嵌合腺病毒载体的制作方法

嵌合腺病毒载体相关申请的交叉引用1.本技术要求2021年2月1日递交的第63/144,339号美国临时申请的优先权权益，并且是2021年6月4日递交的第pct/us2021/035930号国际申请的部分续案，后者要求2021年2月1日递交的第63/144,339号美国临时申请、2020年9月4日递交的第63/074,954号美国临时申请；2020年6月29日递交的第63/045,710号美国临时申请；以及2020年6月5日递交的第63/035,490号美国临时申请的优先权权益。上述每项申请均通过引用并入本文中，用于所有目的。发明背景2.冠状病毒疾病2019(covid-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的传染性疾病。这种疾病的一些症状包括例如，发烧、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛、生痰、腹泻、喉咙痛、嗅觉丧失和腹痛。虽然大多数病例导致的症状轻微，但有一些进展为病毒性肺炎和多器官衰竭。该疾病目前尚无治愈方法，并且已在多个大洲迅速传播，在世界范围内出现社区性爆发。发明概述3.一方面，本文描述了包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含：编码抗原多肽的核酸；以及编码sars-cov-2n蛋白的核酸，其中所述抗原多肽不是sars-cov2蛋白。在一些实施方案中，抗原多肽不是冠状病毒蛋白。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码sars-cov-2n蛋白的核酸包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，抗原多肽是癌症抗原。在其他实施方案中，抗原多肽来自病原体，例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施方案中，表达盒包含双顺反子或多顺反子构建体，所述构建体包含与启动子可操作地连接的编码抗原多肽的核酸和编码sars-cov-2n蛋白的核酸。在一些实施方案中，编码抗原蛋白的核酸位于编码sars-cov2-n蛋白的核酸的5’端。在其他实施方案中，编码sars-cov2-n蛋白的核酸位于编码抗原多肽的核酸的5’端。在一些实施方案中，表达盒包含内部核糖体进入位点(ires)、核糖体跳跃元件或位于编码抗原多肽的核酸和编码sars-cov-2n蛋白的核酸之间的furin切割位点。在一些实施方案中，表达盒包含编码选自以下的肽的核糖体跳跃元件：2a肽(t2a)、猪捷申病毒-12a肽(p2a)、口蹄病病毒2a肽(f2a)、马甲型鼻炎病毒2a肽(e2a)、质型多角体病毒2a肽(bmcpv2a)和家蚕软化病病毒(b.mori)2a肽(bmifv2a)。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码t2a肽的序列。在一些实施方案中，启动子是cmv启动子。在一些实施方案中，编码抗原多肽的核酸与第一启动子可操作地连接，并且编码sars-cov-2n蛋白的核酸与第二启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子各自是cmv启动子。在一些实施方案中，第一启动子是cmv启动子，并且是β-肌动蛋白启动子；或者第一启动子是β-肌动蛋白启动子，并且第二启动子是cmv启动子。在许多实施方案中，表达盒包含聚腺苷酸化信号，如牛生长激素聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，嵌合腺病毒表达载体还包含编码toll样受体-3(tlr-3)的核酸。在一些实施方案中，tlr-3激动剂包含编码dsrna的核酸。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：seqidnos:11-18。在其他方面，本公开还提供了包含如本文所述的嵌合腺病毒载体的宿主，例如，在本段中，包含如本文所述的嵌合腺病毒表达载体的免疫原性组合物，例如，在本段中，以及药学上可接受的载体；以及在受试者中引发针对抗原多肽的免疫应答的方法，包括向受试者给予免疫原性有效量的如本文所述的嵌合腺病毒表达载体，例如，在本段中，至哺乳动物受试者。在一些实施方案中，给药途径是经口、鼻内或粘膜。在一些实施方案中，给药途径是通过吞下片剂经口递送。在一些实施方案中，在受试者的肺泡细胞、吸收性肠细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发免疫应答。在一些实施方案中，受试者是人类。4.在另外的方面，本公开提供了包含表达盒的嵌合多核苷酸，所述表达盒包含：编码抗原多肽的核酸，前提条件是所述抗原多肽不是sars-cov-2蛋白；以及编码sars-cov-2n蛋白的核酸。在一些实施方案中，抗原多肽不是冠状病毒多肽。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，抗原多肽来自病原体，如病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些实施方案中，表达盒包含双顺反子或多顺反子构建体，所述构建体包含与启动子可操作地连接的编码抗原多肽的核酸和编码sars-cov-2n蛋白的核酸。在一些实施方案中，编码抗原蛋白的核酸位于编码sars-cov2-n蛋白的核酸的5’端。在其他实施方案中，编码sars-cov2-n蛋白的核酸位于编码抗原多肽的核酸的5’端。在一些实施方案中，表达盒包含内部核糖体进入位点(ires)、核糖体跳跃元件或位于编码抗原多肽的核酸和编码sars-cov-2n蛋白的核酸之间的furin切割位点。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码选自以下的病毒多肽的序列：2a肽(t2a)、猪捷申病毒-12a肽(p2a)、口蹄病病毒2a肽(f2a)、马甲型鼻炎病毒2a肽(e2a)、质型多角体病毒2a肽(bmcpv2a)和家蚕软化病病毒2a肽(bmifv2a。在一些实施方案中，启动子是cmv启动子。在一些实施方案中，编码抗原多肽的核酸与第一启动子可操作地连接，并且编码sars-cov-2n蛋白的核酸与第二启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子各自是cmv启动子。在一些实施方案中，第一启动子是cmv启动子，并且是β-肌动蛋白启动子；或者第一启动子是β-肌动蛋白启动子，并且第二启动子是cmv启动子。在一些实施方案中，表达盒包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，嵌合多核苷酸包含编码tlr-3激动剂的序列。在一些实施方案中，tlr-3激动剂包含编码adsrna的核酸。在一些实施方案中，tlr-3激动剂包含选自seqidnos:11-18的序列。在其他方面，本公开还提供了表达构建体，其包含如本文所述的嵌合多核苷酸，例如，在本段中；在受试者中诱导免疫应答的方法，包括给予所述表达构建体；以及包含所述嵌合多核苷酸或所述表达构建体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。5.在其他方面，本文提供了包含双顺反子或多顺反子表达构建体的嵌合腺病毒表达载体，所述构建体包含：编码sars-cov-2s蛋白的核酸；以及编码sars-cov-2n蛋白的核酸。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码sars-cov-2n蛋白的核酸包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，sars-cov-2s蛋白包含与seqidno:1具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码sars-cov-2s蛋白的核酸包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，双顺反子构建体与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码sars-cov-2蛋白的核酸位于编码sars-cov2-n蛋白的核酸的5’端。在其他实施方案中，编码sars-cov2-n蛋白的核酸位于编码sars-cov-2s蛋白的核酸的5’端。在一些实施方案中，表达盒包含内部核糖体进入位点(ires)、核糖体跳跃元件或位于编码sars-cov-2s蛋白的核酸和编码sars-cov-2n蛋白的核酸之间的furin切割位点。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码选自以下的肽的序列：2a肽(t2a)、猪捷申病毒-12a肽(p2a)、口蹄病病毒2a肽(f2a)、马甲型鼻炎病毒2a肽(e2a)、质型多角体病毒2a肽(bmcpv2a)和家蚕软化病病毒2a肽(bmifv2a)。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码t2a肽的序列。在一些实施方案中，启动子是cmv启动子。在一些实施方案中，表达盒包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，嵌合腺病毒表达载体还包含编码toll样受体-3(tlr-3)的核酸。在一些实施方案中，tlr-3激动剂包含编码dsrna的核酸。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：seqidnos:11-18。6.在另一方面，本公开提供了包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码第一严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；以及(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子。在一些实施方案中，嵌合腺病毒表达载体包含另外的元件(c)：与编码第二sars-cov-2蛋白的核酸可操作地连接的第三启动子。在一些实施方案中，元件(c)位于表达盒中的元件(a)和(b)之间。在某些实施方案中，(a)中的第一sars-cov-2蛋白和(c)中的第二sars-cov-2蛋白是不同的。在其他实施方案中，(a)中的sars-cov-2蛋白和(c)中的sars-cov-2蛋白是相同的。7.在该方面的一些实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二sars-cov-2蛋白的核酸包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二sars-cov-2蛋白包含sars-cov-2s蛋白，其具有的序列与seqidno:1或seqidno:20或seqidno:20的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。8.在一些实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二sars-cov-2蛋白的核酸包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二sars-cov-2蛋白包含sars-cov-2n蛋白，其具有的序列与seqidno:2的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。9.在该方面的一些实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二sars-cov-2蛋白的核酸包含与seqidno:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二sars-cov-2蛋白包含融合蛋白，其包含sars-cov-2s蛋白的s1区、furin位点和sars-cov-2n蛋白，并且其中所述融合蛋白包含与seqidno:10的序列具有至少85％同一性的序列。10.此外，嵌合腺病毒载体中的第一启动子和第二启动子可以是相同的或不同的。例如，第一启动子和第二启动子各自可以是cmv启动子。11.在该方面的一些实施方案中，当所有三个元件(a)-(c)都存在时，第一启动子可以是cmv启动子，第二启动子可以是cmv启动子，并且第三启动子可以是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)。12.在另一方面，本公开的特征在于包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码sars-cov-2s蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；以及(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子。13.在该方面的一些实施方案中，编码sars-cov-2s蛋白的核酸包含seqidno:3的序列。在一些实施方案中，sars-cov-2s蛋白包含seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20的序列。14.在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子各自是cmv启动子。15.在另一方面，本公开的特征在于包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码sars-cov-2s蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子；以及(c)与编码sars-cov-2n蛋白的核酸可操作地连接的第三启动子，任选地其中表达盒中从n端到c端的元件的顺序是：元件(a)、元件(c)和元件(b)。16.在该方面的一些实施方案中，编码sars-cov-2s蛋白的核酸包含seqidno:3的序列。在一些实施方案中，sars-cov-2s蛋白包含seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20的序列。17.在该方面的一些实施方案中，编码sars-cov-2n蛋白的核酸包含seqidno:4的序列。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含seqidno:2的序列。18.此外，在该方面的一些实施方案中，元件(a)中的第一启动子是cmv启动子，元件(b)中的第二启动子是cmv启动子，并且元件(c)中的第三启动子是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)。19.在一些实施方案中，元件(a)、(b)和(c)一起由seqidno:6的序列编码。此外，该方面的嵌合腺病毒表达载体由seqidno:8的序列编码。20.在另一方面，本公开的特征在于包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码sars-cov-2融合蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子，其中所述sars-cov-2融合蛋白包含sars-cov-2s蛋白的s1区、furin位点和sars-cov-2n蛋白；以及(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子。21.在该方面的一些实施方案中，编码sars-cov-2融合蛋白的核酸包含seqidno:5的序列。在一些实施方案中，sars-cov-2融合蛋白包含seqidno:10的序列。22.在该方面的一些实施方案中，第一启动子和第二启动子各自是cmv启动子。23.在该方面的一些实施方案中，元件(a)和(b)一起由seqidno:7的序列编码。此外，该方面的嵌合腺病毒表达载体由seqidno:9的序列编码。24.在另一方面，本公开的特征在于免疫原性组合物，其包含本文所述的嵌合腺病毒表达载体和药学上可接受的载体。25.在其他方面，本公开另外的特征在于包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码第一严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子；以及(c)与编码sars-cov-2n蛋白的核酸可操作地连接的第三启动子。