检测多种类型的癌症的存在或不存在的制作方法

本文提供了用于从生物样品中筛查多种类型的癌症的技术。具体而言，所提供的涉及用于从生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中同时检测多种类型的癌症(例如，肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌和子宫癌)的存在的方法、组合物和相关用途。

背景技术：

1、很多时候，医疗保健专业人员只能在症状出现后才能做出癌症诊断——此时进行治疗性处理可能为时已晚。筛查项目，诸如针对宫颈癌的巴氏涂片检查和针对乳腺癌的乳房x光检查，旨在通过早期检测癌症来克服这一问题。然而，此类测试通常仅适用于一小部分人群(风险最高的人群)，仅限于少数癌症，并且依从率各异。这些方法也可以是侵入性的或令人不舒服的，这可以阻碍参与。

2、因此，迫切需要改进的诊断工具来从单个生物样品中检测多种类型的癌症。

3、本发明解决了这种需要。

技术实现思路

1、本文提供了用于从生物样品中筛查多种类型的癌症的技术，具体而言，但非排他性地，提供了用于从生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中同时检测多种类型的癌症(例如，肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌和子宫癌)的存在的方法、组合物和相关用途。

2、事实上，如实施例i中所述，在本发明的鉴定实施方案过程中进行的实验鉴定出甲基化dna标志物(mdm)的集合、蛋白质标志物的集合以及mdm和蛋白质标志物的组合，所述mdm和所述蛋白质标志物用于从生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中同时检测多种类型的癌症(例如，肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌、子宫癌)的存在。

3、具体而言，此类实验鉴定出以下mdm和蛋白质标志物的组合以及/或者mdm和蛋白质标志物组，所述mdm和所述蛋白质标志物用于从生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中检测多种类型的癌症(例如，肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌、子宫癌)：

4、甲基化dna标志物：faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781、st8sia1、iffo1、hoxa9、hopx、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b(参见，图3、表5、13和14，实施例i)；

5、甲基化dna标志物：faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781和st8sia1(参见，图3，实施例i)；

6、甲基化dna标志物：grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、iffo1、hoxa9和hopx(参见，表5，实施例i)；

7、甲基化dna标志物：grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、cdo1、emx1、prkcb、sfmbt2、st8sia1、hoxa1、hoxb2、barx1、clec11a、arhgef4、iffo1、hoxa9、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、shisa9、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b(参见，表13和14，实施例i)；

8、甲基化dna标志物：faim2、chst2、znf671、grin2d、cdo1(参见，图3和实施例i)；

9、甲基化dna标志物：znf671、grin2d、ndgr4、shox2、b3galt6(参见，实施例i)；

10、甲基化dna标志物：cdo1、grin2d、shox2、osr2、qki、sim2、trh、capn2、sfmbt2、chst2、st8sia1、hoxa1、fer1l4、faim2、iffo1、emx1、znf671、prkcb、hoxb2、barx1、ppp2r5c和tspyl5(参见，实施例i)；

11、蛋白质标志物：cea、ca125、ca19.9、afp和ca-15-3(参见，实施例i)；

12、蛋白质标志物：cea、ca125和ca19.9(参见，图2和实施例i)；以及

13、蛋白质标志物：cea、ca125、ca19.9和afp(参见，图4和实施例i)。

14、如本文所述，所述技术提供了甲基化dna标志物(mdm)的集合及其子集(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38个的集合)、蛋白质标志物的集合(例如，2、3、4、5个的集合)以及mdm和蛋白质标志物的组合，所述mdm和所述蛋白质标志物用于从生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中同时检测多种类型的癌症的存在。

15、在某些实施方案中，提供了用于表征生物样品，例如来自人类受试者的生物样品的方法，所述方法包括以下一项或两项：

16、a)测量所述生物样品中的一个或多个甲基化标志物的甲基化水平，所述甲基化标志物选自：faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781、st8sia1、iffo1、hoxa9、hopx、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b；以及

