用于治疗神经退行性疾病的基因治疗的制作方法

本发明涉及用于治疗神经退行性疾病的基因治疗。

背景技术：

1、神经退行性疾病是主要影响神经元的疾病。退行性过程可能涉及神经元结构的进行性丧失、神经元功能的进行性损失或进行性神经元细胞死亡。几种特定的障碍被归类为神经退行性疾病。

2、据报道，阿尔茨海默病约占所有痴呆症病例的60％，全球有2600多万人患有阿尔茨海默病。痴呆症通常涉及精神功能的进行性衰退，包括记忆、语言和认知过程的缺陷。阿尔茨海默病不仅会影响患者自己，还会影响数百万不得不照顾患者的护理人员，他们往往没有报酬。由于阿尔茨海默病的最大风险因素是年龄，随着年龄的增长，患病率急剧上升。

3、与阿尔茨海默病相关的典型病理包括脑宏观萎缩、大脑皮层灰质变薄、提示神经元丢失的心室增大、含有微小细胞外淀粉样斑块聚集成蛋白质团的β-淀粉样肽[aβ](包括聚集的tau蛋白，以及脑血管淀粉样蛋白(即血管周围淀粉样蛋白))、细胞外神经原纤维缠结。

4、特别是，阿尔茨海默病的病理特征是患者大脑中存在神经原纤维缠结(nft)和淀粉样蛋白沉积。老年斑块是聚集的淀粉样蛋白-β蛋白(aβ)作为主要成分的细胞外积聚，而nft是聚集形式的磷酸化tau作为主要成分在细胞内积聚。nft发生在神经元细胞体中，老年斑块在神经末梢周围形成，因此这两个聚集过程似乎独立发生。

5、几十年的研究致力于了解阿尔茨海默病中病理性aβ的加工和积累。基于这项研究开发抗aβ疗法的努力集中在抑制β-分泌酶和γ-分泌酶，通过免疫疗法分离神经元释放的肽，或防止aβ聚合。这些疗法并不是很成功，因为大多数测试这些方法的临床试验都产生了令人不满意的结果。最近对阿杜那单抗(aducanumab)免疫疗法emerge试验的重新分析为以aβ靶向为目标在临床上可行的想法带来了新的希望。最佳ad治疗不太可能仅针对aβ，但其可能会成为未来针对疾病阶段的联合治疗的一部分。然而，抗体治疗可能是第一种进入临床的降低aβ的策略，但由于副作用和重复静脉施用的需要，在广泛使用方面可能存在问题。

6、此外，最近已经做出了巨大的努力来开发能够防止淀粉样蛋白和有毒低聚物形成的小肽。肽提供了与高特异性和低毒性相关的高生物活性，但尽管有这些优点，肽药物的疗效可能因其在体内的短半衰期而受到严重阻碍，并可能导致问题，特别是在施用和递送到脑方面。

7、因此，鉴于上述情况，需要用于促进神经元再生或存活、治疗、预防或减轻神经退行性疾病的改进的基因治疗。

8、【相关技术文件】

9、【专利文件】

10、(专利文献0001)韩国专利公开号10-2020-0075865

11、(专利文献0002)韩国专利公开号10-2019-0127266

技术实现思路

1、【技术问题】

2、本发明人开发了一种新的基于表达载体的基因疗法，其能够从细胞中分泌aβ变体并将tau抑制剂肽连续供应到细胞中，以克服相关技术对血脑屏障渗透和体内半衰期的限制。

3、因此，本发明涉及一种遗传构建体、重组表达载体及其用途，其能够同时表达减缓或阻碍wt-aβ或wt-tau聚合并降低人体毒性的aβ变体和tau抑制剂肽。

4、【技术方案】

5、本发明人构建了一种编码aβ肽变体和tau抑制剂肽的新型遗传构建体。

6、因此，本发明提供了编码aβ肽变体的第一编码序列；编码tau抑制剂肽的第二编码序列；以及与其可操作连接的启动子。

7、本发明人已经证实，编码aβ肽变体和tau抑制剂肽的基因能够组合成单个遗传构建体。使用本发明的上述构建体，可以通过少量施用(单次或多次施用)实现神经退行性疾病的基因治疗，而不需要直接注射重组蛋白。特别地，aβ肽变体和tau抑制剂肽的组合可以干扰或抑制wtaβ和wttau聚合，并可以实现由现有聚集的aβ斑块或tau引起的神经原纤维缠结(nft)的分解，从而表现出优异的疾病改善和治疗效果。

