用于治疗癌症的唾液酸酶的病毒递送

背景技术：

1、肿瘤微环境的治疗性去唾液酸化能够导致癌症中的免疫介导的生长剧烈减少。唾液酸酶(sialidase)，也称为神经氨酸酶(neuraminidase)，是在大量生物体中发现的酶。病毒唾液酸酶是一些研究最充分的唾液酸酶结构。

2、携带有例如产生免疫刺激细胞因子的转基因的病毒的肿瘤内注射是晚期黑素瘤患者的经批准的治疗选择，并且目前正在包括头颈肿瘤、三阴性乳腺癌和皮肤淋巴瘤在内的不同癌症类型进行研究。

3、基于上述现有技术水平，本发明的目的是提供通过施用唾液酸酶治疗癌症或补充实体癌治疗的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现，另外的有利实施方案描述于从属权利要求、实施例、附图和本说明书的一般描述中。

技术实现思路

1、本发明涉及一种腺相关病毒(aav)载体，其包含唾液酸酶(sia)转基因，该转基因具体地编码流感衍生的神经氨酸酶蛋白质。本发明的进一步的方面涉及除了与本发明特别相关的施用途径和方法之外，所述携带神经氨酸酶的腺相关病毒(aav-sia)作为治疗癌症或增强为对抗癌症而施用的免疫疗法的效应的药物的用途。

2、在另一实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的aav-sia和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，任选地还包含检查点抑制剂。

3、术语和定义

4、出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，应以阐述的定义为准。

5、如本文所用，术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”及其其它类似形式和语法等同物旨在具有等同的含义并且是开放式的，因为在这些词语中的任一者之后的一个或多个项不旨在是此类一个或多个项的穷尽性列举，或旨在仅限于所列举的一个或多个项。例如，“包含”组分a、b和c的制品可以由组分a、b和c组成(即，仅包含)，或者可以不仅含有组分a、b和c，而且还含有一种或多种其它组分。因此，意图在于且应理解，“包含”及其类似形式及其语法等同物包括“基本上由......组成”或“由......组成”的实施方案的公开内容。

6、在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的每一中间值到下限单位的十分之一以及在该陈述范围内的任何其它陈述或中间值涵盖在本公开内，在陈述范围内受到任何明确排除的限制。在陈述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。

7、本文中提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。

8、如本文所用，包括在所附权利要求书中，单数形式“一个”、“或”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。

9、除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见sambrook等人,《分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》，第4版(2012)，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社和ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(short protocols in molecularbiology)》(2002)第5版，约翰威利父子公司(john wiley&sons,inc.))以及化学方法。

10、术语基因是指含有至少一个开放阅读框(orf)的多核苷酸，该多核苷酸在被转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。多核苷酸序列可以用于识别与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。

11、术语基因表达或表达，或者作为选择术语基因产物，可以指生成核酸(rna)或者生成肽或多肽的过程及其产物中的任一者或两者，也分别指转录和翻译，或调节遗传信息的加工以产生多肽产物的任何中间过程。术语基因表达也可以应用于转录和加工rna基因产物，例如调节性rna或结构性(例如核糖体)rna。如果表达的多核苷酸衍生自基因组dna，则表达可包括真核细胞中mrna的剪接。可以在转录和翻译水平，换句话说，在mrna和/或蛋白质产物水平，测定表达。

12、与本文公开的序列类似或同源(例如，至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的一部分。在一些实施方案中，氨基酸水平的序列同一性可以是约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在核酸水平，序列同一性可以是约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。作为选择，当核酸区段将在选择性杂交条件(例如，非常高严格性杂交条件)下与链的互补序列杂交时，存在实质同一性。核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。

13、在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指表示通过逐位置比较两个比对序列而确定的序列比较结果的单个定量参数。用于比对比较序列的方法是本领域公知的。比较序列的比对可以进行如下：通过smith和waterman的局部同源性算法，《应用数学进展(adv.appl.math.)》2:482(1981)；通过needleman和wunsch的全局比对算法，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》48:443(1970)；通过pearson和lipman的搜索类似性方法，《美国科学院院报(proc.nat.acad.sci.)》85:2444(1988)；或者通过这些算法的计算机化实施方案，包括但不限于：clustal、gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。用于执行blast分析的软件例如通过美国国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)是公众可获得的。