17、b)测量所述生物样品中的一个或多个蛋白质标志物的表达和/或活性水平，所述蛋白质标志物选自cea、ca125、ca19.9、afp和ca-15-3。

18、在一些实施方案中，如果测量了一个或多个甲基化标志物的甲基化水平，则将所测量的一个或多个甲基化标志物的甲基化水平与无特定类型的癌症的对照样品中的相应的一个或多个甲基化标志物的甲基化水平进行比较；以及/或者

19、其中如果测量了一个或多个蛋白质标志物的表达和/或活性水平，则将所测量的一个或多个蛋白质标志物的表达和/或活性水平与无特定类型的癌症的对照样品中的相应的一个或多个蛋白质标志物的表达和/或活性水平进行比较。

20、在一些实施方案中，所述方法还包括当满足以下一项或两项时确定所述人类受试者患有多于一种类型的癌症：

21、i)在一个或多个甲基化标志物中测量的甲基化水平高于在相应的对照样品中测量的甲基化水平；以及

22、ii)一个或多个蛋白质标志物的表达和/或活性水平高于在相应的对照样品中测量的表达和/或活性水平。

23、在一些实施方案中，所述多于一种类型的癌症是任何类型的癌症。在一些实施方案中，所述多于一种类型的癌症选自肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌和子宫癌。

24、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括用无亚硫酸氢盐和碱基分辨测序方法来处理来自所述生物样品的dna，以直接检测5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

25、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括使用以甲基化特异性方式修饰dna的试剂来处理来自所述生物样品的dna。在一些实施方案中，所述以甲基化特异性方式修饰dna的试剂是硼烷还原剂，例如所述硼烷还原剂可以是2-甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，所述试剂包括甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂中的一者或多者。在一些实施方案中，所述试剂是亚硫酸氢盐试剂，并且所述处理产生亚硫酸氢盐处理的dna。

26、在一些实施方案中，用对所述一个或多个甲基化标志物具有特异性的引物的集合来扩增所述处理的dna。在一些实施方案中，针对所选择的一个或多个甲基化标志物中的每个的引物的集合选自表2中列举的组。在一些实施方案中，对每个所选择的一个或多个甲基化标志物具有特异性的引物的集合能够结合由表2中列举的特异性甲基化标志物基因的引物序列结合的扩增子，其中由表2中列举的所述甲基化标志物基因的通过引物序列结合的所述扩增子是针对表1中列举的所述甲基化标志物的遗传区域的至少一部分。在一些实施方案中，对每个所选择的一个或多个甲基化标志物具有特异性的引物的集合是特异性结合包含表1中列举的甲基化标志物的染色体坐标的遗传区域的至少一部分的引物的集合。

27、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括多重扩增。

28、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括使用一种或多种选自由以下各项组成的组的方法：甲基化特异性pcr、定量甲基化特异性pcr、甲基化特异性dna限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序、瓣核酸内切酶测定法、pcr-瓣测定法和亚硫酸氢盐基因组测序pcr。

29、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括测量所述一个或多个甲基化标志物中的每个的cpg位点的甲基化。在一些实施方案中，所述cpg位点存在于编码区或调控区中。

30、在一些实施方案中，所述一个或多个甲基化标志物由表1中所示的基因组坐标描述。

31、在一些实施方案中，所述生物样品是粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品。

32、在一些实施方案中，所述人类受试者患有或疑似患有癌症。

33、在一些实施方案中，所述一个或多个甲基化标志物选自以下组中的一者：

34、faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781和st8sia1；

35、grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、iffo1、hoxa9和hopx；

36、grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、cdo1、emx1、prkcb、sfmbt2、st8sia1、hoxa1、hoxb2、barx1、clec11a、arhgef4、iffo1、hoxa9、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、shisa9、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b；

37、cdo1、grin2d、shox2、osr2、qki、sim2、trh、capn2、sfmbt2、chst2、st8sia1、hoxa1、fer1l4、faim2、iffo1、emx1、znf671、prkcb、hoxb2、barx1、ppp2r5c和tspyl5；