在一些实施方案中，sars-cov-2n蛋白包含与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，元件(c)位于表达盒中的元件(a)和(b)之间。在一些实施方案中，第一sars-cov-2蛋白包含sars-cov-2s蛋白，其具有的序列与seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含编码dsrna的核酸。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：seqidnos:11-18。在一些实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，编码sars-cov-2n蛋白的核酸包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子是相同的。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子各自是cmv启动子。在一些实施方案中，第一启动子是cmv启动子，第二启动子是cmv启动子，并且第三启动子是β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，元件(c)位于元件(a)和(b)之间，并且元件(a)、(c)和(b)一起由与seqidno:6具有至少95％同一性的序列编码，或者由seqidno:6的序列编码。在一些实施方案中，嵌合腺病毒表达载体包含与seqidno:8具有至少95％同一性的序列，或者包含seqidno:8的序列。26.在另一方面，本公开提供了在受试者中引发针对sars-cov-2蛋白(例如，如本文所述的具有seqidnos:1、2或10，或者其变体(例如，与seqidno:1、2或10具有至少90％或至少95％同一性的序列的sars-cov-2蛋白)的免疫应答的方法，包括向受试者给予免疫原性有效量的本文所述的嵌合腺病毒表达载体或本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，给药途径是经口、鼻内或粘膜(例如，经口)。在某些实施方案中，给药途径是通过吞下片剂来经口递送。27.在该方法的一些实施方案中，在受试者的肺泡细胞、吸收性肠细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发免疫应答。在某些实施方案中，受试者是人类。28.还提供了包含表达盒的嵌合多核苷酸(其可用于在受试者中诱导免疫应答，包括但不限于cd8t-细胞反应)，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码第一严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；以及(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子；以及(c)与编码sars-cov-2蛋白或非sars-cov-2抗原蛋白的核酸可操作地连接的第三启动子。29.在一些实施方案中，嵌合多核苷酸是嵌合腺病毒表达载体。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含编码dsrna的核酸。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：seqidnos:11-18在一些实施方案中，在表达盒中元件(c)位于元件(a)和(b)之间。30.在其他的方面，本公开提供了包含表达盒的嵌合多核苷酸，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码抗原蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子；以及(c)与编码sars-cov-2n-蛋白的核cov-2肽重新刺激免疫之前和之后的pbmcs，针对cd4和脱粒标记物cd107a进行表面染色，并针对细胞因子进行细胞内染色。图显示了免疫后，响应于sars-cov-2刺突肽，cd4t细胞的ifnγ、tnfα和cd107a百分比相比背景出现增加。45.图14提供的数据说明了表达hpve6和e7蛋白的疫苗构建体的鼻内给药，并且相比缺乏sars-cov-2n的蛋白比较构建体，sars-cov-2n蛋白导致t细胞响应于hpv而出现稳定性加强。46.图15提供的数据说明了经鼻内给予的表达sars-cov-2s和n蛋白的疫苗构建体引发细胞毒性抗刺突t细胞反应，其高于仅表达s的可比疫苗。发明详述i.前言47.冠状病毒疾病2019(covid-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的传染性疾病。sars-cov-2是一种粘膜病毒病原体，其感染肺部且甚至可能肠道的上皮细胞(9)。这种疾病的一些症状包括例如，发烧、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛、生痰、腹泻、喉咙痛、嗅觉丧失和腹痛。虽然大多数病例导致的症状轻微，但也有一些进展为病毒性肺炎和多器官衰竭。48.病毒主要通过密切接触和在人们咳嗽或打喷嚏时经由产生的呼吸道飞沫传播。人们也可能通过接触受污染的表面然后接触其面部而感染covid-19。当人们出现症状时，这种感染最具传染性，尽管在症状出现之前传播可以是可能的。目前，covid-19尚无疫苗或特异性抗病毒治疗方法。管理这种疾病涉及症状治疗、支持性护理、隔离和一些实验性措施。49.sars-cov-2病毒的基因组编码四种主要结构蛋白，包括刺突(s)、核衣壳(n)、膜(m)和包膜(e)，它们是制造完整病毒颗粒所必需的。病毒进入后，由两种大的前体蛋白形成16种非结构蛋白。这些病毒具有相对较大的正义rna链(26-32kb)，并且在没有错误编辑的情况下，rna可以突变、进化，并与其他家族成员进行同源重组，以产生新的病毒物种(6)。据信，s蛋白是冠状病毒疫苗的主要抗体靶标，因为该蛋白负责受体结合、膜融合和组织向性。在比较sars-cov-2wu-1(genbank登录号qhd43416.1)与sars-cov(genbank登录号ay525636.1)时，发现s蛋白在1273个位置中具有76.2％同一性、87.2％相似性2％的空位(7)。据信，sars-cov和sars-cov-2都使用相同的受体进入细胞：血管紧张素转换酶2受体(ace2)，它在一些人类细胞类型上表达(8)。如在xu,etal.的文章中所讨论的，ace2的高表达水平存在于肺ii型肺泡细胞、回肠和结肠的吸收性肠细胞中，并且甚至可能存在于口腔组织如舌头中(32)。50.本文提供了用于治疗covid-19的疫苗、免疫原性组合物和方法，其涉及使用含有一种或多种编码一种或多种sars-cov-2蛋白的核酸和编码tlr-3激动剂的核酸的嵌合腺病毒载体。ii.定义51.本文中参考例如核酸、蛋白质或载体所用的术语“嵌合的”或“重组”，表示核酸、蛋白质和载体已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰。因此，例如，嵌合和重组载体包括未在载体的天然(非嵌合或非重组)形式中发现的核酸序列。嵌合腺病毒表达载体是指包含编码异源多肽如sars-cov-2蛋白的核酸序列的腺病毒表达载体。52.术语“表达载体”是指与允许在宿主细胞中转录特定核酸的一系列特定核酸元件重组或合成产生的核酸构建体。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括与启动子可操作地连接的待转录的核酸。53.术语“启动子”是指指导核酸转录的核酸控制序列阵列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，如在聚合酶ii型启动子的情况下，tata元件。启动子还任选地包括远端加强子或抑制子元件，其可以位于距离转录起始位点多达几千个碱基对的位置。启动子包括组成型和诱导型启动子。“组成型”启动子是指在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。54.术语“sars-cov-2”或“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”是指来自冠状病毒科(coronaviridae)的病毒家族的β冠状病毒大家族内的冠状病毒。genbank登录号mn908947.3是发布的sars-cov-2的dna序列。病毒主要通过密切接触和在人们咳嗽或打喷嚏时经由产生的呼吸道飞沫传播。55.术语“sars-cov-2蛋白”是指由sars-cov-2(例如，genbank登录号mn908947.3)的核酸编码的蛋白或该蛋白的片段。在一些实施方案中，sars-cov-2蛋白的片段包含来自由genbank登录号mn908947.3的序列编码的全长蛋白的至少10、20个或更多个连续的氨基酸。例如，sars-cov-2蛋白可以是由sars-cov-2病毒的核酸编码的全长蛋白的结构蛋白，如sars-cov-2s蛋白(表面糖蛋白；例如，seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如，与seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的那些)或sars-cov-2n蛋白(核衣壳磷蛋白；seqidno:2)。sars-cov-2蛋白还可以是含有由sars-cov-2病毒的核酸编码的全长蛋白的不同部分的融合蛋白。例如，sars-cov-2融合蛋白可以含有sars-cov-2s蛋白的s1区、furin位点和sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:10)。56.术语“covid-19”或“冠状病毒疾病2019”是指由sars-cov-2病毒引起的传染性疾病。57.如本文所用的术语“tlr激动剂”或“toll样受体激动剂”是指结合并刺激toll样受体的化合物，包括例如tlr-2、tlr-3、tlr-6、tlr-7或tlr-8。tlr激动剂在mackichan,iavireport.9:1-5(2005)和abreuetal.,jimmunol,174(8),4453-4460(2005)中有综述。激动剂在与其受体结合后诱导信号传导。58.如本文所用的术语“tlr-3激动剂”或“toll样受体3激动剂”是指结合并刺激tlr-3的化合物。tlr-3激动剂已被鉴定，包括双链rna、病毒来源的dsrna、几种化学合成的双链rna类似物，包括聚肌苷-聚胞苷酸(多聚i:c)-聚腺苷酸-聚尿苷酸(多聚a:u)和多聚i:多聚c，以及导致ifn-β产生的tlr-3的抗体(或抗体的交联)(matsumoto,m,etal,biochembiophysrescommun24:1364(2002),debouteiller,etal,jbiolchem18:38133-45(2005))。在一些实施方案中，tlr-3激动剂包含seqidnos:11-18中任一项的序列。在一些实施方案中，tlr-3激动剂是dsrna(例如，由包含seqidno:11所示序列的核酸编码的dsrna)。59.当参考核酸的部分使用时，术语“异源”表示核酸包含在天然下未发现彼此具有相同关系的两个或更多个子序列。例如，该核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个来自不相关基因的序列，这些序列被布置以制造新的功能核酸，例如，来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个或更多个在天然下未发现彼此具有相同关系的子序列(例如，融合蛋白)。60.术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或链接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽核酸(pnas)。61.除非另有说明，否则特定核酸序列还包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确说明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzeretal.,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsukaetal.,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；rossolinietal.,mol.cell.probes8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。62.术语“抗原”是指可被t细胞受体和/或抗体识别的蛋白质或多肽链的一部分。通常，抗原来源于细菌、病毒或真菌蛋白质。63.术语本公开的组合物的“免疫原性有效剂量或量”是引发或调节sars-cov-2蛋白特异性的免疫应答的量。免疫应答包括体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。免疫原性组合物可治疗性或预防性地用于治疗或预防任何阶段的疾病。体液免疫应答通常由血液的无细胞组分，即血浆或血清介导；将血清或血浆从一个个体转移到另一个个体会转移免疫力。细胞介导的免疫应答通常由抗原特异性淋巴细胞介导；抗原特异性淋巴细胞从一个个体转移到另一个个体会转移免疫力。64.术语“治疗剂量”或“治疗有效量”或“有效量”的嵌合腺病毒载体或包含嵌合腺病毒载体的组合物是指防止、减轻、消除或减少与sars-cov-2蛋白的来源(例如，sars-cov-2病毒)相关的疾病和病症的症状的严重性的载体或包含载体的组合物的量。65.术语“佐剂”是指非特异性免疫应答加强剂。合适的佐剂包括例如霍乱毒素、单磷酰脂质a(mpl)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、quila和al(oh)。佐剂也可以是那些通过第二信号传导分子如toll样受体引起抗原呈递细胞活化和t细胞呈递加强的物质。toll样受体的实例包括识别双链rna、细菌鞭毛、lps、cpgdna和细菌脂肽的受体(最近在abreuetal.,jimmunol,174(8),4453-4460(2005)中进行了综述)。66.术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。67.术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化合物。68.氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸也可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。69.如本文所用，在核酸或多肽的上下文中使用的术语“同一性百分比”或“相同性百分比”是指与参考序列具有至少50％序列同一性的序列。可选地，同一性百分比可以是从50％到100％的任何整数。在一些实施方案中，如使用本文所述的方法，优选使用标准参数的blast所确定的，如下文所述的，如果序列与参考序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，则该序列与参考序列是实质上相同的。同一性百分比也可以通过手动比对来确定。70.对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。71.比较窗包括对多个连续位置中任意一个的片段，例如至少10个残基的片段的引用。在一些实施方案中，比较窗具有10-600个残基，例如，约10个至约30个残基、约10个至约20个残基、约50个至约200个残基或约100个至约150个残基，其中在两条序列最佳对齐后，可以将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。72.适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法是blast和blast2.0算法，它们分别在altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschuletal.(1977)nucleicacidsres.25:3389-3402中进行了描述。用于进行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)网站公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为w的短字来识别高评分序列对(hsps)，当与数据库序列中相同长度的字对齐时，这些短字匹配或满足某个正值阈值分数t。t被称为邻域字得分阈值(altschuletal，同上)。这些最初的邻域字命中充当启动搜索以找到包含它们的较长hsps的种子。字命中然后沿着每条序列在两个方向上延伸，直到累积对齐分数可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终》0)和n(错配残基的惩罚分数；始终《0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当出现以下情况时，字命中在每个方向上的延伸停止：累计对齐分数从其最大实现值下降量x；由于一个或多个负得分残差比对的累积，累积分数变为零或更低；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。blastn程序(针对核苷酸序列)默认使用28的字大小(w)、10的期望值(e)、m＝1、n＝-2，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用3的字大小(w)、10的期望值(e)和blosum62评分矩阵(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))。73.blast算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，karlin&altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。blast算法提供的相似性的一种度量是最小和概率(p(n))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试氨基酸序列与参考氨基酸序列的比较中的最小和概率小于约0.01，更优选小于约10-5，且最优选小于约10-20，则认为氨基酸序列与参考序列类似。iii.本公开内容的组合物和方法74.本公开内容提供了包含嵌合腺病毒载体的组合物。嵌合腺病毒载体可以包括一种或多种编码一种或多种sars-cov-2蛋白的核酸。嵌合腺病毒载体还可以包括编码toll样受体(tlr)激动剂(例如，tlr-3激动剂)的核酸，当结合病毒载体给药时，其可以用作有效佐剂。75.在一些实施方案中，本公开的嵌合腺病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含以下元件：(a)与编码第一sars-cov-2蛋白的核酸可操作地连接的第一启动子；以及(b)与编码toll样受体-3(tlr-3)激动剂的核酸可操作地连接的第二启动子。第一sars-cov-2蛋白可以是由sars-cov-2的核酸(例如，genbank登录号mn908947.3)编码的全长蛋白(或其实质上相同的蛋白)或该蛋白的片段。例如，第一sars-cov-2蛋白可以是由sars-cov-2病毒的核酸编码的结构蛋白或全长蛋白，如sars-cov-2s蛋白(表面糖蛋白；例如，seqidno:1或其实质上相同的蛋白，例如，seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如，与seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％或至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些)；或者sars-cov-2n蛋白(核衣壳磷蛋白；seqidno:2或其实质上相同的蛋白，例如，其变体，例如，与seqidno:2具有至少90％或至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些)。在其他实施方案中，第一sars-cov-2蛋白可以是由sars-cov-2病毒的核酸的其他部分编码的蛋白，如由orf1ab基因编码的蛋白、由orf3a基因编码的蛋白、由e基因(编码包膜)编码的蛋白、由m基因(编码膜糖蛋白)编码的蛋白、由orf6基因编码的蛋白、由orf7a基因编码的蛋白、由orf8基因编码的蛋白或由orf10基因编码的蛋白。76.在其他实施方案中，第一sars-cov-2蛋白可以是含有由sars-cov-2病毒的核酸编码的全长蛋白的不同部分的融合蛋白。例如，sars-cov-2融合蛋白可以含有sars-cov-2s蛋白的s1区、furin位点和sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:10)。77.编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸可以包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码sars-cov-2s蛋白的氨基酸序列(seqidno:1)。在一些实施方案中，元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白可以包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，并且编码seqidno:19或seqidno:20的sars-cov-2s蛋白。在一些实施方案中，元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白可以包含与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％)同一性的序列，并且编码与seqidno:1或或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的sars-cov-2s蛋白变体。在其他实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸可以包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码sars-cov-2n蛋白的氨基酸序列(seqidno:2)。在一些实施方案中，元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白可以包含与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％)同一性的序列，并且编码与seqidno:2具有至少90％同一性或至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的sars-cov-2n蛋白变体。在其他实施方案中，编码元件(a)中的第一sars-cov-2蛋白的核酸可以包含与seqidno:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码含有sars-cov-2s蛋白的s1区、furin位点和sars-cov-2n蛋白(seqidno:10)的sars-cov-2融合蛋白的氨基酸序列。78.除了第一sars-cov-2蛋白，本公开的嵌合腺病毒载体还可以包含元件(c)与编码第二sars-cov-2蛋白的核酸可操作地连接的第三启动子。在特定的实施方案中，表达盒中元件从n端到c端的顺序为：元件(a)、元件(c)和元件(b)。在一些实施方案中，由表达盒中的元件(a)和(c)中其各自的核酸的编码的第一和第二sars-cov-2蛋白是相同的。在一些实施方案中，由表达盒中的元件(a)和(c)中其各自的核酸编码的第一和第二sars-cov-2蛋白是不同的。79.例如，第一sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2s蛋白(例如，seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如与seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些，其由与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2，其由与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)。在另一实例中，第一sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2，其由与seqidno:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2s蛋白(例如，seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如与seqidno:1或或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的那些，其由与seqidno:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)。80.在另一实例中，第一sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2；或者其变体，例如，与seqidno:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些)或sars-cov-2s蛋白(例如，seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如与seqidno:1或或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的那些)，并且第二sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2融合蛋白(例如，seqidno:10，其由与seqidno:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)。81.在又一实例中，第一sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2融合蛋白(例如，seqidno:10，其由与seqidno:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二sars-cov-2蛋白可以是sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2；或者与seqidno:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体)或sars-cov-2s蛋白(例如，seqidno:1或seqidno:19或seqidno:20，或者以上的变体，例如，与seqidno:1或或seqidno:19或seqidno:20具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的那些)。82.技术人员理解，sars-cov-2蛋白的变体，例如sars-cov-2s蛋白的变体迅速出现。两种变体s蛋白序列的实例，ukb.1.1.1.7变体和南非b.1.351501y.v2变体，分别在seqidnos:19和20中提供。其他s蛋白变体是已知的，包括巴西变体p.1(l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、d614g、h655y、t1027i)；印度变体b.1.617(l452r、e484q、d614g)和奥密克戎变体等。因此，在一些实施方案中，sars-cov-2s蛋白序列是在患者群体中鉴定的变体序列。83.除了上述触发针对sars-cov-2蛋白的免疫应答的载体，鉴于实施例6中所示的数据，本文还提供了其中可将冠状病毒n蛋白，通常为sars-cov-2n蛋白与可来自非sars-cov-2抗原来源的任何第二抗原的共同引入用于刺激针对第二抗原的cd8t细胞免疫应答的实施方案。84.因此，本公开还提供了编码sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2或与seqidno:2具有至少90％同一性或至少95％同一性的其变体，或者其片段)和编码来自任何来源的第二抗原蛋白的多核苷酸。例如，第二抗原蛋白可来自非sars-cov-2病毒、细菌、其他病原体或癌症。例如，在一些实施方案中，第二抗原是来自以下的蛋白或其片段：1型单纯疱疹；2型单纯疱疹；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；epstein-barr病毒；人类巨细胞病毒；8型人类疱疹病毒；人类乳头瘤病毒；bk病毒；jc病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人类博卡病毒；细小病毒b19；人类星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革热病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒(hiv)；流感病毒；瓜纳瑞托病毒；鸠宁病毒；拉沙病毒；马秋波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人类偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；colti病毒；版纳病毒；人类肠道病毒；汉坦病毒；西尼罗病毒；中东呼吸综合症冠状病毒；日本脑炎病毒；水泡性疹性病毒(vesicularexanthernavirus)；或者东方马型脑炎。关于可以使用的抗原列表，还参见第8,222,224号美国专利。85.如本文所述的可与sars-cov-2n蛋白组合使用的第二抗原的特定实例包括但不限于来源于以下的那些：诺如病毒(例如，vp1)、呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒(例如，ha、na、m1、np)、人类免疫缺陷病毒(hiv，例如，gag、pol、env等)、人乳头瘤病毒(hpv，例如，衣壳蛋白如l1)、委内瑞拉马脑脊髓炎(vee)病毒、epsteinbarr病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、人类疱疹病毒、鼻病毒、cocksackie病毒、肠道病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎(hav、hbv、hcv、hev、hgv，例如，表面抗原)、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、狂犬病病毒和水痘-带状疱疹病毒。86.可用作本文所述的第二抗原的合适病毒抗原还包括病毒非结构蛋白，例如，由不编码结构多肽的病毒核酸编码的蛋白质，与制造衣壳或病毒周围蛋白质的那些相反。非结构蛋白包括促进病毒核酸复制、病毒基因表达或翻译后加工的那些蛋白，例如来自委内瑞拉马脑炎(vee)、东方马型脑炎(eee)或塞姆利基森林的非结构蛋白1、2、3和4(分别为ns1、ns2、ns3和ns4)。87.可用作本文所述的第二抗原的细菌抗原可以来源于例如，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、牛链球菌(streptococcusbovis)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、肉毒梭状芽胞杆菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(clostridiumdifficile)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、百日咳博代氏杆菌(bordetellapertussis)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、支原体(mycoplasmsp.)