、在实施方案中，manc和manb由分离的(非连续的)外源核酸序列编码，优选地包含独立的调控序列。各自的编码序列可以在棒状杆菌染色体内的独立位置整合。

46、如本文所公开的，本发明的棒状杆菌可以分别包含每个转基因，例如，在单独的外源核酸序列中，优选具有独立的调控序列。在替代实施方案中，本发明的棒状杆菌的两个或多个转基因可以由连续外源核酸序列包含/编码，所述连续外源核酸序列包含单个操纵子内的两个或更多个转基因的编码序列。

47、本发明棒状杆菌的每个转基因可以多于一个拷贝存在，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝，其中一个转基因的拷贝数可以独立于其他转基因的拷贝数。其中，一个转基因的拷贝可以是相同的(相应转基因的相同编码序列)也可以是该转基因的不同变体，例如不同来源的转基因。例如，就fuct而言，本发明的细菌可以包含两种编码fuct的外源核酸序列(两个拷贝)，其中一个拷贝可以是，例如，来自幽门螺杆菌的fuct编码序列，另一个拷贝可以是，例如，来自鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)的fuct编码序列。这同样适用于本发明的棒状杆菌的每一种不同的转基因。

48、在优选实施方案中，棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌。

49、谷氨酰胺棒状杆菌因其被归类为gras宿主而成为白色生物技术中常用且重要的微生物。

50、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌输出岩藻糖基乳糖。

51、在本发明的实施方案中，遗传修饰的棒状杆菌被设计成在适当的培养条件下生长时将岩藻糖基乳糖输出到培养基中。应当理解，fl的输出涉及导致fl存在于培养基中的细菌外部的主动的或被动的任何类型的过程。

52、在实施方案中，由本发明的遗传工程棒状杆菌包含的fuct为α-1,2-fuct。在进一步的实施方案中，fuct包含α-1,2-fuct。

53、为了生产2'-fl，优选使用合适的α-1,2-fuct。包含来自幽门螺杆菌的α-1,2-fuct的棒状杆菌是特别优选的。或者，也可以使用来自大肠杆菌o126或长链热共生菌(thermosynechoccus elongatus)的α-1,2-fuct wbgl。或者，也可以使用来鼬鼠螺杆菌的α-1,2-fuct。

54、在实施方案中，由本发明的遗传工程棒状杆菌包含的用于乳糖输入的通透酶是乳糖通透酶(lacy)。

55、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列来自幽门螺杆菌。

56、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列的表达由trc启动子控制。

57、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列来自幽门螺杆菌，并且fuct编码序列的表达由trc启动子控制。

58、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列是由来自鼬鼠螺杆菌的密码子优化的。

59、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列的表达由tuf启动子控制。

60、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列是来自鼬鼠螺杆菌的密码子优化的，并且fuct编码序列的表达由tuf启动子控制。

61、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列来自幽门螺杆菌，并且fuct编码序列的表达由tuf启动子控制。

62、在实施方案中，棒状杆菌包含至少一种编码fuct的外源核酸序列，其中fuct编码序列是来自鼬鼠螺杆菌的密码子优化的，并且fuct编码序列的表达由trc启动子控制。

63、在实施方案中，棒状杆菌包含至少两种编码fuct的外源核酸序列。

64、在实施方案中，棒状杆菌包含至少两种编码fuct的外源核酸序列，其中优选地

65、i.第一fuct编码序列来自幽门螺杆菌和/或第一fuct编码序列的表达受trc启动子控制，并且

66、ii.第二fuct编码序列是由来自鼬鼠螺杆菌的密码子优化的和/或第二个fuct编码序列的表达由tuf启动子控制。

67、在本发明棒状杆菌的实施方案中，棒状杆菌包含至少两种编码fuct的外源核酸序列。

68、在实施方案中，本发明的棒状杆菌包含来自幽门螺杆菌的fuct。

69、在实施方案中，本发明的棒状杆菌包含由trc启动子控制的fuct编码序列。

70、在实施方案中，本发明的棒状杆菌包含来自鼬鼠螺杆菌的fuct。

71、在实施方案中，本发明的棒状杆菌包含由tuf启动子控制的fuct编码序列。

72、在实施方案中，由本发明棒状杆菌组成的fuct包含来自幽门螺杆菌的fuct和来自鼬鼠螺杆菌的fuct。

73、在本发明的遗传修饰的棒状杆菌的优选实施方案中，wcag和gmd由连续的外源核酸序列编码，所述连续的外源核酸序列包含单个操纵子内的wcag和gmd的编码序列。