14、氨基酸序列比较的一个实例是blastp算法，该blastp算法使用以下默认设置：期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：blosum62；空位罚分：存在11，扩展1；组成调整：条件组成分数矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这种实例是blastn算法，该blastn算法使用以下默认设置：期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/不匹配评分：1.-2；空位罚分：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用blast程序组获得的值(altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990))，该blast程序组使用上述分别用于蛋白质和核酸比较的默认参数。

15、提及相同的序列而没有指定百分比值意味着100％相同的序列(即同一序列)。

16、本说明书的上下文中的缩写aav涉及腺相关病毒，一种感染人和其它灵长类物种的小非致病性病毒。术语aav与aav病毒体和aav病毒颗粒同义，并且涉及由至少一种aav衣壳蛋白质和用壳体包裹的aav核酸构成的病毒颗粒。用于基因递送目的的aav制剂通常依赖于与辅助病毒如腺病毒共感染以复制，但也可以存在复制型aav。除非另有说明，aav是指所有亚型或血清型以及复制型和重组形式。术语aav涵盖野生型血清型如血清型aav1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和具有特定组织靶向偏好的合成变体。

17、在本说明书的上下文中，术语转基因涉及已经从一种生物体转移到另一种生物体的基因或遗传物质，在此是指在aav载体内插入神经氨酸酶基因。根据本发明的实施方案，该术语涵盖编码衍生自流感病毒rna基因组的神经氨酸酶的orf。本领域技术人员能够基于该信息来构建dna基因组腺病毒载体，以产生编码流感神经氨酸酶蛋白质的dna序列。在本上下文中，该术语也可以指将遗传序列的表达转移到感染aav载体的患者的组织中。

18、术语唾液酸酶在本说明书中可以与术语神经氨酸酶互换使用。在本发明的上下文中，术语唾液酸酶或神经氨酸酶是指糖苷水解酶家族，糖苷水解酶催化与寡糖链连接的非还原唾液酸残基的裂解，该非还原唾液酸残基是神经氨酸基团的衍生物。

19、在本发明的上下文中，术语流感衍生病毒的唾液酸酶是指在正粘病毒科流感病毒中天然存在的神经氨酸酶蛋白质的已知变体中的一个。

20、在本说明书的上下文中，术语检查点抑制剂、免疫检查点抑制剂或检查点抑制性抗体意在涵盖能够在t细胞活化后破坏导致t细胞抑制的信号级联的试剂，具体地抗体(或抗体样分子)，其在本领域已知为免疫检查点机制的一部分。检查点抑制剂或检查点抑制抗体的非限制性实例包括抑制ctla-4(uniprot p16410)、pd-1(uniprot q15116)、pd-l1(uniprot q9nzq7)或b7h3(cd276；uniprot q5zpr3)与它们的天然配体的相互作用的抗体。

21、在本说明书的上下文中，术语抗体是指完整抗体，其包括但不限于免疫球蛋白g型(igg)、a型(iga)、d型(igd)、e型(ige)或m型(igm)，其任何抗原结合片段或单链以及相关或衍生的构建体。全抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)构成。igg的重链恒定区由三个结构域，ch1、ch2和ch3构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区(cl)构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分。该术语涵盖抗体样分子如所谓的纳米抗体或单个结构域抗体，包含单个单体可变抗体结构域或由其组成的抗体片段，或者单链可变片段(scfv)多聚体。

22、如本文所用，术语药物组合物是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐，连同至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物以适于局部、肠胃外或可注射施用的形式来提供。

23、如本文所用，术语药学上可接受的载体包括本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、染料等及其组合(参见例如《雷明顿：药学的科学和实践(remington:the science and practice of pharmacy)》isbn 0857110624)。

24、如本文所用，在一个实施方案中，术语治疗(treating)任何疾病或病症(例如癌症)或者任何疾病或病症(例如癌症)的治疗(treatment)是指改善疾病或病症(例如减缓或抑制或降低恶性肿瘤疾病的发展、扩散或生长速率)。在另一实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻或改善至少一种身体参数，其包括患者可能无法辨别的那些。在另一实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或两者上调节疾病或病症。用于评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的，除非在下文中具体描述。