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、斑疹伤寒立克次氏体(rickettsiatyphi)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)和痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)、霍乱弧菌(例如，霍乱毒素亚基b、霍乱毒素共调菌毛(tcp))；幽门螺杆菌(例如，vaca、caga、nap、hsp、过氧化氢酶、脲酶)；大肠杆菌(e.coli)(例如，不耐热肠毒素、菌毛抗原)。88.如本文所述的可用作第二抗原的寄生虫抗原可以来源于例如，蓝氏贾第鞭毛虫(giardialamblia)、利什曼原虫(leishmaniasp.)、锥虫(trypanosomasp.)、毛滴虫(trichomonassp.)、疟原虫(plasmodiumsp.)(例如，恶性疟原虫(p.falciparum)表面蛋白抗原，如pfs25、pfs28、pfs45、pfs84、pfs48/45、pfs230、pvs25和pvs28)；血吸虫(schistosomasp.)；结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)(例如，ag85、mpt64、esat-6、cfp10、r8307、mtb-32mtb-39、csp、lsa-1、lsa-3、exp1、ssp-2、salsa、starp、glurp、msp-1、msp-2、msp-3、msp-4、msp-5、msp-8、msp-9、ama-1、1型整合膜蛋白、resa、eba-175和dba)。89.如本文所述的可用作第二抗原的真菌抗原可以来源于例如，足癣(tineapedis)、体癣(tineacorporus)、股癣(tineacruris)、甲癣(tineaunguium)、卡氏支孢霉(cladosporiumcarionii)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、念珠菌(candidasp.)、烟曲霉(aspergillusfumigatus)和卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)。90.如本文所述，可用作第二抗原的癌症抗原包括例如在结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、白血病或淋巴瘤中表达或过度表达的抗原。示例性的癌症抗原包括例如，hpvl1、hpvl2、hpve1、hpve2、胎盘碱性磷酸酶、afp、brca1、her2/neu、ca15-3、ca19-9、ca-125、cea、hcg、尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)、纤溶酶原激活剂抑制剂、cd53、cd30、cd25、c5、cd11a、cd33、cd20、erbb2、ctla-4。关于另外的癌症靶标，参见sliwkowski&mellman(2013)science341:6151。91.虽然减毒腺病毒可用于表达sars-cov-2n蛋白和第二抗原蛋白(例如，以产生cd8t细胞反应)，但也可使用其他多核苷酸或载体。表达载体可以包括例如，病毒来源的载体，例如重组腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、改良安卡拉痘苗(mva)载体和慢病毒(例如，来源于hsv-1的)载体(参见例如，brouardetal.(2009)britishj.pharm.157:153)。在其他实施方案中，sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2)和第二抗原蛋白可以由多核苷酸编码，例如，裸的或包封的dna或rna，例如，mrna(关于基于rna的疫苗的不同方面的细节，参见例如第2020/0254086号美国专利公开)。92.在一些实施方案中，包含编码sar-cov-2n蛋白的区域和编码第二抗原蛋白的区域的载体还包含编码tlr激动剂(例如，tlr-3激动剂)的核酸，当结合载体如病毒载体给药时，其可作为有效的佐剂。93.在一些实施方案中，载体包含位于编码n蛋白的核酸的区域和编码第二抗原蛋白的区域之间的核糖体跳跃元件。在一些实施方案中，载体包含位于n蛋白和第二抗原蛋白之间的ires，以产生双顺反子转录物。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码病毒2a肽(t2a)、猪捷申病毒-12a肽(p2a)、口蹄病病毒2a肽(f2a)、马甲型鼻炎病毒2a肽(e2a)、质型多角体病毒2a肽(bmcpv2a)或家蚕软化病病毒2a肽(bmifv2a)的序列；位于n蛋白和第二抗原蛋白之间。在一些实施方案中，构建体还编码tlr激动剂。94.在一些实施方案中，载体，例如病毒载体，编码sars-co-v2n蛋白(例如，seqidno:2的n蛋白序列或其变体，例如，与seqidno:2具有至少90％同一性或至少95％同一性的那些)和第二抗原蛋白，其中n蛋白和第二抗原蛋白的表达由不同的启动子驱动。95.在一些实施方案中，载体包含与编码sars-cov-2n蛋白的多核苷酸序列可操作地连接的第一启动子和与第二抗原蛋白可操作地连接的第二启动子。在一些实施方案中，载体，例如，病毒载体，还可以包含与tlr激动剂，例如，tlr-3激动剂可操作地连接的第三启动子。96.在特定的实施方案中，表达盒中元件从n端到c端的顺序为：编码抗原蛋白的序列、编码sars-co-v2n蛋白的序列和编码tlr激动剂的序列，例如，tlr3激动剂。97.在其他实施方案中，抗原蛋白可与n蛋白序列融合，例如，融合蛋白可含有抗原蛋白、furin位点和sars-cov-2n蛋白，或者以上的变体，例如，与seqidno:2具有至少90％同一性或至少95％同一性的那些。98.在一些实施方案中，通过载体编码的sars-cov-2n蛋白与seqidno:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，通过载体编码的n蛋白与seqidno:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。99.在一些实施方案中，载体包含如本文所述的表达盒，其中第二抗原蛋白取代本文提供的编码n蛋白和sars-cov-2s蛋白的构建体中的sars-cov-2s蛋白。因此，例如，在一些实施方案中，载体包含如下所示的序列(5’‑3)：cmv-第二抗原蛋白-bgh-β肌动蛋白-n蛋白-spa-bgh-cmv-dsrna-spa其中“cmv”是cmv启动子；“第二抗原蛋白”是编码第二抗原蛋白的核酸序列，例如，来自传染性疾病试剂或如本文所述的癌症抗原，“bgh”是牛生长激素聚腺苷酸化信号序列”；“β肌动蛋白”是β-肌动蛋白启动子，例如，人类β-肌动蛋白启动子；“n-蛋白”是如本文所述的编码sars-cov2n蛋白的核酸序列，例如，seqidno:2，或者与seqidno:2具有至少90％同一性或至少95％同一性的蛋白，“spa”是合成的多聚a序列，并且“dsrna”是编码tlr激动剂，例如，tlr-3激动剂的核酸序列。100.在一些实施方案中，来自替代冠状病毒的n蛋白被用于代替包含n蛋白和抗原蛋白，如传染性疾病抗原或癌症抗原的构建体中的sars-cov-2n蛋白。因此，例如，在一些实施方案中，这样的构建体可以包含sars-cov或mersn蛋白。101.在一些实施方案中，载体是如下所述的腺病毒载体，例如，腺病毒5(ad5)载体。合适的腺病毒载体102.在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒载体是腺病毒5(ad5)，其可以包括例如，具有e1/e3区的缺失的ad5和具有e4区的缺失的ad5。其他合适的腺病毒载体包括毒株2、经口测试的毒株4和7、肠腺病毒40和41，以及足以递送抗原并引发针对转基因抗原的适应性免疫应答的其他毒株(例如ad34)(lubecketal.,procnatlacadsciusa,86(17),6763-6767(1989)；shenetal.,jvirol,75(9),4297-4307(2001)；baileyetal.,virology,202(2),695-706(1994))。在一些实施方案中，腺病毒载体是活的没有复制能力的腺病毒载体(如e1和e3缺失的rad5)、活的且减毒的腺病毒载体(如e1b55k缺失病毒)，或者具有野生型复制的活的腺病毒载体。103.用于体内转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可以由病毒源提供。例如，常用的启动子和加强子来源于例如，β-肌动蛋白、腺病毒、猿病毒(sv40)和人类巨细胞病毒(cmv)。例如，允许在cmv启动子、β-肌动蛋白启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、转导启动子或在哺乳动物细胞中显示有效表达的其他启动子的指导下表达蛋白质的载体是合适的。可以使用其他病毒基因组启动子、控制和/或信号序列，只要这样的控制序列与所选的宿主细胞相容。104.可在本文所述的嵌合腺病毒载体中使用各种启动子。在一些实施方案中，当嵌合腺病毒载体表达两种或更多种核酸时，用于表达核酸的启动子可以是相同的或不同的。例如，在一些实施方案中，用于表达元件(a)的第一启动子和用于表达元件(b)的第二启动子可以都是cmv启动子，或者两种启动子可以是不同的，例如，一种启动子是cmv启动子，并且另一种启动子是β-肌动蛋白启动子。在其他实施方案中，当包括元件(c)时，第三启动子可以是相同的，或者与第一和/或第二启动子不同。例如，第一启动子和第二启动子可以都是cmv启动子，并且第三启动子可以是β-肌动蛋白启动子(例如，人类β-肌动蛋白启动子)。105.技术人员另外还理解，表达如本文所述的多肽的表达盒可以包含另外的调控元件，如聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素聚腺苷酸化信号，以及调控表达的其他序列，如终止子序列或rna稳定元件。tlr激动剂106.本文所述的嵌合腺病毒载体还可以包括编码toll样受体(tlr)激动剂的核酸，其在结合病毒载体给药时可以用作有效的佐剂。tlr激动剂可用于加强针对sars-cov-2蛋白的免疫应答。在一些实施方案中，使用tlr-3激动剂。在一些实施方案中，本文所述的tlr激动剂可以与编码目标抗原(例如，sars-cov-2蛋白)的表达载体同时递送。在其他实施方案中，tlr激动剂可以与编码目标抗原(例如，sars-cov-2蛋白)的表达载体分开(即在时间上或空间上)递送。例如，表达载体可以经由非肠胃外途径(例如，经口、鼻内或粘膜)给药，而tlr激动剂可以通过肠胃外途径(例如，肌肉内、腹膜内或皮下)递送。107.在特定的实施方案中，tlr-3激动剂可用于刺激目标抗原的免疫识别。tlr-3激动剂包括例如，短发夹rna、病毒来源的rna、可以形成双链或短发夹rna的rna的短片段，以及短干扰rna(sirna)。在本公开的一实施方案中，tlr-3激动剂是病毒来源的dsrna，如来源于辛德毕斯病毒的dsrna或dsrna病毒中间体(alexopoulouetal,nature413:732-8(2001))。在一些实施方案中，tlr-3激动剂是短发夹rna。短发夹rna序列通常包含通过接头序列连接的两条互补序列。特定的接头序列不是本公开的关键方面。可以使用任何合适的接头序列，只要它不干扰两条互补序列的结合以形成dsrna即可。108.在一些实施方案中，tlr-3激动剂可以包含与seqidnos:11-18所示的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列。在特定的实施方案中，tlr-3激动剂包含seqidno:11的序列。在某些实施方案中，作为tlr-3激动剂的dsrna不编码特定多肽，但当在体外或体内与应答细胞(例如，树突细胞、外周血单核细胞或巨噬细胞)接触时产生促炎细胞因子(例如il-6、il-8、tnf-α、ifn-α、ifn-β)。109.在特定的实施方案中，本文所述的tlr激动剂(例如，tlr-3激动剂)可以在编码sars-cov-2蛋白的同一表达载体内同时递送。在其他实施方案中，tlr激动剂(例如，tlr-3激动剂)可以与编码sars-cov-2蛋白的表达载体分开(即在时间上或空间上)递送。在一些情况下，当tlr-3激动剂与表达载体分开递送时，编码tlr-3激动剂的核酸(例如，表达的dsrna)和包含编码sars-cov-2蛋白的核酸的嵌合腺病毒载体可以在同一制剂中给药。在其他情况下，编码tlr-3激动剂的核酸和包含编码sars-cov-2蛋白的核酸的嵌合腺病毒载体可以在不同的制剂中给药。当编码tlr-3激动剂的核酸和包含编码sars-cov-2蛋白的核酸的腺病毒载体在不同的制剂中给药时，它们的给药可以是同时的或顺序的。例如，可以首先给予编码tlr-3激动剂的核酸，然后给予嵌合腺病毒载体(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时、2、4、6、8或10天后)。可选地，可以首先给予腺病毒载体，然后给予编码tlr-3激动剂的核酸(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时、2、4、6、8或10天后)。在一些实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸和编码sars-cov-2蛋白的核酸处于相同启动子的控制下。在其他实施方案中，编码tlr-3激动剂的核酸和编码sars-cov-2蛋白的核酸在不同启动子的控制下。iv.药物组合物和给药途径110.免疫原性药物组合物可含有本文所述的嵌合腺病毒载体和药学上可接受的载体。合适的载体包括例如，水、盐水、醇、脂肪、蜡、缓冲剂、固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁，或者可生物降解的微球体(例如，聚乳酸聚乙醇酸酯)。合适的可生物降解微球体公开于例如第4,897,268号；第5,075,109号；第5,928,647号；第5,811,128号；第5,820,883号美国专利中。免疫原性多肽和/或载体表达载体可以包封在可生物降解的微球内或与微球的表面结合。111.免疫原性药物组合物中的成分与以下因素密切相关，诸如但不限于免疫原性药物组合物的给药途径、药物释放的时间线和/或持续时间以及靶向递送位点。在一些实施方案中，制剂的延迟释放包衣或另外的包衣可以包含出于技术原因或药物释放的计时控制而对管腔条件不敏感的其他成膜聚合物。用于此类目的的材料包括但不限于：单独使用或混合使用的糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。112.添加剂如分散剂、着色剂、颜料、另外的聚合物，例如，聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯)、抗粘剂和防起泡剂，可以包括在包衣层中。可以添加其他化合物以增加膜厚度并减少酸性胃液扩散到核心材料中。包衣层还可以含有药学上可接受的增塑剂以获得所需的机械特性。这种增塑剂例如但不限于三乙酸甘油酯、柠檬酸酯、邻苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、鲸蜡醇、聚乙二醇、甘油单酯、聚山梨醇酯或其他增塑剂，以及以上的混合物。增塑剂的量可以针对每种配方进行优化，并且与所选择的聚合物、所选择的增塑剂和所述聚合物的施用量有关。113.此类免疫原性药物组合物还可包含非免疫原性缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂如edta或谷胱甘肽、佐剂(例如，氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选地，本公开的组合物可以作为冻干物配制。化合物也可以使用熟知的技术包封在脂质体内。114.此外，可以制备药物组合物以防止胃降解，使得给予的免疫原性生物剂到达所需位置。dna的微胶囊化方法和用于经口递送的药物描述于例如us2004043952中。对于经口环境，这些方法中的几种是可用的，包括eudragit和timeclock释放系统以及专门针对腺病毒设计的其他方法(lubecketal.,procnatlacadsciusa,86(17),6763-6767(1989)；chourasia和jain,jpharmpharmsci,6(1),33-66(2003))。