8、优选地，根据本发明的aβ肽变体可以是基于淀粉样前体蛋白序列的变体。淀粉样前体蛋白序列已知有三种亚型，app 695aa、751aa和770aa。在淀粉样蛋白的亚型中，695aa亚型主要在神经中表达。基于碱基序列的变体包括在本发明的范围内。

9、根据本发明的aβ肽变体可包含选自基于淀粉样前体蛋白序列(seq id no:1，基于app770aa(核酸序列：seq id no:2))的v689p、f690d、f691p、a692d和l705p的至少任意一种突变。换言之，编码aβ肽变体的第一编码序列可以是编码包括选自上述v689p、f690d、f691p、a692d和l705p的任意一种或多种突变的肽序列的序列。

10、这些编码序列的示例性序列分别在seq id no:3至seq id no:6中具体描述。seqid no:3至seq id no:6被设计为分别包括f690d/l705p、f691p、v689p/a692d和v689p/f690d/a692d突变，并且对应于任意变体的实例，并且内容不限于这些变体。换言之，含有选自v689p、f690d、f691p、a692d和l705p中的任意一种或多种突变及其编码序列的那些包括在本发明的范围内。

11、根据本发明的变体，在同样保持“生物活性”的程度下，还可以进一步包括其附加变体。

12、因此，本发明可以在seq id no:3至seq id no:6的任意一个序列中包含附加突变。具体地，可以使用与每个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。这些序列旨在包括本发明范围内的序列，其中由编码序列产生的上述aβ肽变体的生物活性保持在同等水平。

13、更具体地，可以在seq id no:3至seq id no:6的序列中进行或设计序列修饰，以包括aβ肽的689至692位的附加突变。这些序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性，并且可以在本发明的范围内包括其中所产生的aβ42肽变体的生物活性保持在同等水平的序列。

14、由seq id no:3至seq id no:6编码的肽序列的示例分别显示在seq id no:7至seq id no:10中。如果需要，本发明也可以包括与seq id no:7至seq id no:10具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同源性同时包括上述突变的序列。

15、aβ肽变体可能通过与wtaβ单体的相互作用诱导干扰aβ聚合的空间变化。换言之，aβ聚合可能由aβ的中心疏水簇形成，并且含有上述突变序列的aβ肽变体与wtaβ相互作用，以抑制聚集并降低毒性。也就是说，聚集抑制作用能够减少淀粉样蛋白的形成和aβ介导的神经毒性。这些aβ肽变体本身不会引起聚集或毒性，但当与wtaβ肽一起存在时，肽变体可能通过抑制wt aβ聚合或分解沉积的aβ而表现出疾病的治疗效果。

16、aβ肽是淀粉样前体蛋白(app)过度加工的结果，app是存在于神经元和其他细胞中的一种亲本跨膜蛋白。淀粉样斑块主要由40和42个氨基酸肽(分别称为aβ40和aβ42)组成，这些肽通过天冬氨酸蛋白酶(一种β分泌酶)催化的蛋白顺序水解和随后的早老素依赖性γ-分泌酶切割从淀粉样前体蛋白(app)衍生而来。aβ42肽比aβ40肽更疏水、更难溶解，是淀粉样斑块中的主要物种。