74、在实施方案中，wcag和gmd由分离的(非连续的)外源核酸序列编码，优选地包含独立的调控序列。各自的编码序列可以在棒状杆菌染色体内的独立位置整合。

75、在实施方案中，本发明的棒状杆菌包含至少一种编码wcag和gmd的外源核酸序列，其被编码为表达gmd和wcag两者活性的单一融合基因。

76、在实施方案中，wcag和gmd的编码序列来自大肠杆菌。

77、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌在单个操纵子内的连续外源核酸序列中包含至少一种编码wcag和gmd的外源核酸序列。在实施方案中，编码wcag和gmd的操纵子由tac启动子控制。在实施方案中，wcag和/或gmd的编码序列来自大肠杆菌。在实施方案中，编码wcag和gmd的操纵子由tuf启动子控制。在实施方案中，wcag和/或gmd的编码序列来自脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)。

78、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌在单个操纵子内的连续外源核酸序列中包含至少两种编码wcag和gmd的外源核酸序列，其中优选地

79、i.第一wcag和gmd编码操纵子由tac启动子控制和/或编码序列来自大肠杆菌，并且

80、ii.第二wcag和gmd编码操纵子由tuf启动子控制和/或编码序列来自脆弱拟杆菌。

81、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌包含至少一种编码用于乳糖输入的通透酶的外源性核酸序列。

82、在实施方案中，用于乳糖输入的通透酶的编码序列的表达由glya启动子控制。

83、在实施方案中，用于乳糖输入的通透酶是来自德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)的lacy。

84、在实施方案中，用于乳糖输入的通透酶的编码序列的表达由组成型lac启动子控制。在实施方案中，用于乳糖输入的通透酶是来自大肠杆菌的lacy。

85、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌包含至少两种编码用于乳糖输入的通透酶的外源核酸序列，其中优选地

86、i.第一乳糖输入通透酶编码序列的表达受glya启动子控制和/或第一乳糖输入通透酶编码序列是来自德氏乳杆菌的lacy，并且

87、ii.第二乳糖输入通透酶编码序列的表达由组成型lac启动子和/或来自大肠杆菌的lacy控制。

88、在优选的实施方案中，棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌并且包含

89、-至少两种编码fuct的外源核酸序列，

90、-至少两种编码wcag的外源核酸序列，

91、-至少两种编码gmd的外源核酸序列，以及

92、-至少两种编码lacy的外源核酸序列。

93、在这样的实施方案中，外源核酸序列优选地包含在单个操纵子内的连续核酸序列中的wcag和gmd的编码序列。在优选实施方案中，本发明的棒状杆菌包含两个(或更多个)具有wcag和gmd编码序列的此类操纵子。

94、在优选的实施方案中，棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌并且包含

95、-至少两种编码fuct的外源核酸序列，

96、-在单个操纵子内的连续外源核酸序列中至少两种编码wcag和gmd的外源核酸序列，以及

97、-至少两种编码lacy的外源核酸序列。

98、在此，发明人发现目前使用的将基因整合到棒状杆菌的方法与传统的诱变相比是一种快速、安全和适用的策略。所生产化合物的细胞输出是开发可行的工业生物技术工艺的理想选择。本文发现，靶向酶参与细胞壁的形成，促进了产物从细胞质到发酵液的快速扩散。发明人在此系统地删除了在产生2fl的菌株中参与三层棒状杆菌细胞壁合成的酶，并鉴定了当删除时令人惊讶地增加2fl产生的酶。

