用于大规模并行RNA功能扰动分析的测定的制作方法

本发明涉及筛选方法，该筛选方法涉及包含rna构建体的细胞的套组(panel)，并且特别地但不排他地，涉及这些细胞套组在基于细胞的筛选平台中的用途。

背景技术：

1、众所周知，rna是一种有吸引力的靶标药物发现和开发，既可以用于使所谓的“无成药性”蛋白质成药，也可以作为调控非编码基因组的机制。然而，用小分子调节rna的能力尚未以系统性方式实现。

2、先前的研究表明，rna在细胞环境内形成二级和三级结构。这些rna结构基序对于多种生物功能(诸如基因表达的调控、rna剪接和翻译)至关重要。这些在细胞内的功能是与其他细胞成分发生功能性相互作用的结果，诸如rna-蛋白质相互作用(rna与rna结合蛋白相互作用)和rna-dna相互作用(rna与dna结合)等。

3、存在许多针对rna结构筛选小分子的生化测定(例如微阵列、asms、alphascreen)，这些测定允许实现逐个靶标的筛选方法。尽管这些方法允许针对rna靶标筛选大型化学文库，但缺乏细胞环境仍然是一个挑战，因为这些方法没有考虑原生细胞-rna功能和结构。

4、还开发了以逐个靶标的方式筛选与细胞环境内的rna结构结合的小分子的细胞系统。尽管原生rna结构在细胞环境内得以维持，但使用此方法对多个靶标进行高通量筛选非常费力，并且需要构建多个化学文库。

5、现有方法需要鉴定单一靶标，并且无法研究大量分子对大量rna结构的影响。到目前为止，研究化学或遗传扰动对在细胞环境内调节rna的效果的能力尚未以系统性方式实现。

技术实现思路

1、发明人已经使用计算机方法鉴定了基因组中的大量rna二级结构。例如，鉴定了约4,000个g-四链体结构。本发明首先能够实现这些结构在它们的内源基因组环境内(诸如在utr内)的功能性质，并且能够探测和阐明该功能，例如，在细胞内。这种形式的筛选开辟了新的生物学研究领域，因为其允许在原生生物环境内大规模地研究化学或遗传扰动对rna结构的影响。其次，本发明提供了手段——例如通过使用含有包括这些二级结构的功能构建体的细胞文库——来筛选可以与这些新鉴定的结构相互作用的候选药剂(例如治疗剂、小分子、进一步的rna分子)。这可以被称为“多重rna结构小分子筛选”。例如，小分子特异性地且选择性地结合rna结构基序并破坏细胞内的生物功能的能力使得靶向新颖生物学成为可能，这在以前是通过经典药物发现所靶向的。

2、因此，在第一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含i.)编码第一报告基因的第一序列；和ii.)编码第二报告基因并包含查询序列的第二序列，其中该查询序列可操作地连接至该第二报告基因，并且其中该查询序列编码或者是：折叠成二级结构的rna和/或基因转录本的rna调控元件，其中所述二级结构和/或转录本不是该第二报告基因的转录本的一部分。该核酸构建体还包含能够驱动第一和第二序列的表达的一个或多个启动子。

3、在一些实施例中，该第二序列包含对于该查询序列而言独特的条形码序列。

4、该一个或多个启动子(iii)可以包含能够驱动第一序列的表达的第一启动子；和能够驱动第二序列的表达的第二启动子(其中第一和第二启动子可以彼此独立地操作)。在其他实施例中，该核酸构建体包含能够驱动第一和第二序列的表达的单一启动子。单一启动子可以是双向启动子或单向启动子。

5、在优选的实施例中，查询序列编码或者是作为非翻译区(utr)的rna调控元件。utr来自异源基因(即，并非是第二报告基因的基因的utr)。在一些实施例中，utr是异源基因的5'utr。在其他实施例中，utr是异源基因的3'utr。查询序列中的utr可以相对于原生基因的utr序列发生突变。例如，查询序列中的utr可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个单核苷酸缺失、取代和/或插入。

6、utr可以包含一个或多个rna二级结构，例如g-四链体(g4)、三重螺旋、假结、茎环和/或多路连接点。utr可以含有内部核糖体进入位点(ires)。

7、在一些实施例中，查询序列编码或者是作为内含子的rna调控元件。

8、在一些实施例中，查询序列编码或者是作为内部核糖体进入位点(ires)的rna调控元件。

9、内含子或ires可以包含一个或多个rna二级结构，例如g-四链体(g4)、三重螺旋、假结、茎环和/或多路连接点。

10、在一些实施例中，该核酸构建体包含双顺反子报告系统，其中第一和第二报告基因被布置为ires位于其间。

11、在一些实施例中，查询序列编码或者是包含g-四链体(g4)的二级结构。在一些实施例中，查询序列编码或者是包含三重螺旋的二级结构。在一些实施例中，查询序列编码或者是包含假结的二级结构。在一些实施例中，查询序列编码或者是包含茎环的二级结构。在一些实施例中，查询序列编码或者是包含多路连接点的二级结构。