在一些实施方案中，eudragit系统可用于将deliverthe嵌合腺病毒载体至下小肠。115.在特定的实施方案中，免疫原性组合物为片剂或胶囊的形式，例如为肠溶包衣覆盖的压缩片剂的形式。在一些实施方案中，将免疫原性组合物包封在包含明胶、羟丙基甲基纤维素、淀粉或普鲁兰的聚合物胶囊中。在一些实施方案中，免疫原性组合物是直径小于2mm的微粒的形式，例如，每个微粒覆盖有如本文所述的肠溶包衣。在特定的实施方案中，片剂、胶囊或微粒形式的免疫原性组合物可以经口给药。在一些实施方案中，可以经由在外部产生的信号下释放的片剂或胶囊来实现位点特异性递送。发布的高频(hf)信号的早期模型如digenisetal.(1998)pharm.sci.tech.today1:160中所公开的。最初的hf胶囊概念自此已经更新，并且结果作为上市。更新的胶囊是一种射频激活、不崩解的递送系统。胶囊的放射性标记允许经由γ闪烁扫描法确定胶囊在gi道的特定区域内的位置。当胶囊到达gi中所需的位置时，外部激活会打开一系列通向胶囊药物储存器的窗口。116.在一些实施方案中，免疫原性组合物可以被封闭在无线电控制的胶囊中，使得一旦胶囊到达递送位点，其即被跟踪并发送信号。在一些实施方案中，胶囊在对应于胶囊在有或没有检测的情况下预计到达递送位点处的时间的给药后的给定时间被发送信号。117.本文所述的组合物可以作为缓释制剂(即在给药后使化合物缓慢释放的制剂如胶囊或海绵)的一部分给药。这种制剂通常可以使用熟知的技术制备(参见例如，coombesetal.(1996)vaccine14:1429-1438)。缓释制剂可以包含分散在载体基质中和/或包含在由速度控制膜包围的储存器内的多肽、多核苷酸或抗体。118.在这样的制剂中使用的载体是生物相容的，并且也可以是可生物降解的；优选地，制剂提供相对恒定水平的活性组分释放。这种载体包括聚(丙交酯-乙交酯共聚物)，以及聚丙烯酸酯、乳胶、淀粉、纤维素和葡聚糖的微粒。其他延迟释放载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水性核心(例如，交联的多糖或寡糖)和任选地包含两亲性化合物的外层(参见例如，wo94/20078；wo94/23701；以及wo96/06638)。缓释制剂内所含活性化合物的量取决于植入位点、释放速率和预期持续时间，以及待治疗或预防的病况的性质。119.在一些实施方案中，免疫原性组合物存在于单位剂量或多剂量容器中，如密封的安瓿或小瓶。这种容器优选是密封的，以便保持制剂的无菌性直至使用。通常，制剂可以作为悬浮剂、溶液或乳剂储存在油性或水性媒介物中。可选地，免疫原性组合物可以在冷冻干燥条件下储存，只需要在即将使用前添加无菌液体载体。用于靶向递送的组合物120.在靶向递送的一些实施方案中，肠溶包衣用于保护物质免受胃的低ph环境的影响，并延迟封闭物质的释放，直到其稍后到达消化道中的所需目标。肠溶包衣是已知的，并且可商购获得。实例包括ph敏感聚合物、生物降解聚合物、水凝胶、时间释放系统和渗透递送系统(参见例如，chourasia&jain(2003)j.pharm.pharmaceuticalsci.6:33)。121.在一些实施方案中，靶向递送位点是回肠。胃肠道(git)的ph从胃中的非常酸性(ph～2)进展到回肠中的更中性(ph～5.8-7.0)。可以使用溶解在回肠中或刚好在回肠之前的ph敏感性包衣。实例包括l和s聚合物(阈值ph范围为5.5-7.0)；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(ph5.0)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯50和55(ph分别为5.2和5.4)，以及醋酸邻苯二甲酸纤维素(ph5.0)。。thakraletal.(2013)expertopin.drugdeliv.10:131回顾了用于回肠递送的制剂，特别是l和s的组合，其确保在ph≤7.0下递送。crottsetal.(2001)eur.jpharm.biol.51:71描述了具有适当崩解特性的制剂。vijayetal.(2010)j.mater.sci.mater.med.21:2583回顾了在ph6.8下用于回肠递送的基于丙烯酸(aa)-甲基丙烯酸甲酯(mma)的共聚物。122.对于回肠递送，聚合物包衣通常在约ph6.8下溶解，并允许在约40min内完全释放(参见例如，huyghebaertetal.(2005)int.j.pharm.298:26)。为了实现这一点，治疗物质可被覆盖在不同包衣层中，例如，使得最外层在低ph条件下保护物质，并在片剂离开胃时溶解，并且作为片剂溶解的至少一个内层进入增加的ph中。例如，在wo2015/127278、wo2016/200951和wo2013/148258中描述了用于递送至远端回肠的分层包衣的实例。123.可生物降解聚合物(例如，果胶、偶氮聚合物)通常依赖于git中生活的微生物群的酶活性。回肠比早期阶段含有更大数量的细菌，包括乳酸杆菌和肠杆菌。124.渗透控释经口递送系统(alza)是渗透系统的一个实例，其在水性条件下随时间发生降解。这种材料可以用其他包衣操纵，或者以不同的厚度，以专门递送到回肠(参见例如，conleyetal.(2006)curr.med.res.opin.22:1879)。125.wo2000062820中报道了用于递送至回肠的组合聚合物。实例包括具有柠檬酸三乙酯(2.4mg/胶囊)的l100-55(25mg/胶囊)，以及柠檬酸三乙酯(2.4毫克/粒的)，以及跟随聚维酮k-25(20mg/片剂)的fs30d(30mg/片剂)。如上所述，ph敏感性聚合物可应用于实现向回肠的递送，并且例如，甲基丙烯酸共聚物(例如，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1)、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、偏苯三酸乙酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、虫胶或其它合适的聚合物。包衣层也可以由对ph以外的其他管腔组分敏感的成膜聚合物组成，如细菌降解，或者当其与另一成膜聚合物混合时具有这种敏感性的组分。提供到回肠的延迟释放的此类组分的实例是包含偶氮键的聚合物、多糖如果胶及其盐、半乳甘露聚糖、直链淀粉和软骨素、二硫化物聚合物和糖苷。126.具有不同ph、水和酶敏感性的组分可以组合使用，以将治疗组合物靶向回肠。包衣的厚度也可用于控制释放。组分还可用于形成基质，治疗组合物嵌入所述基质中。通常参见frontiersindrugdesign&discovery(benthamsciencepub.2009)，第4卷。佐剂127.在本公开的一些实施方案中，除了在嵌合腺病毒载体中编码的tlr激动剂(例如，tlr-3激动剂)之外，组合物还可以包含另外的佐剂。合适的佐剂包括例如，脂质和非脂质化合物、霍乱毒素(ct)、ct亚基b、ct衍生物ctk63、大肠杆菌热不稳定肠毒素(lt)、lt衍生物ltk63、al(oh)3和例如wo04/020592、anderson和crowle,infect.immun.31(1):413-418(1981)、rotermanetal.,j.physiol.pharmacol.,44(3):213-32(1993)、arora和crowle,j.reticuloendothel.24(3):271-86(1978)，以及crowle和may,infect.immun.38(3):932-7(1982))中描述的聚离子有机酸。合适的聚离子有机酸包括例如，6,6’‑[3,3’‑二甲基[1,1’‑联苯]-4,4’‑二基]双(偶氮)双[4-氨基-5-羟基-1,3-萘-二磺酸](伊文思蓝)和3,3’‑[1,1’联苯]-4,4’‑二基双(偶氮)双[4-氨基-1-萘磺酸](刚果红)。本领域技术人员将理解，聚离子有机酸可用于结合任何类型的给药的任何遗传疫苗接种方法。[0128]其他合适的佐剂包括局部免疫调节剂，如咪唑并喹啉家族的成员，诸如例如咪喹莫特和雷西莫特(参见例如，henggeetal.,lancetinfect.dis.1(3):189-98(2001)。[0129]另外的合适的佐剂是可商购获得的，例如，作为另外的基于明矾的佐剂(例如，alhydrogel、rehydragel、磷酸铝、algammulin)；油基佐剂(弗氏不完全佐剂和完全佐剂(difcolaboratories,detroit,mich.)、specol、ribi、titermax、montanideisa50或seppicmontanideisa720)；基于非离子嵌段共聚物的佐剂、细胞因子(例如，gm-csf或flat3-配体)；merck佐剂65(merckandcompany,inc.,rahway,n.j.)；as-2(smithklinebeecham,philadelphia,pa.)；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；单磷酸脂质a和quila。细胞因子，如gm-csf或白细胞介素-2、白细胞介素-7或白细胞介素-12，也是合适的佐剂。血蓝蛋白(例如，钥孔戚血蓝蛋白)和血红蛋白也可用于本公开中。多糖佐剂，诸如例如几丁质、壳聚糖和脱乙酰基几丁质也适合作为佐剂。其他合适的佐剂包括胞壁酰二肽(mdp，n乙酰胞壁酰l丙氨酰d异谷氨酰胺)细菌肽聚糖及其衍生物(例如，苏氨酰-mdp和mtppe)。bcg和bcg细胞壁骨架(cws)也可用作本公开中的佐剂，其具有或不具有海藻糖二霉菌酸酯。海藻糖二霉菌酸酯本身可以使用(参见例如，第4,579,945号美国专利)。解毒内毒素也可单独或与其他佐剂组合用作佐剂(参见例如，第4,866,034号；第4,435,386号；第4,505,899号；第4,436,727号；第4,436,728号；第4,505,900号；以及第4,520,019号美国专利。皂苷qs21、qs17、qs7也可用作佐剂(参见例如，第5,057,540号专利专利；ep0362279；wo96/33739；以及wo96/11711)。其他合适的佐剂包括montanideisa720(seppic,france)、saf(chiron,calif.,unitedstates)、iscoms(csl)、mf-59(chiron)、sbas系列佐剂(例如，sbas-2、sbas-4或sbas-6或其变体，可从smithklinebeecham,rixensart,belgium获得)、detox(corixa,hamilton,mont.)和rc-529(corixa,hamilton,mont.)。[0130]在本文提供的药物组合物中，佐剂组合物可被设计为诱导例如主要为th1或th2型的免疫应答。高水平的th1型细胞因子(例如，ifn-γ、tnf-α、il-2和il-12)倾向于有利于诱导细胞介导的对所给予抗原的免疫应答。相反，高水平的th2型细胞因子(例如，il-4、il-5、il-6和il-10)倾向于有利于诱导体液免疫应答。在经口递送包含本文所提供的免疫原性多肽的组合物之后，通常会引发包括th1和th2型应答在内的免疫应答。给药途径[0131]包含嵌合腺病毒载体的组合物可以通过任何非肠胃外途径给药(例如，经由例如阴道、肺、唾液腺、鼻腔、小肠、结肠、直肠、扁桃体或派伊尔结的经口、鼻内或粘膜)。组合物可以单独给药或与如上所述的佐剂一起给药。在特定的实施方案中，免疫原性组合物以片剂或胶囊的形式经口给药。在其他实施方案中，免疫原性组合物以片剂或胶囊的形式经口给药，以靶向递送至回肠中。v.治疗应用[0132]本公开的一方面涉及使用本文所述的免疫原性组合物来在受试者中引发针对sars-cov-2蛋白(例如，具有seqidnos:1、2或10的序列的sars-cov-2蛋白)的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，在受试者的肺泡细胞、吸收性肠细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发免疫应答。如本文所用，“受试者”是指任何温血动物，诸如例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物，优选人类。免疫原性组合物可在对象发展covid-19之前使用，以预防疾病。疾病可以使用本领域普遍接受的标准进行诊断。例如，可以通过测量来自受试者的生物样品(例如，鼻孔拭子或粘膜样品)中的病毒滴度来诊断病毒感染。[0133]如实施例中所示的，本文所述的疫苗可显著有效地触发cd4+和cd8+t细胞免疫应答。在一些实施方案中，这种显著的t细胞反应，例如cd8+t细胞反应，可以由sars-cov-2n蛋白(例如，seqidno:2或其实质上相同的变体)的存在触发，其起刺激t细胞反应的作用，包括针对第二抗原蛋白(其在该实例中为sars-cov-2s蛋白，但其可以是不同的sars-cov-2蛋白，或者如在下文中更详细讨论的，非sars-cov-2蛋白)的cd8+t淋巴细胞反应。因此，在一些实施方案中，如本文所述的导致sars-cov-2n蛋白以及第二抗原蛋白表达的疫苗可用于在受试者，例如人类受试者中触发包括cd8+t细胞反应在内的免疫应答。在一些实施方案中，人类受试者是发展基于抗体的免疫应答的能力较低或在其他情况下将从cd8+t细胞免疫应答受益的受试者。示例性受试者可以包括但不限于：老年人，例如，年龄为至少50岁、至少60岁或至少70岁，或者患有抗体缺乏症的那些(关于其描述，参见例如，angela.justizvaillant；kamleshunramphul,antibodydeficiencydisorer(treasureisland(fl):statpearlspublishing；2020))，其可包括但不限于患有x连锁无丙种球蛋白血症(bruton病)、新生儿的短暂性低丙种球蛋白血症、选择性ig免疫缺陷，例如iga选择性缺陷、超级igm综合征和常见的可变免疫缺陷病症的受试者。[0134]免疫疗法通常是主动免疫疗法，其中治疗依赖于体内刺激内源性宿主免疫系统针对例如病毒感染细胞作出反应，给予包含本文所述的嵌合腺病毒载体的免疫原性组合物。[0135]本文所述的免疫原性组合物的给药频率以及剂量将因个体而异，并且可以使用标准技术容易地确立。在一些实施方案中，可以在52周时间段内给予1-10剂(例如，2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2剂)剂量。在一些实施方案中，以1个月的间隔给予2或3剂剂量；或者例如，每2-3个月给予2-3剂剂量。对于某些治疗，间隔时间可能是每年一次。此后可定期给予加强疫苗接种。[0136]合适的剂量是一定量的化合物，例如，当按如上所述给药时，其能够促进抗病毒免疫应答，并且比基础(即未治疗的)水平高至少10％-50％。这种应答可以通过测量患者中的抗病毒抗体或通过能够在体外杀伤例如患者的病毒感染细胞的细胞溶解性t细胞的疫苗依赖性生成来监测。免疫原性应答也可以通过检测在免疫原性多肽和体液中对免疫原性多肽具有特异性的抗体之间形成的免疫复合物来测量。可以分析在开始治疗之前和之后从个体采集的体液样品的免疫复合物。简言之，可以比较在两种样品中检测到的免疫复合物的数量。第二样品(治疗开始后)中免疫复合物的数量相对于第一样品(治疗前)的实质变化反映了治疗的成功。与未接种疫苗的患者相比，此类疫苗还应能够引起致在接种疫苗的患者中预防covid-19疾病的免疫应答。[0137]示例性剂量可以以感染单位(i.u.)测量。复制缺陷型重组ad5载体可以使用i.u.单位进行滴定和定量。这是通过在粘附的人胚胎肾(hek)293细胞系中进行iu测定来实现的，该细胞系允许复制缺陷型ad5的生长。将hek293细胞接种在24孔无菌组织培养板中，并允许其粘附。将病毒物质在连续10倍稀释液中稀释，并以适当数量的重复，通常以一式两份或一式三份感染到接种的hek293细胞的单个孔中。经由在37c、5％co2下孵育～40-42小时来允许进行感染。然后用甲醇固定细胞，以允许渗透、洗涤，并用含有牛血清白蛋白(bsa)的缓冲溶液封闭。然后，将细胞与兔来源的针对ad5六邻体表面蛋白的一抗一起孵育，洗涤，并再次用hrp缀合的抗兔二抗探测。然后经由用3,3′‑二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)和过氧化氢孵育来对受感染的细胞进行染色。使用相差显微镜可视化受感染的细胞，并选择表现出谨慎的单个感染事件的稀释液–这些感染事件可看见为深色染色的细胞，其针对未感染细胞的半透明单层是高度可见的。