99、棒状杆菌的细胞壁是复杂且多层的。细胞质或质膜上排列着糖脂，与一层厚厚的肽聚糖层结合。这些层保护细胞免受各种压力条件的影响。富含脂质的外部层的分枝菌酸通过阿拉伯半乳聚糖的多糖网共价连接到肽聚糖表面。因此，在缺乏特定转运蛋白或孔蛋白的情况下，这些多层膜阻碍了代谢物从细胞质向周围环境的扩散，反之亦然。

100、葡萄糖醛酸二酰基甘油(gl-a)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(pim)和磷脂酰甘油(pg)是细胞质膜的结构性磷脂。膜pim和膜gi-a作为聚合甘露糖的附着位点，聚合甘露糖与gt-c糖基转移酶缀合并形成成熟的脂甘露聚糖(lm)和脂阿拉伯甘露聚糖(lam)。cgp_2400和cgp_1876编码产生pim的糖基转移酶，并且cgp_0554分别催化g1-a。

101、聚戊烯醇单磷酸甘露糖(ppm)是脂聚糖生物合成和蛋白质糖基化的周质甘露糖基供体，由糖基转移酶家族成员cgp_1672，一种聚异戊烯醇-单磷酸甘露糖合酶，在细胞质中合成(mohiman n，等人，plos one，2012)。ppm操纵子对谷氨酸棒状杆菌中脂蛋白的酰化和糖基化至关重要。转移到内膜质周表面的ppm是糖基转移酶家族成员cgp_2385、cgp_3164、cgp_2393和cgp_2390的底物。在lm和lam中，cgp_2385和cgp_3164催化形成较长的(1→6)甘露聚糖主链。而cgp_2393和cgp_2390编码(1→2)-甘露糖吡喃基转移酶，这是合成lm和lam甘露糖骨架α(1→2)键所必需的。多种阿拉伯糖烷酰转移酶可逐步组装脂阿拉伯糖甘露聚糖(lam)和阿拉伯半乳聚糖(ag)中的支链结构域，这是两种最大的细胞壁脂多糖。cgp_2389编码α(1→2)阿拉伯糖醛基转移酶，生物合成单一阿拉伯糖lam。

102、肽聚糖(pg)在细胞质膜的外表面合成，以维持细胞的结构完整性。pg是一种强大的支架状结构，由短肽交联的聚合聚糖链组成，形成一个包裹细胞的同质分子。pg的合成是由称为青霉素结合蛋白(pbp)的膜结合酶催化的。它们根据催化转糖基化(从二糖形成聚糖链)和转肽化(通过肽部分交联聚糖链)的酶结构域进行分类。有三类pbp：a类高分子量pbp(hmw-pbp)，具有转肽酶和转糖基酶结构域；b类hmw-pbp，具有功能未知的n端结构域和转肽酶结构域；以及低分子量pbp(lmw-pbp)，具有d,d-羧肽酶或内肽酶活性(valbuena n等人，mol microbiol.2007，“characterization of hmw-pbps from the rod-shapedactinomycete corynebacterium glutamicum:peptidoglycan synthesis in cellslacking actin-like cytoskeletal structures”，mol microbiol，2007年11月；66(3):643-57)。

103、在不存在细胞壁弱化剂的情况下，菌株atcc 13869中cgp_3313同源物的突变体和缺失使转化效率分别提高了19.25倍和4.89倍。然而，它并没有导致谷氨酸产生或排泄的增加(liu j，等人，“mutations in peptidoglycan synthesis gene pona improveelectrotransformation efficiency of corynebacterium glutamicum atcc 13869”appl environ microbiol，2018年11月30日；84(24):e02225-18)。

104、发明人在此删除了菌株mb007中的cgp_3313及其cgp_0336的密切同源物以测试2fl的输出，并观察到提高2fl产量和提高2fl排泄/外排的惊人效果(见图9)。

105、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌在涉及棒状细菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的功能性表达方面存在缺陷。