12、查询序列可以编码或包含野生型rna，该野生型rna包含折叠成二级结构的部分。替代性地，查询序列可以编码或包含突变体rna，其中该突变体rna包含相对于包含折叠成二级结构的部分的rna的野生型序列的一个或多个突变。这些二级结构可以包含g-四链体(g4)、三重螺旋、假结、茎环和/或多路连接点。在一些实施例中，相对于野生型序列的突变已知是或疑似是与生物疾病状态相关的突变。

13、在一些实施例中，查询序列编码或者是包含折叠成来自目标生物体所表达的一类编码或非编码rna序列的二级结构的rna的二级结构，其中该类非编码rna序列选自mrna、lncrna、mirorna或cirrna的内含子或utr。

14、在一些实施例中，查询序列编码或包含选自由g4、假结、茎环、三重螺旋和多路连接点组成的列表的两个或更多个二级结构，或功能单元诸如utr或ires。两个或更多个二级结构可以形成功能单元，诸如utr或ires。

15、茎环是一种rna结构，其包含rna的同一单链的两个区域之间的碱基配对，其末端为未配对的环。茎环也被称为发夹或发夹环，特别是当未配对的环较短时。

16、在一些实施例中，两个或更多个二级结构形成功能单元，诸如utr。例如，utr可以包含ires和另一个二级结构。

17、在一些实施例中，第一和/或第二报告基因表达荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、橙色荧光蛋白(ofp)和/或蓝色荧光蛋白(bfp)。其他合适的报告基因包括荧光素酶。在一些实施例中，第一报告基因和第二报告基因中的一者是绿色荧光蛋白(gfp)。gfp可以是不稳定的gfp。类似地，rfp、yfp、ofp和/或bfp可能是不稳定的。

18、在本文的一些实施例中，第二报告基因可以被称为“第一结构域”并且查询序列可以被称为“第二结构域”。

19、本发明还提供了一种载体，其包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体。载体可以包含dna或rna。载体可以是病毒或非病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。还提供了这些载体的文库。

20、在一些实施例中，载体可以包含选择性标记，诸如抗性基因。此类选择性标记可有助于载体的克隆和选择和/或含有载体的细胞的选择。选择标记可以是嘌呤霉素、潮霉素、新霉素或杀稻瘟菌素。

21、本发明还提供了一种细胞文库，其包含多种细胞群体，这些细胞群体各自包含一个或多个包含根据本发明第一方面所述的核酸构建体的细胞，其中一种单一群体的细胞的每个核酸构建体彼此相同，但其中不同群体的细胞的每个核酸构建体彼此不同。在一些方面，该细胞文库包含多种细胞群体，这些细胞群体各自包含一个或多个包含rna构建体的细胞，其中一种单一群体的细胞的每个rna构建体彼此相同，但其中不同群体的细胞的rna构建体彼此不同；其中每个rna构建体包含：第一结构域，该第一结构域包含能够表达报告基因的表达盒；和第二结构域，在该第二结构域中，rna折叠成二级结构或结构的组合和/或包含并非是报告基因转录本的基因转录本的rna调控元件。

22、在第二方面，本发明提供了一种rna构建体文库，其中每个rna构建体包含：第一结构域，该第一结构域包含能够表达报告基因的表达盒；和第二结构域，在该第二结构域中，rna折叠成二级结构和/或包含并非是报告基因转录本的基因转录本的rna调控元件。

23、在第三方面，本发明提供了一种载体文库，其包含或编码根据本发明第二方面所述的rna构建体文库。载体可以是病毒载体或非病毒载体。在文库的载体是非病毒载体的一些实施例中，这些载体可以包含表达rna构建体的dna质粒。在文库的载体是非病毒载体的其他实施例中，这些载体可以包含rna构建体本身。在文库的载体是病毒载体的实施例中，这些载体可以是慢病毒载体，例如整合慢病毒载体。如本文所公开的，其他病毒载体是技术人员熟知的，并且可以用于本发明的工作中。

