用于改善核酸簇克隆性的方法与流程

本公开尤其涉及扩增靶核酸以生成簇；并且更具体涉及增加单克隆的或具有高优势百分比的簇的数目。

背景技术：

1、靶核酸链的测序可以通过多个反应循环发生，其中每个循环一个可检测核苷酸被掺入到拷贝链中。可检测核苷酸通常被封闭以防止每个循环掺入多于一个可检测核苷酸。在孵育时间后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入到拷贝链中的可检测核苷酸的身份。接着，进行解封闭步骤和切割或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后一个掺入的核苷酸去除封闭剂，并且从掺入到拷贝链中的最后一个核苷酸切割可检测部分或在该核苷酸上掩蔽可检测部分。在一些情况下，可检测部分充当封闭剂，并且可检测部分的去除可以去除封闭剂。然后通过在随后的掺入步骤中引入可检测核苷酸来重复循环。

2、在许多情况下，同时测序具有相同序列的靶核酸链的簇。簇用于扩增由掺入到拷贝链中的可检测核苷酸产生的信号。因为簇含有相同序列的多个模板链，所以在每轮核苷酸添加时掺入到相应拷贝链中的核苷酸应当是相同的，并且来自可检测核苷酸的信号应当与簇中模板链的拷贝数成比例地增强。

3、靶核酸链的簇可以通过例如在称为接种的步骤中在足以使靶核酸与基底表面上的捕获引物杂交的条件下接触包括多种靶核酸的样品而在诸如固体表面的基底上形成。可以扩增接种的靶核酸以产生簇。捕获引物可以是结合到基底表面以允许桥扩增的一对引物中的一个引物。捕获引物可以限于基底的特定位置(诸如孔、图案化流通池上等)以将扩增的菌落彼此分离。

4、在一些情况下，簇是多克隆的而不是单克隆的。多克隆簇可以由簇中多于一个靶核酸的扩增产生。如果多克隆簇具有以远远高于其它靶物种的浓度存在的单个靶物种，使得来自优势物种的信号可以从簇中非优势物种的噪声中分辨出来，则可以对优势靶物种进行测序。靶物种可以变成优势的，因为它在一种或多种随后的非优势物种的接种和扩增之前接种和扩增。

5、含有产生远远高于其它物种背景的信号并且因此可以被测序的优势靶物种的多克隆簇被称为“通过过滤器”或pf。目前采用的用于高通量测序的技术和方法提供60％至80％范围内的pf，这意味着20％至40％的簇是不可测序的。为了增加通量和增加测序效率，希望增加pf簇的百分比。

6、增加pf的簇的百分比的一种方式是降低与基底接触以生成簇的样品中的靶核酸的浓度。通过降低靶核酸的浓度，减少了多于一个核酸将与表面上的引物附接并被扩增的机会。然而，降低样品中靶核酸的浓度也增加了一些簇位点将不被接种并且将不含有用于测序的扩增核酸的可能性。

7、可以进行单独的接种和扩增步骤来代替利用具有低浓度靶核酸的样品的单一接种和扩增步骤，以实现更多簇位置被占据的簇的更高优势和pf。在每个步骤中，可以使用低得多的dna模板浓度，使得仅一部分位置被接种，但是这些位置中的每一个位置扩增为低得多的具有更高优势的多克隆，并且因此更可能pf。通过多轮接种和扩增，基底的更多位置可以被靶核酸的簇占据。

8、然而，包括多个接种/扩增步骤的方法具有几个缺点。例如，该方法比仅包括单一接种/扩增步骤的过程更复杂，比仅包括单一接种/扩增步骤的过程花费更多的时间，并且可以使用比仅包括单一接种/扩增步骤的过程更多的扩增试剂。

技术实现思路

1、本技术尤其描述了用于接种和扩增源自样品的靶核酸以在基底表面上的位点处形成簇的方法。至少一部分靶核酸最初呈不能接种的无活性形式，使可用于接种的活性形式的靶核酸的浓度相对低。当活性形式的靶核酸接种在基底表面上时，它们可以被扩增。因为活性形式的核酸的浓度低，所以第二活性形式的靶核酸在第一活性形式的靶核酸已充分扩增以占优势之前将在相同位点并在相同簇内接种的可能性低。因此，相对于采用更高浓度核酸的传统接种和扩增方法，簇将pf的可能性增加。

2、尽管能够使用本文所述的最初无活性形式的核酸进行多于一个的接种和扩增步骤，但是单一接种和扩增步骤可以提供多步骤低浓度接种和扩增的一些益处，而没有多步骤的缺点。包含靶核酸的组合物的组合物可以与基底接触足以允许大多数或所有位点被接种和扩增以形成单克隆的或具有高优势百分比的簇的时间。