17、特别是，aβ42有强烈的聚集和沉积趋势，这往往会导致更多的细胞毒性和突触损失。因此，本发明的目的是提供一种aβ42肽变体。

18、aβ42肽的聚集和沉积对神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病有很大影响。

19、因此，在本发明中，aβ42肽变体可基于极大影响上述肽的聚集和沉积的aβ42序列(seq id no:11(核酸序列：seq id no:12))包含选自v18p、f19d、f20p、a21d和l34p中的任意一种或多种突变。换言之，编码aβ肽变体的第一编码序列可以是编码包括选自上述v18p、f19d、f20p、a21d和l34p的任意一种或多种突变的肽序列的序列。

20、这些编码序列的示例性序列分别在seq id no:13至seq id no:16中具体描述。seq id no:13至seq id no:16被设计为分别包括f19d/l34p、f20p、v18p/a21d和v18p/f19d/a21d突变，并且对应于任意变体的示例，并且内容不限于这些变体。也就是说，含有选自v18p、f19d、f20p、a21d和l34p的任意一种或多种突变及其编码序列的那些包含在本发明的范围内。

21、根据本发明的变体在同样保持“生物活性”的程度下，可以进一步包括其附加突变。

22、本发明可在seq id no:13至seq id no:16中任一项的序列中包含额外的突变。具体地，可以使用与每个序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。这些序列旨在包括本发明范围内的序列，其中由编码序列产生的上述aβ42肽变体的生物活性保持在同等水平。

23、更具体地，可以在seq id no:13至seq id no:16的序列中进行或设计序列修饰，以包括aβ42肽的第18至21位的附加突变。这些序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性，并且可以在本发明的范围内包括其中所产生的aβ42肽变体的生物活性保持在同等水平的序列。

24、根据本发明的具体实施方案，aβ42肽变体可以是选自以下序列的任意一种或多种，但不限于此：

25、aβ(f19d/l34p)：daefrhdsgyevhhqklvdfaedvgsnkgaiigpmvggvvia(seq id no:17)

26、aβ(f20p)：daefrhdsgyevhhqklvfpaedvgsnkgaiiglmvggvvia(seq id no:18)

27、aβ(v18p/a21d)：daefrhdsgyevhhqklpffdedvgsnkgaiiglmvggvvia(seq id no:19)

28、aβ(v18p/f19d/a21d)：daefrhdsgyevhhqklpdfdedvgsnkgaiiglmvggvvia(seq idno:20)

29、如上所述，本发明包括v18p、f19d、f20p、a21d或l34p的所有每种突变、两种组合突变、三种组合突变、四种组合突变以及五种组合突变。如果需要，与seq id no:17至seq idno:20具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同源性同时包括上述突变的序列也可以包括在本发明的范围内。

30、优选地，根据本发明的tau抑制剂肽可以是选自下表1的任意一种或多种。

31、[表1]

32、

33、

34、换言之，编码tau抑制剂肽的第二编码序列是编码seq id no:21至seq id no:33中所述的肽序列的序列。

35、编码seq id no:21至seq id no:33的序列分别显示在下面的seq id no:34至seqid no:46中。

36、[表2]

37、

38、

39、如上所述，根据本发明编码tau抑制剂肽的第二编码序列的示例在seq id no:34至seq id no:46中具体描述，但是能够编码上述抑制剂序列的任何序列都可以包括在本发明的范围内。

40、因此，根据本发明的tau抑制剂肽可以抑制tau聚集，从而抑制nft相关的发病机制，从而表现出优异的疾病改善和治疗效果。tau聚集成淀粉样纤维，众所周知，阿尔茨海默病的认知能力下降与大脑中tau聚集的出现密切相关。这种聚集抑制包括聚集开始的所有延迟、聚集量的减少等。

41、在本发明中，编码aβ肽变体的第一编码序列；并且编码tau抑制剂肽的第二编码序列可以彼此直接连接，或者可以在其之间具有间隔区，以提供aβ肽变体和tau抑制剂肽的融合蛋白。此外，第一个编码序列编码aβ肽变体；并且编码tau抑制剂肽的第二编码序列可以与编码γ分泌酶切割的序列连接。γ分泌酶切割的示例性序列如seq id no:47所示，并且编码该序列的序列如seq id no:48所示。通过γ分泌酶切割序列，aβ肽变体可能在细胞外空间表达，而tau抑制剂肽可能在细胞溶质(cyosol)中表达。