106、令人惊讶的是，研究发现，参与棒状菌细胞壁生物合成的糖基转移酶的缺陷并不影响细胞内代谢途径的效率，特别是不影响岩藻糖基乳糖生物合成途径的效率。

107、然而，重要的是，可能是由一种或多种此类糖基转移酶失活引起的这种功能缺陷，减少了棒状杆菌培养物在培养过程中的泡沫产生，因此使这种过程更容易处理。此外，由于在培养容器/容器中没有为培养过程中产生的泡沫保留额外的空间，因此可以扩大细菌培养物的体积。

108、出乎意料的是，泡沫的减少不仅为培养和生产过程带来了这样的实际优势，而且事实证明，参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的缺乏也使得更有效地从细菌培养物中生产和纯化岩藻糖基乳糖成为可能。因此，除了培养更大体积的可能性之外，并且独立于这种可能性，与产生对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶没有缺陷的棒状杆菌相比，从相同的培养物体积中纯化更高量的岩藻糖基乳糖也是可能的。

109、其中，所述一种或多种糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0848(wbbl；gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

110、其中，所述一种或多种糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

111、其中，所述一种或多种糖基转移酶优选选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

112、在实施方案中，棒状杆菌对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达有缺陷，所述糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0848(wbbl；gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

113、在实施方案中，棒状杆菌对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达有缺陷，所述糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

114、在实施方案中，杆状杆菌在参与杆状菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达上存在缺陷，这种糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

115、在实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自：cgp_0336(gt51)、cgp_2385(gt87)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2390(gt87)、cgp_2393(gt87)、cgp_0554(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1877(gt4)、cgp_2400(gt4)和cgp_3191(gt2)。

116、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_3164有缺陷。

117、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_0554有缺陷。

118、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_2385有缺陷。

119、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_3191有缺陷。

120、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_0336有缺陷。

121、在优选的实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自cgp_0336(gt51)、cgp_2385(gt87)、cgp_0554(gt4)、cgp_3164和cgp_3191(gt2)。

122、另一方面，本发明涉及用于生产岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包含在补充有乳糖的培养基中培养本发明的遗传修饰的棒状杆菌，其包含如本文所述的用于生产岩藻糖基乳糖的转基因。

123、在本发明方法的实施方案中，培养基另外包含葡萄糖。

124、优选地，本发明的培养基不含抗生素。

125、在上下文中描述的本发明的细菌的任何特征也在本发明的方法上下文中公开，反之亦然。

126、本发明涉及具有一种或多种参与棒状杆菌细胞壁生物合成的有缺陷的糖基转移酶的遗传修饰的棒状杆菌的方面

127、另一方面，本发明涉及用于生产生物分子的遗传修饰的(或工程化)棒状杆菌，其特征在于所述棒状杆菌在参与棒状细菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的功能性表达方面存在缺陷。

128、令人惊讶的是，研究发现，参与棒状菌细胞壁生物合成的糖基转移酶的缺乏并没有显著损害细胞内代谢途径的生长和效率，特别是不会损害引入的岩藻糖基乳糖生物合成途径的生长和效率。

129、棒状杆菌细胞壁是多层的，磷脂细胞质膜被厚的阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖鞘包围，鞘共价附着在称为菌膜的外膜上。菌膜是由分枝菌酸、磷脂、脂聚糖和蛋白质组成的复杂整体，形成疏水双层。它是棒状杆菌属中小亲水性溶质和抗菌化合物运输的主要渗透性屏障。

130、当检测棒状杆菌中fl的产生时，发现2fl在棒状杆菌中的外排受到细菌细胞壁的明显阻碍。在细胞内大量产生fl的全细胞株导致代谢中间体的积累，这些中间体已知可以抑制该途径的限速基因，如manb和gmd。这可能会导致细胞的代谢负担，从而导致生长停滞或fl合成效率低下。这种低效的发酵和回收过程最终增加了规模化的经济成本。因此，研究了是否可以通过系统地删除参与棒状杆菌细胞壁多层形成的糖基转移酶来改善膜流动性，以及这种删除是否对这些遗传修饰的棒状杆菌中岩藻糖基乳糖等生物分子的外排有影响。