3、在多个方面，本公开描述了一种方法，该方法包括提供具有与捕获剂结合的表面的基底和提供组合物，该组合物包含(i)多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含通用序列，和(ii)抑制通用序列的至少一部分与捕获剂结合的抑制剂。该方法还包括使基底的表面与组合物接触以使靶核酸中的一个靶核酸与捕获剂结合。该方法还可以包括在组合物与基底表面接触时扩增与捕获剂结合的靶核酸。

4、与基底表面结合的捕获剂可以包含具有核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，通用序列包含与捕获剂的核酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

5、抑制剂可以包含具有与捕获剂的核酸的核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列的核酸。组合物还包含解封闭剂，该解封闭剂包含具有与抑制剂的核酸的至少一部分互补的核苷酸序列的核酸。组合物中解封闭剂的浓度低于抑制剂的浓度。

6、在一些实施方案中，抑制剂包封多个不同的靶核酸。例如，抑制剂可以包含包封靶核酸的脂质体或噬菌体。组合物还可以包含解封闭剂，该解封闭剂被配置为释放包封在抑制剂中的多个不同的靶核酸。例如，当抑制剂包含脂质体时，解封闭剂可以包含被配置为破坏脂质体的膜以从脂质体释放靶核酸的分子。例如，解封闭剂可以包含孔蛋白、踝蛋白或细胞骨架膜下蛋白。作为另一个示例，当抑制剂包含噬菌体λ时，解封闭剂可以包括lamb。

7、在多个方面，本公开描述了一种方法，该方法包括提供具有与捕获剂结合的表面的基底和提供组合物，该组合物包含多个不同的靶核酸，每个靶核酸包含被配置为结合捕获剂的通用序列。多个不同核酸中的至少一些核酸的通用序列被阻止与捕获剂结合。至少一些核酸被阻止与基底表面的结合位点结合。该方法还包括使基底的表面与组合物接触并解封闭多个不同的靶核酸中的至少一些靶核酸的通用序列以允许解封闭的核酸与捕获剂结合。该方法还可以包括在组合物与基底表面接触时扩增与捕获剂结合的核酸。

8、在一些实施方案中，本文所述方法中的组合物被配置为在组合物与基底表面接触的时间期间提供约5皮摩尔(pm)至约50pm范围内的可用于与捕获剂结合的靶核酸浓度。在一些实施方案中，组合物中核酸(包括可用于结合结合位点的那些和不可用于结合结合位点的那些)的总浓度可以在约50pm至约1nm的范围内。

9、多个不同的靶核酸可以包含dna，诸如文库dna。

10、捕获剂可以是捕获剂阵列的一部分。

11、基底可以是测序流通池的一部分。

12、定义

13、除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。

14、如本文所用，术语“阵列”是指可以根据相对位置彼此区分的一组位点。位于阵列的不同位点处的不同分子可以根据位点在阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个位点可以包括一种或多种特定类型的分子。例如，位点可以包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可以包含具有相同序列(和/或其互补序列)的若干核酸分子。阵列位点可以由基底或设备上的特征部限定。示例性特征部包括但不限于孔、小珠(或其他颗粒)、来自表面的凸起、表面上的脊、表面上的图案化涂层或表面中的通道。例如，阵列的每个位点可以由孔限定。

15、如本文所用，术语“扩增子”当用于提及核酸时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少拷贝部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可以通过使用核酸(例如靶核酸或其扩增子)作为模板的多种扩增方法中的任一种产生，所述扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链反应(pcr)、滚环扩增(rca)、连接延伸或连接酶链反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单拷贝(例如，聚合酶延伸产物)或该核苷酸序列的多拷贝(例如，rca的多联体产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子通常为互补拷贝。后续的扩增子是在生成第一扩增子后，由靶核酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可以具有与靶核酸基本上互补或与靶核酸基本上相同的序列。

16、如本文所用，术语“容量”当用于提及位点和核酸时，意指可占据该位点的核酸(例如，源自靶核酸的扩增子)的最大量。例如，该术语可以指在特定条件下可以占据该位点的核酸的总数。也可以使用其他度量，包括例如核酸的总质量或在特定条件下可以占据该位点的特定核苷酸序列的拷贝总数。通常，靶核酸的位点的容量将基本上等于靶核酸的扩增子的位点的容量。

17、如本文所用，术语“扩增位点”是指阵列的可以生成一个或多个扩增子的位点。扩增位点还可以被配置为包含、保持或附接在该位点生成的至少一个扩增子。扩增位点可以包含捕获剂。