42、此外，关于编码aβ肽变体的第一编码序列；和编码tau抑制剂肽的第二编码序列，aβ肽变体可以首先被编码或编码tau抑制肽的第二编码序列可以首先在遗传构建体内被编码。换言之，本领域技术人员可以由根据矢量设计适当地改变它们之间的时序关系。

43、在本发明中，aβ肽变体和/或aβ42肽变体可在序列末端进一步包含tvivitlvmlkk序列(seq id no:49)(在以下实施例中由缩写kk表示)。这些序列允许aβ变体通过膜上的γ-分泌酶分泌到细胞外空间。根据本发明的遗传构建体可以进一步包含编码seq id no:49的序列，例如seq id no:50，并且可以位于编码变体的序列的相邻位置。

44、根据本发明的遗传构建体旨在用于在神经中表达和/或施用。具体地，本发明旨在在脑(包括神经组织)中表达的细胞中表达，更具体地，在神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞等中表达。

45、如本文所用，术语“可操作连接”是指核苷酸表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)与另一核苷酸之间的功能性连接。控制序列可以控制另一核酸序列的转录和/或翻译。

46、根据本发明的遗传构建体可以在一个或多个启动子的控制下表达aβ肽变体和tau抑制剂肽。这里，启动子可以(i)包括引入以分别诱导两个基因表达的双启动子；(ii)使用脑心肌炎病毒(emcv)的内部核糖体进入位点(ires)连接从重组病毒载体中的单个启动子转录的两个基因；或(iii)通过融合两个基因，以用一个启动子进行完整表达为目的。另一方面，ires依赖性翻译的效率在不同的细胞和组织中可能不同。

47、在本发明中，启动子序列可以包括通常用于载体表达的启动子序列、具体已知用于神经元的启动子序列(称为神经元特异性启动子序列)、用于过表达目的的启动子序列等。例如，可以使用作为常见启动子序列的巨细胞病毒(cmv)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、hsv-tk启动子、rsv启动子、ef1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类il-2基因启动子、人类淋巴毒素基因启动子、人类gm-csf基因启动子等。

48、此外，神经元特异性启动子的示例可包括人类突触蛋白酶i(hsyn)启动子(例如，seq id no:51)、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子(例如，seq id no:52)、大鼠微管蛋白αi(tuba1a)启动子(例如，seq id no:53)、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子(例如，seq id no:54)和人血小板衍生的生长因子β链(pdgf)启动子(例如，seq id no:55)等，并且过表达启动子的示例可以包括ef-1α启动子(如，seq id no:56)、cag启动子(例，seq id no:57)、cmv启动子(如seq id no:58)等。优选地，启动子可以是cag、camkii或人类突触蛋白酶i(hsyn)。

49、此外，在一个实施方案中，遗传构建体包括位于第一和第二编码序列之间的间隔序列，其中间隔序列编码肽间隔区，所述肽间隔区被配置为被切割以产生作为单独分子的aβ肽变体和tau抑制剂肽。优选地，间隔序列包含并编码病毒肽间隔序列，更优选病毒2a肽间隔序列。间隔序列的示例包括t2a、p2a、e2a、f2a等。例如，根据本发明的序列可以是选自seqid no:59至seq id no:62的任意一种。编码间隔序列的序列可以是选自seq id no:63至seq id no:66中的任意一个。

50、此外，根据本发明的遗传构建体可以包含一个或多个合适的转录起始、终止、增强子序列、有效的rna处理信号，例如稳定细胞质mrna的剪接和多聚腺苷酸化(polya)信号，例如kozak序列；增强翻译效率的序列或wpre；增强mrna稳定性的序列；以及，如果需要，增强编码产物分泌的序列等。

51、例如，根据本发明的遗传构建体还可以包括增强子。增强子包括病毒增强子，包括但不限于cmv增强子、wpre增强子、hpre增强子、cte增强子或其衍生物或混合物。