在适当稀释的至少十个视野中，对每个视野的总感染细胞进行计数。可以使用这些计数的平均数，结合所用物镜/目镜放大的视野总数，并乘以计数中使用的稀释因子，来计算病毒滴度。[0138]在一些实施方案中，所给予的疫苗可以具有107-1011，例如，108-1011、109-1011、5x109-5x1010i.u的剂量。合适的剂量大小将随着患者的尺寸而变化，但对于注射的疫苗，通常在约0.01ml至约10ml的范围内，更典型地在约0.025ml至约7.5ml的范围内，最典型地为约0.05ml至约5ml。对于片剂或胶囊的最终产品，大小将在10mg-1000mg之间，最典型地在100-400mg之间。本领域技术人员将理解，剂量大小可以基于特定患者或正在治疗的特定疾病或病症来调整。实施例[0139]以下实施例旨在进行说明，但不限制本公开内容。实施例1.重组腺病毒构建体的产生[0140]除了使用不同的抗原外，使用与先前临床评估的载体平台(14,15)相同的载体平台开发了几种不同的重组腺病毒(rad)构建体来预防sars-cov-2感染。通过标准方法(例如，如he,etal(50)所述的)产生了几种radsars-cov-2疫苗。[0141]基于已发表的sars-cov-2的dna序列创建了三种疫苗构建体，该序列可作为genbank登录号mn908947.3公开获得。具体而言，使用已发表的sars-cov-2s蛋白(或表面糖蛋白；以下seq1)和sars-cov-2n蛋白(或核衣壳磷蛋白；以下seq2)的氨基酸序列来合成针对在智人细胞中表达进行密码子优化的核酸序列。针对sars-cov-2s基因和sars-cov-2n基因进行密码子优化的核酸序列分别显示在seqidnos:3和4中。这些序列用于创建包含克隆到5型腺病毒的e1区中的转基因的重组质粒(pad)。[0142]使用来自sars-cov-2的序列构建了两种重组pad质粒：n-spa-bgh-cmv-dsrna-spa)将在gmp设施中制造、干燥并放入片剂中。一项人体试验将评估rad-s-n在不同剂量水平下在人类中引发免疫应答的能力。实施例5.重组腺病毒粘膜疫苗预防sars-cov-2感染的临床前研究前言[0149]在2019年，一种新型冠状病毒，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)‑‑covid-19疾病的病原体的出现，导致了全球大流行，并导致了一个世纪以来从未有过的重大发病率、死亡率和社会经济破坏。冠状病毒疾病2019(covid-19)是一种严重程度不同的呼吸道疾病；范围从无症状感染到轻度感染，发烧和咳嗽到严重肺炎和急性呼吸困难1。目前的报告表明，无症状传播是大量的(2)，并且sars-cov-2感染在大多数个体中诱导短暂的抗体反应(3)。因此，开发成功的干预措施是保护全球人口免受这种病毒的感染和传播及其相关临床和社会后果的迫切要求。利用有效疫苗的大规模免疫接种在预防许多其他传染病传播方面非常成功，并且也可以通过诱导群体免疫来预防易感人群中的疾病。正在投入大量努力和资源紧急确定有效的sars-cov-2疫苗。许多不同的疫苗平台已经证明了临床前的免疫原性和针对肺炎的疗效(4,5)；并且几种疫苗已经证明了i期或ii期安全性和免疫原性(6-8)。一些平台在该领域的效力也已确立。[0150]最先进的sars-cov-2候选疫苗都是通过肌肉内(im)途径给予的，有些需要-80℃储存。在人们被要求保持社交距离并避免聚集的大流行期间，这是疫苗散播和部署的主要障碍。任何疫苗运动的最终目标都是通过提供足够的群体免疫来抑制病毒传播，而不是制造一定数量剂量的疫苗来预防疾病。注射的溶液花费很长一段时间来管理和分发，并且需要昂贵的物流，这意味着剂量的可用性不会立即转化为免疫力。此外，全身免疫可以在外周和下呼吸道中诱导免疫。然而，这些疫苗不能在上呼吸道中诱导粘膜免疫，正如报导的来自vandoremalen,etal.,4mucosaliga(具有聚合物结构并添加分泌组分)的不良粘膜iga所证明的，产生更有效的病毒中和作用(9)，可以阻断病毒传播(10,11)，并且一般来说，更可能产生杀菌免疫力，考虑到这是针对呼吸道病原体的第一道防线。[0151]粘膜疫苗可以在湿润的表面处诱导粘膜免疫应答、抗体和t细胞。我们正在开发针对多种适应症，包括流感和诺如病毒的经口疫苗，以片剂形式递送给人们。我们的疫苗平台是一种复制缺陷的5型腺病毒载体疫苗，它表达抗原以及作为佐剂的一种新型toll样受体3激动剂。这些疫苗具有良好的耐受性，并且能够产生针对表达的抗原的强大的体液和细胞免疫应答(12-14)。如特征明确的实验性流感感染模型(15)中所示的，证明了在接种疫苗后90天或更长时间内，人类中针对呼吸道病毒的保护效力。此外，该疫苗还具有室温稳定性和无针、易于给药的优点，在疫苗部署和获取方面提供了优于注射疫苗方法的几项优点。[0152]在这里，我们描述了基于vaxart经口腺病毒平台的sars-cov-2疫苗的临床前开发。关键的方法是并行开发几种候选疫苗，以便在进行初步免疫原性实验的同时产生预生产种子。鉴于疫苗是在大流行期间制造的，需要迅速做出决定，以防止生产和监管时间线的下滑。我们评估了四种表达基于刺突(s)和核衣壳(n)sars-cov-2蛋白的抗原的候选疫苗的相对免疫原性。这些蛋白质已被很好地表征为相关冠状病毒如sars-cov和mers的抗原(在yong,etal.,(16)中进行了综述)，以及越来越多的sars-cov-2刺突的抗原。我们的疫苗的目的是在三个水平上诱导免疫原性；首先，诱导针对s的强效血清中和抗体，其次，诱导粘膜免疫应答，以及第三，诱导针对两种疫苗抗原的t细胞反应。这种三重方法旨在诱导强大且广泛的免疫力，能够保护个体免受病毒感染以及疾病的影响，在大流行期间促进疫苗的快速散播，并通过群体免疫保护人群免于病毒传播。[0153]在这里，我们报导了中和抗体(nab)、igg和iga抗体应答，以及表达一种或多种sars-cov-2抗原的rad载体免疫后小鼠中的t细胞反应的诱导。结果载体构建[0154]最初，构建了三种不同的rad载体来表达不同的sars-cov-2抗原。这些是表达全长s蛋白的载体(rad-s)、表达s蛋白和n蛋白的载体(rad-s-n)，以及表达s1结构域与n蛋白的融合蛋白的载体(rad-s1-n)。rad-s-n的n蛋白在人类β肌动蛋白启动子的控制下表达，该启动子在人类细胞中比小鼠细胞更有效。在较晚的日期构建了另外的构建体，其中表达的s蛋白以预融合构象固定(rad-s(固定的)-n)，作为探索中和抗体应答的对照。这些描绘在图4中。在293细胞感染后，使用流式细胞术和针对s或n蛋白的单克隆抗体确认各种转基因的表达。表达s和n抗原的rad载体的免疫原性[0155]最初小鼠免疫原性研究的主要目的是确定哪种rad载体诱导了针对s的显著抗体应答，以及足够迅速获得这些结果，以便及时提供gmp种子用于生产。我们和其他人(17)已经观察到，经口给予小鼠的疫苗载体的转基因表达可以在其肠道环境中受到抑制，因此在鼻内(i.n.)免疫后评估免疫原性。对动物进行i.n.免疫，并通过iggelisa测量抗体滴度随时间的变化。在第2周和第4周，所有三种rad载体诱导了几乎相等的抗s1igg滴度，并且通过第二次免疫显著加强了所有动物中的igg滴度(p《0.05，曼-惠特尼t检验)(图5a)。然而，相比仅表达s1的载体，表达全长s(rad-s-n)的载体诱导较高的中和滴度(图5b)。这是通过两种不同的中和测定来测量的，一种基于vero细胞的sars-cov-2感染(cvnt)，并且一种基于替代中和测定(svnt)。此外，与最终免疫两周后的rad-s1-n相比，rad-s-n诱导了更高的针对s1，以及毫不奇怪地，针对s2的肺iga应答(图5c)。值得注意的是，与含有s1的疫苗(rad-s1-n)相比，当使用rad-s-n时，肺中的中和滴度也显著更高(图5d)。这表明，与仅含有s1结构域的疫苗相比，rad-s-n候选物诱导了更大的功能性应答(nab和iga)。由于n蛋白比s蛋白的保守性要高得多，并且是感染诱导的长期t细胞反应的靶标(18)，因此选择载体rad-s-n用于gmp生产。[0156]然后测试三个剂量水平的rad-s-n，以理解该疫苗的剂量反应性。测量针对s1(图6a)和s2(图6b)的抗体应答。在所有时间点的所有三个剂量水平下都观察到类似的应答。在所有组中，与较早的时间相比，在第6周针对s1和s2的应答显著增加。[0157]然后评估不同剂量的rad-s-n对s特异性t细胞的诱导作用。在2次免疫后两周观察到产生效应细胞因子如ifn-γ、tnf-α和il-2的抗原特异性cd4+和cd8+t细胞的诱导(图7a)。值得注意的是，该疫苗诱导了很少的il-4，并且仅在cd4+t细胞中诱导；提供了一定程度的保证，即疾病的疫苗依赖性加强的风险非常低。此外，利用rad-s-n免疫诱导了双阳性和三阳性的多功能ifn-γ、tnf-α和il-2cd4+t细胞(图7b)。在最终免疫后4周(研究的第8周)，进行第二次剂量反应实验，以聚焦于针对s蛋白的t细胞反应。将脾细胞用分成两个单独的肽库的s蛋白肽库刺激过夜。将两个库中的t细胞反应相加并绘制(图7c)。与未处理的动物相比，给予1e7iu和1e8iu剂量水平的动物具有显著更高的t细胞反应，但产生彼此相似数量的ifn-γ分泌细胞，证明了1e7iu剂量的剂量平台。值得注意的是，该t细胞分析是在第二次免疫后4周进行的，可能是在t细胞反应峰值之后。相比稳定的/融合前s，rad表达的野生型s诱导更优的中和反应。[0158]进行了另外的研究，以将rad-s-n与s蛋白稳定并去除跨膜区的候选疫苗(rad-s(固定的)-n)进行比较。s蛋白的稳定形式已被提出作为一种改善中和抗体应答并产生较少非中和抗体的方式。如amanatetal.,(19)所述，通过修饰使s蛋白稳定。rad-s-n在两个测试时间点都诱导了针对s1的较高的血清igg滴度(图8a)，尽管这些在第6周通过曼-惠特尼检验在统计学上是不显著的(p＝0.067)。然而，相比稳定的形式，rad-s-n诱导了显著更高的中和抗体应答(图8b)(p＝0.0152)。这些结果表明，在小鼠中，对于基于rad的疫苗，s蛋白的野生型形式更优。讨论[0159]covid-19大流行的最后阶段需要识别和生产安全且有效的疫苗，并随后开展全球免疫运动。许多候选疫苗已加速进入iii期全球疗效测试，并且如果在这些试验中足够成功，可能会形成第一代免疫运动。然而，所有这些先进的候选物都是注射的基于s的疫苗。这种方法不太可能预防病毒传播，但应该可以预防肺炎和病毒在下呼吸道和外周的生长和损伤，正如在猕猴激发研究中所证明的(4,5)。[0160]全球covid-19免疫运动的一个关键制约因素将是冷链配送物流，以及需要经过适当培训的医疗护理工作者(hcws)来注射疫苗的瓶颈。目前的物流成本，包括冷链和培训，可能会使中低收入国家(lmic)中个体完全免疫的成本翻倍(20)。实施大规模免疫运动，需要训练有素的hcws来接种基于注射的疫苗，将对所有国家的医疗保健资源产生重大影响。对冷链、生物危险尖锐物废物处理和培训的需求将导致成本增加、疫苗获取不公平、疫苗吸收延迟和这一流行病的延长。如果疫苗无法提供长期保护(对其他β-冠状病毒的自然免疫力是短暂的(21))，并且需要每年进行基于注射的运动，这些成本将被放大。vaxart的经口片剂疫苗平台为这些免疫学以及物流、经济、获取和可接受性问题提供了解决方案。在这项研究中，我们在动物临床前模型中证明了使用vaxart疫苗平台的sars-cov-2疫苗的免疫原性；即血清和粘膜中和抗体以及多功能t细胞的诱导。[0161]小鼠研究被设计为在2020年春季快速测试候选疫苗的免疫原性，然后继续进行对解决大流行至关重要的生产和临床研究。vaxart的经口片剂疫苗平台先前已被证明能够在人体内产生针对几种不同病原体的可靠粘膜(呼吸和肠道)、t细胞和抗体应答(12,14,22,23)。我们从我们先前的人类流感病毒激发研究中了解到，经口免疫能够在免疫后90天诱导保护效力；与商业化的四价灭活疫苗不相上下(15)。这些特征提供了信心，即将该平台应用于covid-19可以转化为针对这种致病性冠状病毒的功效，并可以提供持久的针对病毒感染的保护。最后，片剂疫苗运动要容易得多，因为不需要合格的医疗支持来对其给药。这种易于给药将导致疫苗获取和潜在地可接受性的增加，正如易于给药的经口脊髓灰质炎疫苗在消灭脊髓灰质炎病毒方面的成功所证明的那样(24)。与其他疫苗相比，这些特征在sars-cov-2免疫运动期间甚至可能更为重要，因为考虑到covid-19否认、不信任和疫苗犹豫增加的全球水平(25,26)，可能需要实质上更多的资源来确保吸收这种疫苗。片剂疫苗不需要冰箱或冷冻柜，不需要针头或小瓶，并且可以潜在地经由标准邮件或通过无人机运送。这些品质显著加强了部署和配送物流，甚至允许进入技术资源较少的孤立地区。最后，从免疫学的角度来看，这种腺病毒的经口给药不会因针对腺病毒的预先存在的免疫力而受损，或者产生大量的抗载体免疫(12,13)，这些问题已被证明在基于rad5的sars-cov2疫苗中导致疫苗效力显著降低(27)，并且当通过im途径再次给予相同的腺病毒平台时，可能防止持久的免疫力增加(28)。[0162]在新的流行病期间，抗原的选择可能是困难的，在这个时候需要迅速做出关键决定。据信，s蛋白是冠状病毒疫苗的主要中和抗体靶标，因为该蛋白负责受体结合、膜融合和组织向性。当将sars-cov-2wu-1与sars-cov进行比较时，发现s蛋白具有76.2％的同一性(29)。据信，sars-cov和sars-cov-2都使用相同的受体进入细胞：血管紧张素转换酶2受体(ace2)，它在一些人类细胞类型上表达30。因此，到目前为止，sars–cov-2s蛋白被用作疫苗开发中的主要靶标抗原，并且是一种理想的靶标，因为它充当病毒与靶细胞结合的关键机制。然而，疫苗中对s蛋白和igg血清反应的总体依赖最终可能导致病毒逃逸。对于流感，血凝素结合蛋白，包括单个糖基化位点的较小变化，可能极大地影响注射疫苗的保护能力(31)。sars-cov-2似乎比大多数rna病毒更稳定，但在没有广泛分布的疫苗的选择性压力的情况下，已经观察到s蛋白突变。一旦疫苗压力开始，逃逸突变可能会出现。我们采取了两种方法来解决这一问题；首先在疫苗中包括更保守的n蛋白，且其次诱导更广泛的免疫应答，即通过粘膜iga。[0163]ace2的高表达水平存在于肺的ii型肺泡细胞、回肠和结肠的吸收性肠细胞中，并且甚至可能存在于口腔组织如舌头中(32)。据信，病毒的传播主要通过密切接触的未受保护的个体之间的呼吸道小滴和污染物发生(33)，尽管有一些证据表明经由口腔-粪便途径传播，如关于sars-cov和mers-cov病毒所见的，其中冠状病毒可以在来自感染人的粪便样本中分泌(34)。还有证据表明，存在的一部分个体有胃肠道症状，而不是呼吸道症状，更有可能传播病毒的时间更长(35)。相比简单地仅靶向一个粘膜部位，在呼吸道和肠道处驱动针对s的免疫粘膜免疫应答可能能够提供更广泛的免疫力和更大的阻断传播的能力。阻断传播，而不仅仅是疾病，对于降低感染率并最终根除sars-cov-2至关重要。我们先前已经证明，基于rad的经口片剂疫苗可以诱导针对流感病毒激发后呼吸道感染和传播的保护(15)，以及人类中针对诺如病毒抗原的肠道免疫(12)。此外，粘膜iga比单体igg反应更有可能能够解决循环病毒中s蛋白的任何异质性。还发现miga在对其他呼吸道病原体的交叉反应性方面比igg更有效(36)。在covid-19感染中，iga也可能是比igg更具中和性的同种型，并且事实上，中和性iga在早期免疫应答中占主导地位(37)。值得注意的是，在我们的小鼠研究中，在我们的肺相对于血清抗体结果中，我们也看到中和与非中和抗体之间的更高的比率，这支持了相比igg，iga可能更具效力的概念。聚合物iga通过与抗原和fc受体的多重结合相互作用，可以将微弱的单一相互作用转化为更高的整体亲和力结合和激活信号，从而针对异源病毒产生更多的交叉保护(38)。[0164]我们缓解这种潜在的疫苗驱动的逃逸问题的第二种策略是在疫苗构建体中包括n蛋白。n蛋白在β-冠状病毒间是高度保守的，(大于90％的同一性)含有几种免疫显性t细胞表位，并且在sars-cov康复受试者以及已知未暴露于sars-cov或sars-cov-2的人中可以发现针对n的长期记忆(18,39)。在感染环境中，针对n蛋白的t细胞反应似乎与中和抗体应答的增加有关(40)。所有这些原因导致我们在我们的疫苗接种方法中增加了n。将该蛋白在293a细胞中表达。然而，由于人类β肌动蛋白启动子在人类细胞中比小鼠中更活跃，我们没有在balb/c小鼠中探索免疫应答，但将在未来的nhp和人类研究中更仔细地检查它们。2的dna序列，创建了四种重组腺病毒疫苗构建体。