18、如本文所用，术语“捕获剂”是指能够附接或保留靶分子(例如，靶核酸)的材料、化学物种、分子或它们的部分。示例性捕获剂包括但不限于与靶核酸的至少一部分互补(例如，被修饰以包括通用捕获结合序列)的捕获核酸、能够与修饰的靶核酸(或与其附接的连接部分)结合的受体-配体结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，或能够与修饰的靶核酸(或与其附接的连接部分)形成共价键的化学试剂。在一些实施方案中，捕获剂包含核酸。在一些实施方案中，包含核酸的捕获剂可以用作扩增引物。

19、为了本说明书的目的，靶核酸与捕获剂的“结合”意指靶核酸以适于对结合的靶核酸进行操作的方式相对于捕获剂附接或保留。例如，结合的靶核酸可以相对于捕获剂充分地附接或保留以进行靶核酸的扩增，同时靶核酸在扩增条件下仍然附接或保留捕获剂。结合可以包括共价结合、杂交等。关于靶核酸和抑制剂等，结合具有类似的含义。为了本说明书的目的，“接种”在基底上的核酸与基底结合；例如经由捕获剂结合。

20、当涉及核酸捕获剂时，可以使用术语“p5”和“p7”。术语“p5’”(p5上撇号)和“p7’”(p7上撇号)分别指p5和p7的互补序列。应当理解，任何合适的核酸捕获剂都可以用于本文所呈现的方法中，并且p5和p7的使用仅为示例性实施方案。在流通池上使用核酸捕获剂诸如p5和p7是本领域已知的，如wo 2007/010251、wo 2006/064199、wo 2005/065814、wo2015/106941、wo 1998/044151和wo 2000/018957的公开内容所例示。本领域技术人员将认识到核酸捕获剂也可以作为扩增引物起作用。例如，任何合适的核酸捕获剂都可以充当正向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中的，并且可以用于本文呈现的用于与序列(例如，通用捕获结合序列)杂交和扩增序列的方法中。类似地，任何合适的核酸捕获剂都可以充当反向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中的，并且可以用于本文呈现的用于与序列(例如，通用捕获结合序列)杂交和扩增序列的方法中。鉴于可获得的一般知识和本公开的教导，本领域技术人员将理解如何设计和使用适于捕获和扩增如本文所呈现的靶核酸的序列。

21、如本文所用，术语“通用序列”是指两个或更多个靶核酸共有的序列区域，其中这些分子也具有彼此不同的序列区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用与通用序列(例如，通用捕获结合序列)的一部分互补的捕获核酸群体捕获多种不同的核酸。通用捕获结合序列的非限制性示例包括与p5和p7引物相同或互补的序列。p5具有以下核苷酸序列：aat gat acg gcg acc acc ga(seq id no:1)。p7具有以下核酸序列：caagca gaa gac ggc ata cga gat(seq id no:2)。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列的一部分(例如，通用引物结合位点)互补的通用引物的群体来复制或扩增多种不同核酸。如本文所述，靶核酸可以被修饰以例如在不同靶序列的一端或两端附接通用衔接子(本文也称为衔接子)。

22、如本文所用，术语“衔接子”及其派生词(例如，通用衔接子)通常是指可以连接到靶核酸的任何线性寡核苷酸。在一些实施方案中，衔接子与存在于样品中的任何靶序列的3'端或5'端基本上不互补。在一些实施方案中，合适的衔接子长度在约10至100个核苷酸、约12至60个核苷酸和约15至50个核苷酸的长度范围内。一般来讲，衔接子可以包括核苷酸和/或核酸的任何组合。衔接子可以包括一个或多个位置处的一个或多个可切割基团。衔接子可以包括与引物(例如，包含核酸的捕获剂)的至少一部分基本上相同或基本上互补的序列。衔接子可以包括条形码(也称为索引或标签)以有助于下游纠错、识别或测序。

23、如本文所定义，“样品”及其衍生物以其最广泛的意义使用，并且包括怀疑包括靶核酸的任何标本、培养物等。在一些实施方案中，样品包括dna、rna、pna、lna、嵌合或杂交形式的核酸中的一者或多者。样品可以包括含有一种或多种核酸的任何基于生物、临床、外科、农业、大气或水生动植物的标本。该术语还包括任何分离的核酸样品，诸如基因组dna、新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋的核酸标本。还设想样品的来源可以是：单个个体、来自遗传相关成员的核酸样品的集合、来自遗传不相关成员的核酸样品、来自单个个体的(与之匹配的)核酸样品(诸如肿瘤样品和正常组织样品)，或者来自含有两种不同形式的遗传物种(诸如从母体受试者获得的母体dna和胎儿dna)的单个来源的样品，或者在含有植物或动物dna的样品中存在污染性细菌dna。在一些实施方案中，核酸材料的来源可以包括从新生儿获得的核酸，例如通常用于新生儿筛检的核酸。