52、此外，根据本发明的遗传构建体可以包括kozak序列。

53、包装信号可以是5’反向末端重复(itr)和3’itr。例如，遗传构建体包含用于aav载体的aav itr序列。在一个实施方案中，itr衍生自与提供衣壳的aav不同的aav。在优选实施方案中，itr序列衍生自可用于方便和加速监管审批的aav2或其缺失版本(itr)。但是，也可以选择来自其他aav来源的itr。当itr的来源来自aav2并且aav衣壳来自另一个aav来源时，得到的载体可以称为假型。通常，aav载体基因组包含aav 5’itr、根据本发明的任何编码序列和任何调控序列以及aav 3’itr。然而，元件的其他配置也可能是合适的。本发明已经描述了5’itr的缩短版本，称为itr，其中删除了d序列和末端解链位点(terminal-resolutionsite，trs)。在另一个实施方案中，使用全长aav 5’和3’itr。

54、在一些实施方案中，调控序列包括聚腺苷酸化(polya)信号。在一些实施方案中，polya信号是牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh polya)信号、小polya(spa)信号、人生长激素多腺苷酸化(hgh polya)信号、sv40 polya信号、sv40晚期polya信号或其衍生物或混合物。

55、根据本发明的遗传构建体可以进一步包括编码信号肽的序列。信号肽可以是促进适当折叠或产生的任何信号肽，或者可以是帮助其移动到细胞膜的信号序列。在优选实施方案中，信号肽可以是本文公开的任何信号肽。具体地，信号肽可以是选自淀粉样前体蛋白(app)、人血清白蛋白、白细胞介素-2、cd5、免疫球蛋白κ轻链、高斯(gaussia)萤光素酶、胰蛋白酶原和催乳素的任意一种。

56、其发挥了作用，使得编码具有这种信号序列的aβ肽变体的序列或编码aβ肽和tau抑制剂肽的融合肽的序列能够在内质网中良好表达。

57、根据本发明的遗传构建体可以被修饰到维持构建体的同一性的程度。也就是说，术语“相同”或百分比“同一性”，指使用如下所述的默认参数使用blast和blast 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测得的(例如，参见ncbi网站等)，在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，在特定区域(例如，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，本文提供的任何修改的orf)上相同或具有特定百分比相同(即，优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列。换言之，在维持所需aβ肽变体和tau抑制剂肽的功能作用的范围内对遗传构建体的修饰包括在本发明的范围内。

58、本发明提供了一种包含遗传构建体的重组表达载体。本文所述的遗传构建体和表达载体可用于治疗和改善神经退行性疾病。

59、重组表达载体是质粒、病毒载体或指本领域已知的其他载体，编码遗传构建体的核酸能够插入其中并且核酸能够在宿主细胞中表达。优选地，所述重组表达载体可以是病毒载体。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体等。特别地，优选使用慢病毒或腺相关病毒(aav)的方法。

60、腺相关病毒(aav)病毒载体是具有aav蛋白衣壳的aav dna酶抗性颗粒，其中包装核酸序列以递送到靶细胞。aav衣壳由60个衣壳(帽)蛋白亚基vp1、vp2和vp3组成，这些亚基以二十面体对称性排列，根据所选aav的不同，其比例约为1∶1∶10至1∶1：20。aav衣壳可以选自本领域已知的衣壳，包括变体。

61、重组aav(raav)可以是天然存在的载体或具有杂交aav血清型的载体。

62、载体“raav”是指由至少一种aav衣壳蛋白和包含异源多核苷酸(即，不是野生型aav基因组的多核苷酸，例如要递送到哺乳动物细胞的转基因)的包壳多核苷酸raav载体组成的病毒颗粒。raav颗粒可以具有任何aav血清型，包括任何修饰、衍生物或假型(例如，aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10或其衍生物/变体/假型)。aav血清型和衍生物/变体/假型以及生产这些血清型/衍生物/变体/假型的方法是本领域已知的(参见例如[asokan等人,mol.ther.20(4):699-708(2012)])。在一些实施方案中，raav颗粒包含选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15和aav.hsc16的aav衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16衣壳蛋白的变体或假型。