24、在第四方面，本发明提供了筛选候选药剂套组以选择与rna调控元件和/或二级结构相互作用的药剂的多重方法，该方法包括：

25、a.将根据第一方面所述的细胞文库与该候选药剂套组以多重方式接触，然后

26、b.鉴定其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的一种或多种细胞群体，然后

27、c.选择与步骤b中鉴定的所述细胞群体接触过的候选药剂。

28、在第五方面，本发明提供了筛选rna调控元件和/或二级结构的群体以评估其功能的方法。在这个方面，该方法包括获取根据第一方面所述的细胞文库，繁殖细胞，并评估每种细胞群体中报告基因的表达水平。与本发明其他方面的构建体一致，一个单一群体的细胞的每种rna构建体彼此相同，但其中不同群体的细胞的rna构建体彼此不同。每个rna构建体包含：第一结构域，该第一结构域包含能够表达报告基因的表达盒；和第二结构域，在该第二结构域中，rna折叠成二级结构和/或包含并非是报告基因转录本的基因转录本的rna调控元件。

29、在一些实施例中，rna构建体被细胞稳定表达。在其他实施例中，rna构建体被细胞瞬时表达。这些细胞可能经过基因修饰，以敲除、敲低或沉默一种或多种rna结合蛋白。细胞可以是患者来源的细胞，或者是ips来源的细胞。在一些实施例中，细胞群体汇集在单一培养体积内。在其他实施例中，每种细胞群体在与每个其他细胞群体的相应细胞培养体积分开的细胞培养体积中。

30、本发明的文库(和方法)中所使用的细胞可以是真核细胞、哺乳动物细胞，例如人细胞、细胞系、原代细胞，例如取自健康或患病个体的那些细胞。细胞可以包含进一步的基因修饰，诸如基因敲除，例如如本文所述。

31、在优选的实施例中，每个rna构建体包含条形码序列。每个条形码序列对于每个第二结构域而言都是独特的。因此，读取条形码(例如通过测序等)使得能够确定第二结构域的物种。

32、在一些实施例中，rna结构的组合可能影响mrna的翻译，或通过与rna结合蛋白的结合影响mrna的剪接。文库可以包含：含有utr的包含具有rna结构组合的野生型utr以及携带破坏rna结构的突变的rna结构的多个rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有utr的包含rna结构中的突变的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类编码或非编码rna序列的utr结构，其中该类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的utr结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

33、类似地，文库可以包含：含有茎环或多路连接点的包含具有rna结构组合的野生型茎环或多路连接点以及携带破坏rna结构的突变的rna结构的多个rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有茎环或多路连接点的包含rna结构中的突变的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类编码或非编码rna序列的茎环或多路连接点结构，其中该类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的茎环或多路连接点结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的

34、在一些实施例中，rna结构的组合可以形成功能结构域，诸如ires(内部核糖体进入位点)。该第二结构域可以包含共同包含内部核糖体进入位点(ires)的二级结构的组合。文库可以包含：含有ires的包含野生型ires结构的rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有ires的包含突变体ires结构的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类编码或非编码rna序列的ires结构，其中该类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的ires结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

35、在一些实施例中，每个第二结构域包含由多个rna结构，诸如包含g-四链体(g4)、多路连接点的茎环、假结或其组合的二级结构组成的完整调控元件。文库可以包含多个二级结构，诸如含有多路连接点、或茎环或g4的rna构建体，这些构建体包含野生型结构，诸如野生型g4、茎环或多路连接点结构；并且其中文库的其他细胞群体包含二级结构，诸如含有茎环、多路连接点、g4的rna构建体，这些构建体包含二级结构的突变体形式，诸如突变的g4，或破坏多路连接点或茎环或其他结构形成的突变。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类编码或非编码rna序列的g4结构，其中该一类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的g4结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

36、在一些实施例中，第二结构域可以包含含有三重螺旋的二级结构。文库可以包含：含有三重螺旋的包含野生型三重螺旋结构的rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有三重螺旋的包含可破坏三重螺旋结构的突变的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类编码或非编码rna序列的三重螺旋结构，其中该类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的三重螺旋结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

37、在一些实施例中，第二结构域可以包含含有假结的二级结构。文库可以包含：含有假结的包含野生型假结结构的rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有假结的包含可破坏假结结构的突变的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的编码和/或非编码rna序列的假结结构，其中该类非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的假结结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