具体而言，将发布的sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)和sars-cov-2核衣壳蛋白(n蛋白)的氨基酸序列用于合成针对在智人细胞中表达优化的核酸序列密码子(blueheronbiotechnology,bothell,wa)。如he,etal.(50)所述的，使用在经口rad片剂先前的临床试验中所使用的相同的载体主链(12,15)，将这些序列用于创建包含克隆到5型腺病毒(rad5)的e1区中的转基因的重组质粒。如图4所示，创建了以下四种构建体：a.rad-s：包含位于cmv启动子控制下的全长sars-cov-2s基因的rad5载体。b.rad-s-n：包含位于cmv启动子控制下的全长sars-cov-2s基因和位于人类β-肌动蛋白启动子控制下的全长sars-cov-2n基因的rad5载体。c.rad-s1-n：使用将sars-cov-2s基因的s1区(包括s1和s2之间的天然furin位点)与全长sars-cov-2n基因组合的融合序列的rad5载体。d.rad-s(固定的)-n：包含去除了跨膜区的位于cmv启动子控制下的稳定的s基因和位于人类β-肌动蛋白启动子控制下的全长sars-cov-2n基因的rad5载体。通过以下修饰稳定s基因：a)将aa位置682、683、685处的精氨酸残基缺失，以去除天然furin切割位点b)引入了两个稳定性突变：k986p和v987pc)去除p1213后的跨膜区，并用噬菌体t4fibritin三聚体foldon结构域序列(51)(gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl)取代[0169]所有疫苗都在expi293f悬浮细胞系(thermofisherscientific)中生长，通过cscl密度离心纯化，并以液体形式提供，用于动物实验。动物实验[0170]动物护理和使用委员会(iacuc)批准了研究的伦理。所有程序都是根据地方、州和联邦的指导和规则进行的。雌性6-8周龄balb/c小鼠购自jackson实验室(barharbor,me)。由于小鼠不会吞咽药丸，因此将液体制剂以每个鼻孔10μl、每只小鼠20μl经鼻内滴入，以便测试各种构建体的免疫原性。在不同时间点通过脸颊穿刺获得血清。抗体评估elisas[0171]蛋白质特异性的抗体滴度的测量类似于先前描述的方法(52)。简言之，将微量滴定板(maxisorp:nunc)用1.0ug/mls1蛋白(genscript)包被在1份碳酸盐缓冲液(0.1m，ph9.6)中。将板在4℃的湿润室中孵育过夜，然后在洗涤前在pbs加0.05％tween20(pbst)加1％bsa溶液中封闭1h。将血浆样品在pbst中连续稀释。培养2h后，用pbst洗涤平板至少5次。然后加入抗体，作为抗小鼠igg1-辣根过氧化物酶(hrp)和抗小鼠igg2a-hrp(bethyllaboratories,montgomery,tx)的混合物。每种二抗以1:5,000的稀释度使用。孵育1h后，将板洗涤至少5次。用3,3＝,5,5＝-四甲基-联苯胺(tmb)底物(rockland,gilbertsville,pa)检测抗原特异性小鼠抗体，并使用h2so4作为终止溶液。在spectramaxm2微孔板读数仪上，于450nm处读取板。除非另有说明，否则平均抗体滴度报告为相互稀释，给出的吸光度值大于平均背景加2个标准差。抗体结合抗体[0172]为了同时测量针对s1和s2的应答，用sarscov-2抗原包被96孔2斑点板(mesoscaledevices；msd)。蛋白质是从在哺乳动物细胞(293细胞)中产生他们的来源(nativeantigencompany)商购获得的。这些是生物素化的，并通过它们各自的u-plex接头粘附在它们各自的斑点上。为了测量igg抗体，用msd-blockerb在振荡下封闭板1小时，然后在添加样品之前洗涤三次，以1:4000稀释。在振荡细孵育2小时后，将板洗涤三次。然后将板与1μg/ml的检测抗体(msdsulfo-tagtm抗小鼠igg)一起孵育1小时。洗涤3次后，加入读取缓冲液，并在mesoquickplexsq120上读取板。sars-cov-2中和测定[0173]基于sars-cov-2替代病毒中和测试(svnt)试剂盒(genscript)，常规检测中和抗体。这种基于elisa的试剂盒检测阻碍sars-cov-2刺突糖蛋白的受体结合结构域(rbd)和宿主细胞上的ace2受体之间的相互作用的抗体，并且与vero细胞感染sars-cov-2的常规病毒中和滴度高度相关(53)。这种方法的优点是可以在bsl-2实验室中进行测定。使用所提供的样品稀释缓冲液，以1:20、1:100、1:300、1:500、1:750和1:1000稀释来自用候选疫苗免疫的小鼠的血清。将来自未免疫小鼠的血清以1:20稀释。将肺样本以1:5、1:20和1:100稀释。根据提供的方案，以1:9的体积比制备阳性和阴性对照。稀释后，将血清或肺样品单独与hrp-rbd溶液以1:1的比例在37℃下孵育30分钟。孵育后，将100μl的每种hrp-rbd和样品或对照混合物加入hace2预涂覆的捕获板中的相应孔中，并再一次在37℃下孵育15分钟。然后，彻底洗涤孔，并将100μl所提供的tmb(3,3＝,5,5＝-四甲基-联苯胺)溶液加入到每个孔中，并在室温(20-25℃)下保持培养15分钟。最后，将50μl停止溶液加入到每个孔中，并在spectramaxm2微孔板读数仪上，于450nm处读取板。给定样品的吸光度与给定样品中抗sars-cov-2rbd中和抗体的滴度呈负相关。根据测试试剂盒方案，当比较样品的od相对于阴性对照的od时，20％抑制的截止值被确定为对于存在的中和抗体呈阳性。在最低稀释下为阴性的样品被设定为测试的最低稀释度的1/2，对于血清为10，或者对于肺部样品为2.5。[0174]在一些研究中，在bsl3条件下，在visimederi使用cvnt测定测量了另外的中和抗体应答。cvnt测定具有细胞病变效应(cpe)的读出，以检测动物或人类样品中针对活的sars-cov-2的特异性中和抗体。cvnt/cpe测定允许病毒进行多次周期的感染，并从细胞中释放；它在几天(通常孵育72小时)内的指数生长导致部分或完整的细胞单层从支持物表面脱离，可清楚地识别为cpe。将血清样品在56°下加热灭活30min；从1:10开始进行两倍稀释，然后与等体积的含有100tcid50的sars-cov-2的病毒溶液混合。将血清-病毒混合物在37°下，在具有5％co2的湿润气氛中孵育1小时。孵育后，将每种稀释的100μl混合物以一式两份添加到含有半汇合veroe6单层的细胞板中。孵育72小时后，通过倒置光学显微镜检查板。将保护超过50％的细胞免受cpe影响的最高血清稀释度作为中和滴度。肺igaelisas[0175]在最终免疫后两周(研究的第28天)，处死小鼠并经由心脏穿刺放血。取出肺，哪个在-80℃下快速冷冻。解冻时，对肺进行称重。使用颗粒研杵(sigmaz359947)，在150μldpbs中将肺均质化。将匀浆以1300rpm离心3分钟，并冷冻上清液。在评估iga含量之前，使用bradford测定评估肺匀浆中的总蛋白质含量，以确保所有样品中的组织量相等。使用小鼠igaelisa试剂盒(mabtech)和pnpp底物(mabtech)检测肺中的抗原特异性iga滴度。简言之，在4℃下，将maxisorp板(nunc)用于pbs中的s1或s2(thenativeantigencompany；50ng/孔)涂覆，以进行吸附过夜，然后在洗涤前在pbs加0.05％tween20(pbst)加0.1％bsa(pbs/t/ebolavaccines:12-monthdatafromaphase1randomizedclinicaltrialinugandaandtanzania.jinfectdis2019；220(1):46-56.47.antrobusrd,coughlanl,berthoudtk,etal.clinicalassessmentofanovelrecombinantsimianadenoviruschadox1asavectoredvaccineexpressingconservedinfluenzaaantigens.molther2014；22(3):668-74.48.vandoremalenn,haddocke,feldmannf,etal.asingledoseofchadox1mersprovidesbroadprotectiveimmunityagainstavarietyofmers-covstrains.biorxiv2020:2020.04.13.036293.49.hassanao,kafainm,dmitrievip,etal.asingleintranasaldoseofchimpanzeeadenovirus-vectoredvaccineconferssterilizingimmunityagainstsars-cov-2infection.biorxiv2020:2020.07.16.205088.50.hetc,zhous,dacostalt,yuj,kinzlerkw,vogelsteinb.asimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenoviruses.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica1998；95(5):2509-14.51.guthes,kapinosl,moglicha,meiers,grzesieks,kiefhabert.veryfastfoldingandassociationofatrimerizationdomainfrombacteriophaget4fibritin.jmolbiol2004；337(4):905-15.52.tuckersn,link,stevenss,scollayr,bennettmj,olsondc.systemicandmucosalantibodyresponsesfollowingretroductalgenetransfertothesalivarygland.moltherapy2003；8:392-9.53.tancw,chiawn,qinx,etal.asars-cov-2surrogatevirusneutralizationtestbasedonantibody-mediatedblockageoface2-spikeprotein-proteininteraction.natbiotechnol2020.实施例6[0177]研究vxa-cov2-101是一项i期开放标签和剂量范围试验，以评估sars-cov-2经口片剂疫苗(rad-s-n，seqidno:8)的安全性和免疫原性，该疫苗在实施例6和7中称为vxa-cov2-1，给予年龄18-55岁的健康成年受试者。[0178]本研究的目的是评估通过肠溶片剂递送的vxa-cov2-1经口疫苗的安全性和免疫原性。[0179]受试者被纳入南加州的单个的1期单元。在完成筛选评估和资格确认后，35名受试者被纳入本试验中；队列1哨兵受试者(n＝5)在第1天接种疫苗，并在第29天接种重复剂量。队列2和3受试者在第1天接受了单次疫苗接种。研究设计如下表所示。vxa-cov2-101研究设计[0180]队列1哨兵受试者在第29天接受了与第一次剂量水平相同的第二次剂量(加强)。b细胞/抗体分析[0181]使用基于流式细胞术的测量和通过elispot的抗体分泌细胞(asc)测定来评估vxa-cov2-1促进具有高抗体产生潜力的b细胞的能力。先前已经确立，对疫苗接种有反应的b细胞在给药部位处和局部引流淋巴结中被激活，其中它们在生发中心反应后分化为浆母细胞。在免疫后6-8天之间，相当大比例的浆母细胞离开生发中心并短暂出现在外周循环中，其中可以发现它们高度富集疫苗抗原特异性抗体分泌细胞(asc)。因此，在vxa-cov2-101研究中，对疫苗接种前和接种后收集的固定全血样品的流式细胞术分析揭示出，在疫苗接种后8天，cd27++cd38++浆母细胞群总体显著增加，相比基线水平，大约70％(24/35)的接种疫苗者显示浆母细胞频率增加2倍或更高(图9a-b)。进一步的研究表明，接种疫苗后，循环浆母细胞表面商的iga和粘膜归巢受体α4β7都上调，特别是在接受更高剂量水平vxa-cov2-1的队列中(图9c)，因此表明疫苗诱导了这种产生iga的b细胞群向粘膜组织的迁移(mora和vonandrian,2008)。总之，这些结果与该公司先前在人2期甲型流感激发研究环境中发表的数据一致，其中在经口流感疫苗接种后产生的具有类似粘膜特征的iga浆母细胞被发现是疫苗诱导保护的有力指标(liebowitzetal.,2020)。[0182]另外，elispot测定用于测量vxa-cov2-1诱导循环抗体分泌b细胞的能力，该b细胞可以识别并结合sars-cov-2刺突(s)抗原的s1结构域。该分析表明，在第一次免疫后的第8天，疫苗诱导了显著的s1反应性的、分泌iga的asc产生(通过wilcoxon检验，p＝0.0002)，总体中值比基线水平增加了4倍(图9d)。更具体而言，第1天和第8天的asc测量值可用的较低剂量疫苗组中8/12(67％)的受试者在此被分类为“应答者”，如通过相对于接种疫苗前水平，在接种疫苗后第8天，每百万细胞分泌iga的asc数量的中值增加2倍或更高(2.67的中值倍数增加；95％ci：1.0-13.32)所指示的。在较高疫苗剂量队列中记录到略高百分比的应答者(11/15的受试者，73％)(4的中值倍数增加；95％ci：1.3-13.32)。[0183]使用mesoscalediscovery(msd)平台，测量了免疫之前和之后的血清、唾液和鼻腔样品中不同sars-cov-2抗原特异性的iga抗体水平。与经由流式细胞术和elispot观察到的b细胞反应的粘膜特征一致，在血清和粘膜区室中都可以发现靶向sars-cov-2刺突(s)、核蛋白(n)和刺突受体结合结构域(rbd)的iga抗体。总体而言，23％(8/35)的接种疫苗者到第29天在血清中显示出50％或更高的疫苗特异性iga增加，在分析中，这些受试者中有6/8产生了靶向所有三种sars-cov-2抗原的iga。与iga+b7+浆母细胞测量结果一致，较高剂量队列中的受试者在血清中表现出较高的s特异性的iga抗体应答(图9)。正如我们所预期的，鉴于vxa-cov2-1经口候选疫苗的独特特征，较高百分比的接种疫苗者在粘膜区室相对于血清中产生了sars-cov-2特异性的iga抗体应答，其中54％的接种疫苗者(19/35)在唾液或鼻腔样品中达到2倍或更高的粘膜iga增加(图9f。更具体而言，10/35(29％)的接种疫苗者在其唾液中的iga抗体增加了2倍或更高，而12/35(35％)到接种疫苗后d29，在其鼻腔区室中达到了相同的阈值。在两个剂量组之间的唾液或鼻腔样品中，未能观察到疫苗特异性iga应答的显著差异(图9f)。由于粘膜样品的限制，测量iga的中和能力是困难的，但初步发现表明，在测量ace2与刺突蛋白结合的替代中和测定中，特异性鼻腔iga增加两倍的受试者也具有中和的能力(图9f)。如sterlin,etal,(sterlinetal.,2021)报道的，已表明分泌型iga对sars-cov-2具有的中和能力高于igg。[0184]这些发现是有希望的，因为一些报告强调了粘膜免疫和iga抗体的产生在有助于防止covid-19方面的潜力(ejemeletal.,2020；russelletal.,2020；sterlinetal.,2021)。值得注意的是，虽然可注射疫苗并未设计为在呼吸道粘膜中有效诱导iga抗体，但经口疫苗接种策略可能会提供这一优势(jeyanathanetal.,2020)。在关键粘膜表面处诱导sars-cov-2特异性iga应答也可能引发消除性免疫，并具有更大的阻断病毒传播的能力，这是非常理想的特征，特别是在新的sars-cov-2变体可能在未检测到的接种疫苗的受试者中复制的情况下。[0185]对疫苗接种后血清中igg抗体的分析表明，sars-cov-2特异性抗体应答没有增加。类似地，在血清中未观察到显著的sars-cov-2抗体介导的中和作用。虽然目前还没有确定血清中缺乏疫苗特异性igg和抗体中和的潜在原因，但在本研究中使用的剂量水平下，单次经口vxa-cov2-1剂量可能不足以引发强大的疫苗特异性igg中和应答。另外，不能排除vxa-cov2-1构建体中编码n的基因的存在可能使该候选疫苗的免疫原性特征从血清中和抗体偏向t细胞介导的免疫。t细胞分析[0186]为了确定vxa-cov2-1是否引发抗病毒cd4和cd8t细胞，用s和n蛋白全长序列的sars-cov-2重叠肽库刺激pbmcs，并测量了抗病毒细胞因子干扰素γ(ifnγ)和肿瘤坏死因子α(tnfα)的释放。