131、然而，重要的是，令人惊讶地发现，这种由参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶失活引起的功能缺陷减少了生产过程中棒状杆菌培养物的泡沫产生，因此使得此类过程更容易处理。因此，还可以扩大细菌培养物的体积，因为培养器皿/容器中没有为培养过程中产生的泡沫保留额外的空间。此外，起泡还会导致污染和材料损失，这两者都会降低产量。

132、起泡是棒状菌发酵过程中的一个严重问题，也是实验室生物工艺实验中人工添加消泡剂进行监测和控制的关键因素。工艺优化伴随控制曝气和搅拌，以最大限度地减少起泡。搅拌槽式生物反应器中的搅拌和曝气总是会引起起泡，不受控制的起泡导致无菌条件的丧失；发酵罐被污染，微生物被释放到环境中。此外，泡沫的形成可能会堵塞曝气搅拌槽式生物反应器中的空气过滤器，造成严重的操作困难，特别是在高密度培养中。泡沫的形成通常归因于培养基粘度的增加，这是由于在培养过程和细胞在气液界面裂解过程中形成的变性蛋白质/肽和表面活性剂的增加。然而，其他因素可能有助于棒状杆菌的生物过程，其外膜主要由疏水性和两亲性成分(例如分枝菌酸和磷脂)组成。

133、此外，减少泡沫有利于发酵过程中有效的氧气交换。需氧生物的生长需要培养基中有足够浓度的溶解氧，以溶解氧体积系数(kla)来衡量。kla是衡量在一定时间内转移到培养基中的氧气量的指标，并且它不会随着棒状杆菌培养物中曝气量的增加而改善，因为系统的kla可能受到几个因素的影响，例如培养基的特性，如黏度，生物体及其副产物的存在，过量添加的消泡剂(th.product and by-productdistributions in glutamic acid fermentation by brevibacterium flavum:effectsof the oxygen transfer.j biochem eng j.2001；9:91-101；stanbury,p.f,whitaker,a.和hall,s.j.(2013)principles of fermentation technology.elsevier)。起泡显著降低kla，而氧传递速率(otr)取决于kla(routledge,s.j.(2012)).beyond de-foaming:theeffects of antifoams on bioprocess productivity.comput.struct.biotechnol.j.3.doi:10.5936/csbj.201210014)。起泡也会产生更多的废物并减少细菌生长的培养基和碳源的量。

134、控制泡沫产生基本上有三种方法：培养基改性、机械破泡装置或自动添加化学消泡剂。如果泡沫最小化，则可以提高产量。工业上已使用各种方法来降低泡沫形成率，每种方法都有其自身的优点和缺点。

135、菌株改进是大多数发酵行业工艺开发的重要组成部分。它提供了一种通过优化碳源利用来提高生产率和降低制造成本来降低生产成本的方法。如本文所述，令人惊讶的是，在构建以改善2fl外排为目的遗传修饰的菌株时，鉴定了这种令人期望的特性，特别是棒状杆菌培养物的起泡减少。

136、这不仅在本文所述的岩藻糖基乳糖生产的背景下是有利的。相反，本发明该方面的这些优点还可用于通过棒状杆菌、特别是谷氨酸棒状杆菌生产其他生物分子，因为细胞壁生物合成缺陷的优点对于此类细菌培养物和通过棒状杆菌生产生物分子是普遍的，例如l-谷氨酸和l-赖氨酸、乳酸(盐)、尸胺、异丁醇、琥珀酸(盐)、衣康酸(盐)、植物来源的多酚。

137、出乎意料的是，泡沫的减少不仅为培养和生产过程带来这样的实际优势(参见图11中根据本发明的菌株补料分批中减少的泡沫)，而且结果表明参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的缺乏还允许细菌更有效地生产和纯化生物分子，如下面实施例中的岩藻糖基乳糖所示。因此，除了培养更大体积的可能性之外，并且独立于这种可能性，与产生对于涉及棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶没有缺陷的棒状杆菌相比，从相同的培养物体积中纯化更高量的岩藻糖基乳糖也是可能的。

138、其中，所述一种或多种糖基转移酶选自cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0848(wbbl；gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