63、本公开的raav颗粒可以具有任何血清型或血清型的任何组合(例如，包含两种或多种血清型的raav颗粒群，例如，包含raav2、raav8和raav9颗粒中的两种或更多种)。在一些实施方案中，raav颗粒是raav1、raav2、raav3、raav4、raav5、raav6、raav7、raav8、raav9、raav10或另一种raav颗粒或其两种或多种的组合。在一些实施方案中，raav颗粒是raav8或raav9颗粒。在一些实施方案中，raav颗粒包含选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15 and aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15和aav.hsc16的两种或多种血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、andaav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15和aav.hsc16衣壳蛋白的两种或多种血清型的衍生物。

64、在一些实施方案中，raav颗粒具有选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16的血清型的aav衣壳蛋白，或其衍生物、突变或假型。在一些实施方案中，raav颗粒具有aav8、aav9血清型的aav衣壳蛋白，或其衍生物、突变或假型。在一些实施方案中，raav颗粒具有选自aav7、aav8、aav9、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.php.b、aav.php.eb和aav.7m8的血清型的aav衣壳蛋白。

65、优选地，raav是选自aav2、aav7、aav8、aav9、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.php.b、aav.php.eb和aav.7m8中的任意一种。

66、根据一个实施方案，本发明的aav载体能够穿过血脑屏障(bbb)。根据本发明的aav可用于有效且广泛地转导cns中的神经元。

67、腺相关病毒(aav)适合于本发明的基因递送系统，因为它具有转导非分裂细胞和转导各种类型细胞的能力。aav载体的生产和使用的详细描述详细公开在美国专利no.5,139,941和no.4,797,368中。

68、有利地，重组aav2在宿主生物体中引起最小的免疫反应，并介导能够在载体施用后持续至少一年的长期转基因表达。

69、如本文所用，术语“重组aav(raav)载体”是指含有至少一个末端重复序列的重组aav衍生核酸。

70、含有上述遗传构建体的上述载体的优选实施方案如图3至图8所示。

71、具体地，根据图3，可以构建载体，使得每个aβ42变体和tau抑制剂肽都能够通过两个启动子表达。

72、此外，根据图4，可以构建载体，使得aβ42变体和tau抑制剂肽能够通过一个启动子融合和表达。

73、此外，根据图5，可以构建载体，使得每个aβ42变体和tau抑制剂肽都能够使用ires通过一个启动子表达。

74、此外，根据图6，可以构建载体，使得每个整个app变体或tau抑制剂肽都能够通过两个启动子表达。

75、此外，根据图7，可以构建载体，使得整个app变体和tau抑制剂肽能够通过一个启动子融合和表达。

76、此外，根据图8，可以构建载体，使得整个app变体和tau抑制剂肽中的每一个都能够使用ires通过一个启动子表达。

77、本发明提供了一种肽，其包含基于淀粉样前体蛋白的选自v689p、f690d、f691p、a692d和l705p中的至少一种突变。

78、本发明还提供了编码该肽的多核苷酸。

79、本发明提供了一种肽，其包含基于aβ42的选自v18p、f19d、f20p、a21d和l34p的任意一种或多种突变。

80、本发明还提供了编码该肽的多核苷酸。

81、根据本发明的aβ变体，特别是淀粉样前体蛋白变体和aβ42变体的肽序列，以及如上所述编码肽序列的多核苷酸序列。

82、本发明提供一种融合多肽，所述融合多肽包含基于淀粉样前体蛋白的含有选自v689p、f690d、f691p、a692d和l705p中的至少一种突变的肽；以及与其连接的γ分泌酶切割肽；和选自与其连接的seq id no:21至seq id no:33中的任意一种tau抑制剂肽。

83、更具体地，提供了一种融合多肽，其包含：选自seq id no:7至seq id no:10的任意一种淀粉样前体蛋白变体肽；与其连接的seq id no:47的γ分泌酶切割肽；和选自与其连接的seq id no:21至seq id no:33中的任意一种tau抑制剂肽。