38、znf671、grin2d、ndgr4、shox2、b3galt6；以及

39、faim2、chst2、znf671、grin2d、cdo1。

40、在某些实施方案中，提供了用于从生物样品制备脱氧核糖核酸(dna)级分的方法，所述dna级分可用于分析涉及一种或多种染色体畸变的一个或多个遗传基因座，所述方法包括：

41、(a)从生物样品中提取基因组dna；

42、(b)通过以下步骤来产生所提取的基因组dna的级分：

43、(i)处理所提取的基因组dna；

44、(ii)使用对以下甲基化标志物中的一个或多个具有特异性的单独引物来扩增经处理的基因组dna：faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781、st8sia1、iffo1、hoxa9、hopx、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b；

45、(c)通过测量一个或多个甲基化标志物中的每个的甲基化水平来分析所提取的基因组dna的产生级分中的一个或多个遗传基因座。

46、在一些实施方案中，处理所提取的基因组dna包括用以甲基化特异性方式修饰dna的试剂来处理所提取的基因组dna。在一些实施方案中，所述以甲基化特异性方式修饰dna的试剂是硼烷还原剂，例如所述硼烷还原剂可以是2-甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，所述试剂包括甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂中的一者或多者。在一些实施方案中，所述试剂是亚硫酸氢盐试剂，并且所述处理产生亚硫酸氢盐处理的dna。

47、在一些实施方案中，对一个或多个甲基化标志物具有特异性的引物的集合选自表2中列举的组。在一些实施方案中，对所选择的一个或多个甲基化标志物中的每个具有特异性的引物的集合能够结合由表2中列举的特异性甲基化标志物基因的引物序列结合的扩增子，所述由表2中列举的甲基化标志物基因的引物序列结合的扩增子是表1中列举的甲基化标志物的遗传区域的至少一部分。在一些实施方案中，对所选择的一个或多个甲基化标志物中的每个具有特异性的引物的集合是特异性结合包含表1中列举的特异性甲基化标志物的染色体坐标的遗传区域的至少一部分的引物的集合。

48、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括多重扩增。

49、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括使用一种或多种选自由以下各项组成的组的方法：甲基化特异性pcr、定量甲基化特异性pcr、甲基化特异性dna限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序、瓣核酸内切酶测定法、pcr-瓣测定法和亚硫酸氢盐基因组测序pcr。

50、在一些实施方案中，测量一个或多个甲基化标志物的甲基化水平包括测量所述一个或多个甲基化标志物的cpg位点的甲基化。在一些实施方案中，所述cpg位点存在于编码区或调控区中。

51、在一些实施方案中，所述一个或多个甲基化标志物由表1中所示的基因组坐标描述。

52、在一些实施方案中，所述生物样品是粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品。

53、在一些实施方案中，所述生物样品来自人类受试者。在一些实施方案中，所述人类受试者患有或疑似患有癌症。

54、在一些实施方案中，所述一个或多个甲基化标志物选自以下组中的一者：

55、faim2、cdo1、sim2、chst_7890、sfmbt2、ppp2r5c、arhgef4、tspyl5、znf671、b3galt6、fer1l4、hoxb2、barx1、tbx1、shox2、emx1、clec11a、hoxa1、grin2d、capn2、ndrg4、trh、prkcb、shisa9、znf781和st8sia1；

56、grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、iffo1、hoxa9和hopx；

57、grin2d、shox2、znf671、sim2、trh、capn2、chst2_7890、fer1l4、faim2、ppp2r5c、tspyl5、ndrg4、znf781、cdo1、emx1、prkcb、sfmbt2、st8sia1、hoxa1、hoxb2、barx1、clec11a、arhgef4、iffo1、hoxa9、osr2、qki、ryr2、gprin1、znf569、shisa9、cd1d、ntrk3、vav3和fam59b；

58、cdo1、grin2d、shox2、osr2、qki、sim2、trh、capn2、sfmbt2、chst2、st8sia1、hoxa1、fer1l4、faim2、iffo1、emx1、znf671、prkcb、hoxb2、barx1、ppp2r5c和tspyl5；