38、在一些实施例中，第二结构域可以包含含有茎环的二级结构。文库可以包含：含有茎环的包含野生型茎环结构的rna构建体；并且其中文库的其他细胞群体包含：含有茎环的包含可破坏茎环结构的突变的rna构建体。细胞中的rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体(例如人)所表达的一类非编码rna序列的茎环结构，其中该类编码或非编码rna序列选自mrna utr、lncrna、mirorna和cirrna。细胞中的rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的大部分或基本上全部的茎环结构，例如这些结构的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如如通过计算机上模拟或体外筛选所定义的。

39、在一些实施例中，rna构建体的每个第二结构域包含rna调控元件。在一些实施例中，rna调控元件是来自mrna的非翻译区(utr)或内含子。在一些实施例中，utr或内含子包含结合长非编码rna(lncrna)或rna结合蛋白或microrna(mirna)的结合位点。在一些实施例中，每个第二结构域的rna包含并非是报告基因的基因的5'utr。在一些实施例中，每个第二结构域的rna包含并非是报告基因的基因的3'utr。

40、在优选的实施例中，每个第二结构域可以包含g4、茎环、多路连接点或功能结构(诸如ires)的结构组合。这些结构/元件可以包含在形成第二结构域/查询序列的utr结构内。

41、在一些实施例中，每个第一结构域的报告基因表达一种或多种荧光蛋白。例如，荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)和/或红色荧光蛋白(rfp)。设想多种启动子能够形成rna构建体的一部分，例如cmv、sv40、ef1a、cag、pkg或h1。启动子可以存在于编码报告基因(例如gfp和rfp)的序列的上游。替代性地，可以将双向启动子置于它们之间。rna构建体可以包含在编码荧光蛋白的序列(例如编码gfp的序列与编码rfp的序列)之间在表达盒内的第二结构域的ires。启动子可以存在于编码gfp和rfp的序列上游(ires位于它们之间)。替代性地，表达盒可以包含gfp的编码序列和rfp的编码序列，以及它们之间的双向启动子。

42、在本发明的一些实施例中，第二结构域定位在每个rna构建体的5'端。在其他实施例中，第二结构域位于每个rna构建体的3'端。

43、在一些实施例中，rna结构定位在报告基因(即gfp)的5'端。在其他实施例中，rna结构定位在报告基因的3'端。

44、在优选的实施例中，rna构建体包含条形码序列；并且步骤b.进一步包括读取其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的细胞群体的条形码序列的子步骤。

45、在一些实施例中，步骤b.采用荧光活化细胞分选(facs)来鉴定其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的细胞群体，并根据报告基因表达水平分离细胞群体。

46、在一些实施例中，步骤a.通过在多孔板中将细胞文库与候选药剂套组接触来进行。在其他实施例中，步骤a.通过经由高通量液滴微流体系统将细胞文库与候选药剂套组接触来进行。

47、在一些实施例中，候选药剂是小分子。在其他实施例中，候选药剂是rna分子，例如sirna、mirna或lncrna。还设想了候选药剂是蛋白质(例如rna结合蛋白(rbp)、内抗体等)的等效方法。

48、在一些实施例中，候选药剂是被引入患者来源的样品(诸如来自患有疾病的患者的ips来源的细胞系)中的遗传扰动。在其他实施例中，候选药剂是rna分子，例如sirna、mirna或lncrna。还设想了候选药剂是蛋白质(例如rna结合蛋白(rbp)、内抗体等)的等效方法。

49、在一些实施例中，筛选方法涉及筛选靶向一些细胞群体而不是其他细胞群体的药剂(例如化学物质)或遗传扰动：细胞群体可以分组为含有包含需要靶向的元件(例如癌症相关基因中的rna二级结构)的rna构建体的细胞群体，以及含有包含不需要靶向的元件(例如来自非癌症相关基因的rna二级结构)的rna构建体的细胞群体。因此，我们提供了一种筛选与多个rna结构，诸如多个g4、茎环或多路连接点结构相互作用的药剂的方法，所述多个rna结构例如存在于癌症相关基因(诸如myc、ras、vegf和/或kras)的mrna中。可将小分子、rna分子、内抗体等工程化成同时结合rna二级结构的这些子集以靶向多个生物过程并使用本发明进行筛选和验证。

50、这些方法允许将已知的和/或新的药剂鉴定为表现出rna靶向作用模式。

51、在进一步的方面，本发明提供了一种通过用本文描述的载体文库转染或转导细胞群体来产生细胞文库的方法。细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞。细胞可以是干细胞，例如诱导多能干细胞(ips细胞)。细胞可以是肿瘤细胞。细胞可以来自组织样品。细胞可以来自哺乳动物受试者(例如人类受试者)的活组织检查。