84、更具体地，提供了一种融合多肽，其包含：seq id no:10；与其连接的seq id no:47的γ分泌酶切割肽；以及与其连接的seq id no:21、seq id no:22或seq id no:33。这些序列如seq id no:67至seq id no:69所示。

85、本发明提供了一种融合多肽，其包含：基于aβ42的含有选自v18p、f19d、f20p、a21d和l34p的至少一种突变的肽；与其连接的γ分泌酶切割肽；和选自与其连接的seq id no:21至seq id no:33中的任意一种tau抑制剂肽。

86、更具体地，提供了一种融合多肽，其包含：选自seq id no:17至seq id no:20的任意一种aβ42变体肽；与其连接的seq id no:47的γ分泌酶切割肽；和选自与其连接的seqid no:21至seq id no:33中的任意一种tau抑制剂肽。

87、更具体地，提供了一种融合多肽，其包含：seq id no:20；与其连接的seq id no:47的γ分泌酶切割肽；以及与其连接的seq id no:21、seq id no:22或seq id no:33。这些序列如seq id no:70至seq id no:72所示。

88、本发明还提供了编码融合肽的多核苷酸。

89、根据本发明的aβ变体，特别是淀粉样前体蛋白变体和aβ42变体的肽序列，以及如上所述编码肽序列的多核苷酸序列。

90、该肽序列通过减缓或阻碍wt-aβ聚合和降低毒性，对神经退行性疾病表现出优异的预防、改善和治疗作用。

91、本发明提供了一种药物组合物，其包含遗传构建体或重组表达载体和药学上可接受的载体。

92、本发明提供了一种用于预防或治疗神经退行性疾病的药物组合物，其包含所述遗传构建体和/或所述重组表达载体。

93、在本发明中，神经退行性疾病是选自亚历山大病、阿尔珀斯病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(als)、共济失调毛细血管扩张症、神经元蜡样脂褐质沉积症、少年型神经元蜡样质脂褐质沉积病(batten disease)、牛海绵状脑病(bse)、中枢神经海绵样变性、脑瘫、科凯恩(cockayne)综合征、克雅氏病、额颞叶变性、戈谢病、亨廷顿舞蹈症、hiv相关性痴呆、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、溶酶体贮积症、神经疏螺旋体病、马查多-约瑟夫病、运动神经元疾病、多系统萎缩症、多发性硬化症、多发硫酸酯酶缺乏症、血脂粘稠、嗜睡症、c型尼曼-匹克病、尼曼-匹克病、帕金森病、佩梅病、匹克氏病、庞贝病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、进行性核上麻痹、植烷酸贮积症、桑德霍夫病、希尔德病、恶性贫血继发的亚急性脊髓联合变性、少年型家族性黑朦性痴呆(spielmeyer-vogt-sjogren-batten disease)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、进行性核上性麻痹、脊髓梅毒和泰赛二氏病(tay-sachsdisease)。

94、在优选实施方案中，所述神经退行性疾病是选自阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、帕金森病和运动神经元疾病中的至少一种。更优选地，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

95、因此，本发明提供了一种治疗、预防或减轻受试者神经退行性疾病，或促进受试者的神经再生和/或存活的方法。该方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效治疗量的遗传构建体或重组表达载体。

96、应当理解，所述遗传构建体或重组表达载体能够用于药物中，所述药物可用作单一疗法以治疗、减轻或预防神经退行性疾病，或促进神经再生和/或存活。或者，根据本发明的遗传构建体或重组表达载体可以与已知疗法一起或与已知疗法组合使用，以治疗、减轻或预防神经退行性疾病，或促进神经再生和/或存活。