139、其中，所述一种或多种糖基转移酶选自cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

140、或者其中，所述一种或多种糖基转移酶优选选自cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

141、在实施方案中，棒状杆菌对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达有缺陷，所述糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0848(wbbl；gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

142、在实施方案中，棒状杆菌对于参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达有缺陷，所述糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

143、在实施方案中，棒状杆菌对于涉及棒状杆菌细胞壁生物合成的一种糖基转移酶的功能性表达有缺陷，所述糖基转移酶优选选自cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

144、在实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自cgp_0336(gt51)、cgp_2385(gt87)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2390(gt87)、cgp_2393(gt87)、cgp_0554(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1877(gt4)、cgp_2400(gt4)和cgp_3191(gt2)。

145、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_3164有缺陷。

146、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_0554有缺陷。

147、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_2385有缺陷。

148、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_3191有缺陷。

149、在优选的实施方案中，本发明的棒状杆菌对cgp_0336有缺陷。

150、在优选的实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自cgp_0336(gt51)、cgp_2385(gt87)、cgp_0554(gt4)、cgp_3164和cgp_3191(gt2)。

151、在本发明的实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0848(wbbl；gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

152、在本发明的实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自：cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_1180(gt2)、cgp_0730(gt2)、cgp_0396(gt2)、cgp_0394(gt2)、cgp_0246(gt2)、cgp_0163(gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

153、在本发明的实施方案中，一种或多种糖基转移酶优选选自cgp_3313(mrcb；gt51)、cgp_0336(pona；gt51)、cgp_3166(gt4)、cgp_2400(gt4)、cgp_1876(gt4)、cgp_1268(glga；gt4)、cgp_0554(gt4)、cgp_3191(glft；gt2)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cgp_2393(gt87,gt87)、cgp_2390(gt87)、cgp_2389(gt87)、cgp_2385(gt87)和cgp_3164。

154、在实施方案中，一种或多种糖基转移酶选自：cg0336(gt51)、cg2385(gt87)、cgp_1672(ppmc；gt2)、cg2390(gt87)、cg2393(gt87)、cg0554(gt4)、cg1876(gt4)、cg1877(gt4)、cg2400(gt4)和cgp_3191(gt2)。

155、在优选的实施方案中，棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌。

156、在实施方案中，棒状杆菌适合生产岩藻糖基乳糖。

157、在实施方案中，本发明的遗传修饰的棒状杆菌输出岩藻糖基乳糖。

158、在本发明的实施方案中，遗传修饰的棒状杆菌被工程化以当在适当的培养条件下生长时将岩藻糖基乳糖输出到培养基中。应当理解，fl的输出涉及导致fl存在于培养基中的细菌外部的主动的或被动的任何类型的过程。

159、在实施方案中，棒状杆菌已被修饰以从外源核酸序列表达用于乳糖输入的通透酶例如乳糖通透酶(lacy)、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合酶(wcag)和岩藻糖基转移酶(fuct)。

160、在实施方案中，遗传修饰的棒状杆菌还包含用于表达磷酸甘露糖变位酶(manb)和gtp-甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manc)的外源核酸。

161、在实施方案中，遗传修饰的细菌的一种或多种外源核酸序列作为质粒存在于细菌中。在实施方案中，遗传修饰的细菌的所有外源核酸序列作为质粒存在于细菌中。

162、在实施方案中，遗传修饰的细菌的一种或多种外源核酸序列被整合到染色体上。在实施方案中，遗传修饰的细菌的所有外源核酸序列均在染色体上整合。

163、在实施方案中，编码lacy、gmd、wcag和fuct的外源核酸序列整合在染色体上。在实施方案中，manb和manc在染色体上整合。

164、上文在具有生产岩藻糖基乳糖所需的染色体整合转基因的本发明的遗传修饰的棒状杆菌的上下文中公开和描述的所有个体特征也在此公开在用于生产生物分子的本发明的遗传修饰的棒状杆菌的上下文中，其特征在于棒状杆菌在参与棒状杆菌细胞壁生物合成的一种或多种糖基转移酶的功能性表达方面存在缺陷。这同样适用于使用本发明的细菌生产生物分子的方法。