52、在进一步的方面，本发明提供一种了筛选候选药剂套组以选择与rna调控元件和/或二级结构相互作用的药剂的多重方法，该方法包括：a.将细胞文库与候选药剂套组以多重方式接触，然后b.鉴定其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的一种或多种细胞群体，然后c.选择与步骤b中鉴定的所述细胞群体接触过的候选药剂。

53、rna构建体可以包含条形码序列，并且步骤b.可以进一步包括读取其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的任何细胞群体的条形码序列。

54、步骤a.可以通过在多孔板中使细胞文库与候选药剂套组接触来进行，或者通过经由高通量液滴微流体系统使细胞文库与候选药剂套组接触来进行。在一些实施例中，候选药剂是小分子或rna分子，诸如sirna、mirna或lncrna。

55、步骤b.可以采用荧光活化细胞分选(facs)来鉴定其中报告基因表达相对于平均报告基因表达增加或减少的细胞群体，并根据报告基因表达水平分离细胞群体。

56、在进一步的方面，本发明提供了一种筛选rna调控元件和/或二级结构的群体以评估所述元件/结构的功能的方法，该方法包括提供细胞文库、繁殖细胞并评估每种细胞群体中报告基因的表达水平。每个rna调控元件可以是utr。每个rna二级结构可以是g4。rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的所有g4结构。rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体所表达的一类编码或非编码rna序列的g4结构，其中该类非编码rna序列选自mrna、lncrna、mirorna或cirrna的内含子或utr。每个rna调控元件和/或二级结构可以包含内部核糖体进入位点(ires)。rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的所有ires结构。rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体所表达的一类编码或非编码rna序列的ires结构，其中该类非编码rna序列选自mrna、lncrna、mirorna或cirrna的内含子或utr。每个rna调控元件和/或二级结构包含三重螺旋。rna构建体可以包含由目标生物体的基因组表达的所有三重螺旋结构。rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体所表达的一类编码或非编码rna序列的三重螺旋结构，其中该类非编码rna序列选自mrna、lncrna、mirorna或cirrna的内含子或utr。每个rna调控元件和/或二级结构包含假结。rna构建体包含由目标生物体的基因组表达的所有假结结构。

57、rna构建体可以构成套组，该套组包含来自目标生物体所表达的一类编码或非编码rna序列的假结结构，其中该类非编码rna序列选自mrna、lncrna、mirorna或cirrna的内含子或utr。

58、在一些实施例中，细胞已经过基因修饰，以敲除、敲低或沉默一种或多种rna结合蛋白。

59、在进一步的方面，本发明提供了一种鉴定与疾病状况相关的遗传扰动的方法，该方法包括提供包含本发明的核酸构建体的细胞文库，其中细胞的第一亚群包含来自患有特定疾病的一个或多个受试者的rna调控元件和/或二级结构；并且细胞的第二亚群包含来自不患有特定疾病的一个或多个受试者的rna调控元件和/或二级结构；并比较第一和第二亚群中的相对报告基因表达水平

60、在进一步的方面，本发明提供了一种鉴定与疾病状况相关的化学扰动的方法，该方法包括提供包含本发明的核酸构建体的细胞文库，并将细胞的第一亚群与一种或多种化学药剂接触；以及将第一亚群中的相对报告基因表达水平与尚未与一种或多种化学药剂(例如小分子、已知治疗剂和/或进一步的rna分子)接触的第二亚群中的相对报告基因表达水平进行比较。

61、在进一步的方面，本发明提供了一种创建细胞网络或生物表型或电路的方法，该方法包括(a)向包含本发明的核酸构建体的细胞文库中的查询序列引入至少一个、两个、三个、四个或更多个单阶或组合遗传扰动，其中多个细胞中的每个细胞接受至少一种扰动；(b)测量过程，该测量过程包括：(i)检测单细胞中与未接受任何扰动的一个或多个细胞相比的基因组、遗传、蛋白质组、表观遗传和/或表型差异，以及(ii)检测单细胞中的扰动；以及(c)通过对所测量的差异应用考虑协变量的模型来确定与该扰动相关的测量差异，由此推断细胞间和/或细胞内网络或电路。测量过程(b)可以包括单细胞测序和/或读取可能存在于核酸构建体中的条形码序列。该模型可以考虑所测量的信号的捕获率、该扰动是否实际上扰乱了细胞(表型影响)、不同细胞或细胞状态的亚群的存在、和/或在没有任何扰动的情况下对匹配细胞的分析。

62、本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合明显不允许或明确避免。