97、此外，本发明提供了用于治疗神经退行性疾病的遗传构建体或重组表达载体。

98、此外，本发明提供了遗传构建体或重组表达载体在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

99、根据本发明的遗传构建体或重组表达载体可以组合成具有几种不同形式的组合物，特别是取决于组合物的使用方式。因此，例如，所述组合物可以是散剂、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液或能够施用于需要治疗的人或动物的任何其他合适形式。应当理解的是，本发明药物的载体应当被非常熟悉地使用于施用对象。

100、在一个优选的实施方案中，根据本发明的药物可以通过注射到血流、神经或直接注射到需要治疗的部位来施用于受试者。例如，药物被配置为穿过血脑屏障。注射可以是静脉注射(推注或输注)或皮下注射(推注或输注)或皮内注射(推注或输注)。

101、应该理解的是，所需的遗传构建体或重组表达载体的量由其生物活性和生物利用度决定，而生物利用度又取决于施用方式、遗传构建体和重组表达载体物理化学性质，以及所述遗传构建体或重组表达载体是否被用作单一疗法或组合疗法。施用频率也将受到正在接受治疗的受试者中循环多肽的半衰期的影响。施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且将随着所使用的特定遗传构建体或重组表达载体、药物组合物的强度、施用方式以及病症的进展或阶段而变化。根据接受治疗的特定受试者，包括受试者的年龄、体重、性别、饮食和施用时间在内的其他因素可能需要调整剂量。

102、通常，根据所使用的遗传构建体或重组表达载体，根据本发明的构建体或载体的0.001μg/kg体重至10mg/kg体重或0.01μg/kg体重至1mg/kg体重的日剂量可用于治疗、减轻或预防神经退行性疾病。

103、遗传构建体或重组表达载体可以在疾病和/或病症发作之前、期间或之后施用。

104、已知的方法，例如制药工业中常用的那些方法(例如体内实验、临床试验等)可用于确定根据本发明的遗传构建体或重组表达载体的特定制剂和精确治疗方案(例如，制剂的日剂量和施用频率)。

105、在本发明中，“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，本发明的组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或者可用于其他兽医应用。然而，最优选地，受试者是人类。

106、当施用受试者时，遗传构建体、重组表达载体或药物组合物的“治疗有效量”是治疗神经退行性疾病或产生所需效果(如促进神经再生和/或存活)所需的上述量的任何量。

107、例如，所使用的遗传构建体、重组表达载体或药物组合物的治疗有效量可为约0.01mg至约800mg，优选为约0.01mg至约500mg。优选为约0.1mg至约250mg。

108、如本文所述，术语“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知的可用于药物组合物制剂的任何已知化合物或已知化合物的组合。

109、药物载体可以是液体，并且药物组合物是溶液的形式。液体载体用于制备溶液、混悬剂、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的遗传构建体或重组表达载体可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体中，所述液体载体例如水、有机溶剂、二者的混合物或药学上可接收的油或脂肪。液体载体可以含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和非肠道施用的液体载体的合适示例包括水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物，以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于非肠道施用，载体也可以是油性酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于非肠道施用的无菌液体形式组合物。加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。

110、无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可用于例如脑干、肌内、硬膜内、硬膜外、鞘内、腹膜内、静脉内和皮下注射。遗传构建体或重组表达载体可以制备为无菌固体组合物，其能够通过使用无菌水、盐水或其他合适的无菌注射介质溶解或悬浮用于施用。

111、本发明的遗传构建体、重组表达载体和药物组合物可以以无菌溶液或悬浮液的形式口服施用，所述无菌溶液或悬液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的生理盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等。本发明的遗传构建体、重组表达载体或药物组合物也可以以液体或固体组合物的形式口服施用。适合口服施用的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂和散剂以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂和混悬剂。用于肠外施用的形式包括无菌溶液、乳剂和混悬剂。

112、本文所述的所有特征(包括所有附加权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合与上述任何方面相结合，但这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。

113、【有益效果】

114、根据本发明，可以从细胞中分泌aβ变体，并在细胞中连续供应tau抑制剂肽，以减缓或抑制wt-aβ聚合和wt-tau聚合，并降低人体内的细胞毒性，从而显示出预防、减轻和治疗神经退行性疾病的优异效果。