59、znf671、grin2d、ndgr4、shox2、b3galt6；以及

60、faim2、chst2、znf671、grin2d、cdo1。

61、在一些实施方案中，所分析的一个或多个遗传基因座中的每个与任何类型的癌症相关。在一些实施方案中，所分析的一个或多个遗传基因座中的每个与两种或更多种类型的癌症相关。在一些实施方案中，所分析的一个或多个遗传基因座中的每个与肝癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌和子宫癌中的一种或多种相关。

62、在某些实施方案中，所述技术涉及评估生物样品(例如，粪便样品、组织样品、器官分泌物样品、csf样品、唾液样品、血液样品、血浆样品或尿液样品)中本文所述的甲基化标志物中的一个或多个的存在和甲基化状态。这些甲基化标志物包含如本文所讨论，例如，如表1和图1中提供的一个或多个差异甲基化区域(dmr)。在所述技术的实施方案中评估甲基化状态。因此，本文提供的技术不限于测量基因的甲基化状态的方法，因此可以通过本领域已知的任何方法来测量基因的甲基化状态。

63、在一些实施方案中，多个不同的靶标区域包括参考靶标区域，并且在某些优选的实施方案中，参考靶标区域包括β-肌动蛋白和/或zdhhc1，和/或b3galt6。

64、本文还提供了用于实践本文所述的方法中的任一种的组合物和试剂盒。例如，在一些实施方案中，对一个或多个甲基化标志物和/或蛋白质标志物具有特异性的试剂(例如，引物、探针)单独或以集合提供(例如，用于扩增多个标志物的引物对的集合)。还可以提供用于进行检测测定法的其他试剂(例如，酶、缓冲液、用于进行quarts、pcr、测序的阳性和阴性对照、亚硫酸氢盐、十-十一易位(tet)酶(例如，人tet1、人tet2、人tet3、鼠tet1、鼠tet2、鼠tet3、耐格里原虫属(naegleria)tet(ngtet)、灰盖似鬼伞(coprinopsis cinerea)(cctet)或它们的变体)、硼烷还原剂或其他测定法)。在一些实施方案中，试剂盒含有能够以甲基化特异性方式修饰dna的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶、十-十一易位(tet)酶(例如，人tet1、人tet2、人tet3、鼠tet1、鼠tet2、鼠tet3、耐格里原虫属tet(ngtet)、灰盖似鬼伞(cctet)或它们的变体)、硼烷还原剂)，和/或能够检测本文所述的蛋白质标志物的表达或活性水平的试剂。在一些实施方案中，提供了含有进行方法所需的、足够的或有用的一种或多种试剂的试剂盒。还提供了含有试剂的反应混合物。还提供了含有多种试剂的预混试剂组，这些试剂可以相互添加和/或添加至测试样品中以完善反应混合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括对照核酸，所述对照核酸包含来自dmr 1-38(来自表1)的一个或多个序列并且具有与患有特定类型癌症的受试者相关的甲基化状态。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于从受试者获得样品(例如，粪便样品；组织样品；血浆样品、血清样品、全血样品)的样品收集器。在一些实施方案中，所述试剂盒包括如本文所述的寡核苷酸。

65、本文提供了用于检测从受试者获得的生物样品中的一个或多个甲基化标志物的存在和/或非整倍性的存在的方法和材料。在一些实施方案中，一个或甲基化标志物的存在和/或非整倍性的存在被同时测试(例如，在一个测试程序中，包括测试程序本身可以包括多个离散的系统测试方法的实施方案)。在一些实施方案中，一类或多类生物标志物的一个或多个甲基化标志物的存在和/或非整倍性的存在被顺序测试(例如，在两个或更多个不同时间点进行的两个或更多个不同的测试程序中，包括测试程序本身可以包括多个离散的系统测试方法的实施方案)。在针对一个或多个甲基化标志物的存在和/或非整倍性的存在的同时和顺序测试二者的一些实施方案中，测试可以对单个样品进行或者可以对两个或更多个不同的样品(例如，从同一受试者获得的两个或更多个不同的样品)进行。