24、如本文所用，当用于指核酸分子时，术语“双链”意指核酸分子中的核苷酸与互补核苷酸氢键键合。部分双链核酸可以占其与互补核苷酸氢键键合的核苷酸的至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

25、如本文所用，术语“每个”当用于提及项目的集合时，旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目，除非上下文中另外明确指出。

26、如本文所用，术语“排除体积”是指由特定分子占据以排除其它此类分子的空间体积。

27、如本文所用，术语“间隙区域”是指基底中或表面上与基底或表面的其它区域分开的区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个位点与阵列的另一个位点分开。彼此分开的两个位点可以为离散的，彼此缺乏接触。在另一个示例中，间隙区域可以将位点的第一部分与位点的第二部分分开。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域通常具有与表面上位点的表面材料不同的表面材料。例如，阵列位点可以具有量或浓度超过存在于间隙区域处的量或浓度的捕获剂。在一些实施方案中，间隙区域可以不含捕获剂。

28、如本文所用，术语“聚合酶”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括例如使用核酸作为模板链产生核酸分子的互补复制的酶。通常，dna聚合酶结合到模板链并且然后沿模板链向下移动，将核苷酸依序添加到生长核酸链的3'端处的游离羟基。dna聚合酶通常自dna模板合成互补dna分子并且rna聚合酶通常自dna模板合成rna分子(转录)。聚合酶可以使用短rna或dna链(称为引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶称为链置换的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链移位活性的示例性聚合酶包括但不限于枯草芽孢杆菌(bsu，bacillus subtilis)聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(bst，bacillus stearothermophilus)聚合酶、外-克列诺(exo-klenow)聚合酶、或测序级t7外-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。

29、如本文所用，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸及其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(dna)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(rna)中)。核酸可以含有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可以包括天然的或非天然的碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基。可以包括在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。核酸可以包含两个或更多个核苷酸。

30、除非另有明确说明，否则术语“靶”当用于提及核酸时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符并且不一定限制核酸的结构或功能。在每端具有通用序列(例如在每端具有通用衔接子)的靶核酸可以被称为修饰的靶核酸。为了本公开的目的，“靶核酸”和“修饰的靶核酸”可互换使用，并且指具有靶核苷酸序列的任何核酸。

31、如本文所用，术语“转运”是指分子通过流体移动。该术语可以包括被动转运，例如分子沿其浓度梯度移动(例如，被动扩散)。该术语还可以包括主动转运，分子可以沿其浓度梯度或逆其浓度梯度移动。因此，转运可以包括施加能量以将一个或多个分子沿期望方向或向期望位置(诸如扩增位点)移动。

32、如本文所用，术语“速率”当用于提及转运、扩增、捕获或其它化学过程时，旨在与其在化学动力学和生物化学动力学中的含义一致。两个过程的速率可以相对于最大速率(例如在饱和时)、预稳态速率(例如在平衡之前)、动力学速率常数或本领域已知的其它量度进行比较。特定过程的速率可以相对于完成该过程的总时间来确定。例如，扩增速率可以相对于扩增完成所花费的时间来确定。然而，特定过程的速率不需要相对于完成该过程的总时间来确定。

33、术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。“或”在本文中用于意指“和/或”，除非上下文另有说明。在一些情况下，使用“和/或”并不意味着在其他情况下使用“或”旨在不意指“和/或”。

34、词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，并且并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

35、术语“包含”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制的含义。

36、应当理解，在本文以语言“包含”、“包括(include、includes或including)”等描述实施方案的任何地方，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。例如，包括小珠的基底可以是由小珠组成或基本上由小珠组成的基底。

37、除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多于一个。

38、用于待发生事件(诸如两个核酸序列的杂交)的“适合”的条件或“合适的”条件是不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件。

39、如本文所用，在组合物的上下文中，“提供”物品或核酸意指制备组合物、物品或核酸、购买组合物、物品或核酸或以其他方式获得化合物、组合物、物品或核酸。

40、同样在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

41、本说明书通篇提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“某些实施方案”、“一些实施方案”、“一个方面”、“方面”、“某些方面”或“一些方面”等意指结合该实施方案或方面描述的特定特征、构型、组成或特性包括在本公开的至少一个实施方案或方面中。因此，本说明书通篇的多处出现的此类短语不一定指本公开的相同实施方案。此类短语在本说明书通篇不同位置的出现不一定意味着单独提及的方面或实施方案不相同或不可组合。此外，在一个或多个实施方案或方面中，本文公开的特定特征、构型、组成或特性可以任何合适的方式组合。

42、对于本文所公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以任何可行的顺序进行。并且，视情况而定，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。

43、本发明的上述
技术实现要素：
并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本技术全文的若干地方，通过示例的列表提供了指导，这些示例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表仅用作代表性的组，并且不应理解为排他性列表。