重要的是，ifnγ和tnfα已被鉴定为抗病毒保护的关联因素(madedonasetal.,springerseminimmunopathol28:209-219,2006；precopioetal.j.expmed204:1405-1416,2007)。类似地，由于ifnγ和cd107a的组合已被鉴定为强细胞毒性细胞的标志(soghoian,etal.scitranslmed4:123ra125,2012)，另外评估了脱颗粒标记cd107a。[0187]我们发现，响应于s，相比第0天的基线水平，接种单次经口剂量的vxa-cov2-1疫苗在第7天诱导了表达ifnγ、tnfα和cd107a的cd8+s特异性t细胞的统计学上显著的增加(图10a)。还示出了相同数据的剂量反应图(图12a)。[0188]此外，通过测量ifnγ和tnfα的s特异性双重表达来评估多功能性，并且我们观察到在第7天相对于第0天，产生两种产生ifnγ/tnfα的细胞的t细胞的量显著增加(图10b)。多功能性被视为与保护相关，特别是在疫苗接种中(makedonasetal,2006；precopioetal,2007，均同上)。因此，双重分泌ifnγ和tnfα的cd8t细胞的显著增加代表了产生抗病毒反应的有意义和显著的进展。约25％的受试者在接种疫苗后7天发展出多功能cd8s特异性的t细胞反应，与强烈的抗病毒反应一致(图10c)。为了表明表达细胞因子的cd8t的强烈增加是s特异性的，并且不是疫苗接种后全身性炎症的结果，刺激细胞并与ebv、cmv和流感肽(cef)的肽库平行，并通过流式细胞术测量ifnγ表达(图10d)。与s肽应答不同，cef肽刺激的ifnγ应答在接种疫苗前后保持不变。[0189]vxa-cov2-1诱导的cd8t细胞反应在本研究中测量的窄剂量范围内没有显示出剂量效应的趋势(图12a)，因此将来自vxa-cov2-1的两个剂量水平的受试者组合以用于cd8应答的统计分析。监测4名加强的并具有可用于分析的pbmcs的受试者的ifn-γ应答随时间的变化(图12b)，表明第二次免疫维持或加强了t细胞反应。[0190]在几个个体中，针对n的t细胞反应也增加，尽管程度小于s(图12d、12e)。ifnγ+cd107a+细胞毒性cd4t细胞在病毒对照中具有增强cd8t细胞的能力。尽管不显著，但接种疫苗者也显示出具有细胞毒性能力的s特异性cd4t细胞的增加(图12c)。先前已经表明，ifnγ+cd107a+细胞毒性cd4t细胞在病毒对照中具有增强cd8t细胞的能力(johnsonetal,j.virol89:7494-7505,2015)。抗病毒t细胞与人类地方性冠状病毒交叉反应[0191]为了评估vxa-cov2-1诱导的免疫应答对地方性冠状病毒的交叉反应性，用来自四种地方性人类冠状病毒(hcov)(229e、hku1、oc43和nl63)的s和n蛋白的肽库刺激来自9名vxa-cov2-1疫苗接种受试者的pbmcs，经由细胞内染色测量ifnγ的释放。基于可用性和先前的针对野生型sars-cov-2刺突蛋白的t细胞反应，选择pbmc样品进行评估。与所有四种地方性hcov的疫苗接种前水平相比，检测到分泌ifnγ的cd8t细胞的增加(图10e)，这表明vxa-cov2-1诱导的t细胞与地方性的循环hcov交叉反应。实施例7经口疫苗接种诱导更高量级的的t细胞[0192]为了比较vxa-cov2-1与肌肉内(im)mrnacovid疫苗诱导的应答，我们招募了根据eua预期接种mrna疫苗的志愿者，以提供血液样品。在疫苗接种前和疫苗接种后7天，在与我们的接种疫苗者相同的时间点采集pbmcs，并在与来自vxa-cov2-101试验的pbmcs相同的体外测定中测量t细胞活性，并进行与对照相同的测定变异性分析。[0193]服用vxa-cov2-1片剂的受试者具有的t细胞反应比im接种辉瑞(bnt162b1)或莫德纳(mrna-1273)疫苗的那些受试者高出数倍。来自cd8+t细胞的ifnγ释放显著增加，p＝0.0283(bnt162b1)和p＝0.061(mrna-1273)，(图11a)，其中tnfα和cd107a相比接种疫苗前的基线显示较小的增加。对于bnt162b1/mrna-1273/vxa-cov2-1接种疫苗者，来自接种疫苗者的cd8+t细胞的ifnγ超过第0天的平均百分比分别为0.4/0.09/2.3。与im疫苗相比，服用vxa-cov2-1片剂的患者增加了5倍以上。这等同于服用vxa-cov2-1片剂相对于im疫苗的那些的》5倍的增加。[0194]由于在与其他疫苗相同的测定中只测试了一小部分，为了考虑受试者选择中的潜在偏差，将先前测量的整个队列绘制在一起以进行比较，对于组合的mrna疫苗仍可见显著性(p＝0.0066)(图11b)。包括非应答者在内的整个队列的平均值为1.5％的s特异性ifnγ+cd8t细胞，相比im接种疫苗者可见》3.5倍的增加。为了进行比较，我们还测量了先前感染sars-cov-2(恢复期)的受试者的应答，其中4名恢复期受试者的平均ifnγ应答为0.8％的s特异性ifnγ+cd8t细胞。由于报告的来自im疫苗的t细胞测量值是在第二剂疫苗接种后7天采集的(sahin,etal.,nature2021)，在同一测定中也在第二剂剂量后7天后测量pbmcs，并且发现除了一名具有特别好的应答的受试者外，在两个时间点都具有相等量级的应答(图11c)。接种bnt162b疫苗后t细胞反应的量级与sahin和同事在第二剂剂量后7天报告的数据相似(nature2021)。vaxart试验中的一个小队列(n＝5)接受了2剂vxa-cov2-1，并且cd8+t细胞ifnγ百分比在第二剂剂量后7天保持或增加(图12b)。当与mrna-1273和bnt162b受试者相比时，接受vxa-cov2-1的受试者中的cd4t细胞反应也显著更高(图13b)。[0195]由于受试者可能具有不同的免疫应答，并且该研究依赖于疫苗接种状态的自我报告，我们经由elisa测量了抗s抗体应答，并看到来自所有bnt162b1和mrna-1273的强大的抗s抗体应答(图13a)，确认了这些个体的疫苗接种状态，并证实了观察到的较低的t细胞应答不是因为缺少疫苗给药。t细胞分析概述‑‑实施例6和7[0196]在实施例7中呈现的研究中，报告了经口免疫后显著的抗病毒t细胞反应，其频率高于利用mrna疫苗观察到的频率。由于mhc-i和mhc-ii在体内呈递抗原，基于基因的疫苗，如vxa-cov2-1和mrnas，预期会诱导大量t细胞活化。然而，经口疫苗在我们的研究中表现更好。一个显著的差异是n蛋白存在于vxa-cov2-1中，但不存在于任何一种mrna疫苗中。尽管先前未将其与增强的抗原呈递相关联，但已知n具有多种生物学功能，包括影响干扰素诱导途径和激活trim21(caddy,etal.emboj40,e106228,2021)；mu,etal.celldiscov6,65,2020)。不受理论束缚，vxa-cov2-1中使用的tlr-3激动剂可以通过使树突细胞成熟、促进交叉呈递和通过细胞毒性t细胞驱动抗病毒应答来改善t细胞活化(wecketal,blood109:3890-3894,2007)，尽管我们还没有看到针对利用该平台的其他适应症的这种级别的t细胞反应。[0197]已在多项不同的研究中测量了接种疫苗后针对sars-cov-2的t细胞反应。在接种bnt162b2疫苗后，观察到表达cd38、cd39和pd-1的t细胞的活化和动员(oberhardtetal,nature,2021)。我们的疫苗产生了类似的结果，观察到那些标记物的增加，以及hla-dr+cd38+t细胞群的增加。在病毒感染中观察到cd38+hla-dr+t细胞，并且如在流感中所见，其是二次激发时记忆应答的最佳回忆所必需的(jiaetal,clintranslimmunology10:e1336,2021)。在sars-cov-2中，cd38+hla-dr+cd8t细胞与ifnγ相关，并且在患有血液系统癌症的covid-19患者中，与存活率相关(bangeetal,natmed27:1280-1289,2021)。[0198]在交叉反应性方面，发现t细胞反应即使针对不同种类的hcov也很强，显示出hcov交叉反应性t细胞数量的大量增加。由于抗体反应可能不会针对出现的所有变体产生充分的交叉反应，t细胞反应可能在这场大流行中发挥越来越重要的作用，其中注射的许可疫苗是血清抗体的有效诱导剂。由于t细胞免疫优势等级的性质，其中对广泛的表位作出反应，产生公有的和私有的克隆型(shomuradovaetalimmunity53:1245-1257e1245,2020)；snyder,etal.,medrxiv,2020.2007.2031.20165647(2020)。t细胞也更有可能对变体具有抗性并具有交叉保护性(johnson,etal.jimmunol194:1755-1762,2015)；dasilvaetal,medrxiv,2021；tarke,etal.,cellrepmed2,100204,2021)。由于中和抗体靶向的表位范围较窄，由于选择性压力而产生的突变倾向于降低疫苗的效力，但不会逃逸t细胞反应。利用sars-cov-2已经证明了这一点，表明变异毒株对t细胞免疫的影响很小tarkeetal,2021,同上；alter,etal.nature596:268-272,2021；tarke,etal.biorxiv,2021)。[0199]在大流行早期，在疫苗和广泛感染发生之前，在对最先的应答者进行的一项前瞻性研究中，最重要的与临床结果的关联因素是预先存在的t细胞反应的级别，而不是抗体水平(wylieetal,medrxiv,2020.2011.2002.20222778,2021。虽然抗体可能与mrna疫苗的实质性效力相关(gilberetal,medrxiv,2021)，但对bnt162b2疫苗的研究表明，尽管在那个时间点检测不到中和抗体，但一剂剂量最早在12天时就诱导了一些保护作用，表明t细胞介导的免疫可能在保护中发挥了早期作用(kalimuddinetal,med(ny)2:682-688e684,2021)。通过bnt162b2诱导的s特异性t细胞显示增加了cd38的表达，这与我们经由质谱细胞测量表型分析获得的数据一致。最后，不能制造抗体或b细胞的人似乎能够成功产生针对sars-cov-2的免疫应答，并具有正常的感染过程(meytsetal.j.allergyclinimmunol147:520-531,2021)还表明，在血液癌症患者中，cd8t细胞与存活率相关(huangetal,ressq,2021)[0200]甚至可以感染完整接种疫苗的人的sars-cov-2的多种变体的出现产生了一种情况，其中需要新的方法，可能利用异源增强策略，以补充现有的保护(barros-martinsetal,natmed27:1525-1529,2021)。任何每6-8个月需要的疫苗都很难在富裕国家实施，并且对于世界上大多数人来说几乎是不可能的。此外，随着变异绕过血清反应，产生粘膜归巢t细胞的能力可能对减少脱落和传播变得更加关键。一种针对变体产生交叉保护反应且易于分发的经口片剂可以解决影响全球获取的关键问题。[0201]总之，利用vxa-cov2-1经口免疫引发抗病毒的sars-cov-2特异性t细胞。诱导的产生ifnγ的cd8+t细胞的水平的级别高于目前针对covid-19使用的immrna疫苗。这些t细胞对四种地方性人类冠状病毒也有交叉反应，表明这种疫苗可能针对广泛的新出现的大流行性冠状病毒具有交叉保护作用。由于t细胞在防止死亡和严重感染方面可能很重要，我们的候选疫苗可以提供一种易于管理的全球疫苗策略来对抗流行病；当前的和未来的那些。方法‑‑实施例6和7t细胞免疫原性分析[0202]将pbmcs解冻，休息过夜，并在37℃下，在布雷菲德菌素a(invitrogen)、莫能菌素(biolegend)和cd107a-alexa488(克隆h4a3)(thermofisherscientific)存在下，在immunocult培养基(stemcelltechnologies)中，以1x10^7个细胞/ml的浓度，在96孔圆底板中，与sars-cov-2(miltenyi)或地方性的人类冠状病毒(jpt)的s或n肽文库一起培养5小时。收获细胞，并利用cd4-bv605(克隆okt4)、cd8-bv785(克隆rpa-t8)和zombie近红外活力染料(biolegend)进行表面染色。在用4％pfa(biotium)固定和用cytoperm(bdbiosciences)透化后，将针对细胞因子ifng-bv510(克隆b27)(biolegend)、tnfa-e450(克隆mab11)(thermofisherscientific)、il-2-apc(克隆mq1-17h12)(thermofisherscientific)、il-4-percp5.5(克隆8d4-8)(biolegend)、il-5-pe(克隆jes1-39d10)(biolegend)和il-13-pe-cy7(克隆jes10-5a2)(biolegend)的抗体用于评估细胞内细胞因子应答，并使用attune(thermofisherscientific)流式细胞仪进行分析。在flowjo、excel和graphpadprism中进行数据分析。临床方案[0203]设计了1期临床研究临床试验.orgnct04563702)，以评估疫苗(称为vxa-cov2-1)在两种不同剂量水平(1×1010iu和5x1010)下，在35名受试者中的安全性和免疫原性。首先对5名哨兵给药，并且在监测疫苗诱导的毒性一周后，将治疗队列中剩余的受试者与4名安慰剂对照一起随机化。低剂量组中只有5名受试者接受了加强，所有其他受试者都给予了1剂vxa-cov2-1。pbmc分离、冷冻保存和解冻[0204]从试验受试者的血液中分离用于vxa-cov2-101试验的pbmcs，并在wcct现场提取。用于比较研究的pbmcs是从受过训练的抽血员采集的血液中提取的。在肝素管(bd,franklinlakes,nj)中采集血液，并在同一天使用leucosep管(greinierbioone)和ficollpaqueplus(cytiva)分离pbmcs。在-80℃的coolcell(corning)中，在具有10％dmso的fbs中冻结pbmcs，然后储存在液氮中直到分析时间。根据制造商的说明(cellulartechnologyltd[ctl],shakerheights,oh)，使用无血清试剂解冻细胞。疫苗[0205]vxa-cov2-1是一种rad5载体，其包含位于cmv启动子控制下的全长sars-cov-2s基因和位于人类β-肌动蛋白启动子控制下的全长sars-cov-2n基因。rad5疫苗构建体是基于发布的可作为genbank登录号mn908947.3公开获取的sars-cov-2的dna序列创建的。使用在先前的经口rad片剂的临床试验中使用的相同载体主链2，使用发布的sars-cov-2s和sars-cov-2n的氨基酸序列，来创建包含克隆到5型腺病毒的e1区中的转基因的重组质粒。所有疫苗都在expi293f悬浮细胞系(thermofisherscientific)中生长，并通过cscl密度离心进行纯化。比较研究[0206]对于比较研究，在疫苗接种前(d0)、第一剂剂量后7天(d7)和第二剂剂量后7天(加强后)，从计划接受bnt162b1(biont-pfizer)或mrna-1273(moderna)mrna疫苗的健康个体中采集pbmcs。所有受试者都签署了知情同意书，并同意在接受疫苗前和其他2个时间点献血：第一剂剂量后7天和第二剂剂量后7天。为了确认疫苗接种状态，在d0和第28天采集来自mrna疫苗接种受试者的血清。质谱细胞测量[0207]对于初始处理，将750ul的肝素化血液与1050ul的smarttubeproteomicstabilizer(smarttubeinc.，分类号prot1)混合，在室温下孵育11分钟，然后在干冰上闪蒸，并储存在-80℃下。在干冰上运输冷冻样品，以便进行后续分析。[0208]将来自每名供体的两份样品从-80℃冰水浴储存中转移，并在1x解冻-溶解缓冲液(smarttubeinc.，分类号thawlyse1)中重悬和洗涤两次，以用于红细胞溶解。在红细胞溶解后，对细胞计数，并将1.5x106个细胞手动排列在96孔块中。通过先前描述的机器人系统，以20-plex方案，利用钯金属对样品进行条形码编码3839。随后手动对条形码样品进行染色步骤。在室温下用fc块(humantrustainfcx,biolegend分类号422302)处理条形码细胞，用细胞染色介质(具有0.5％bsa和0.02％叠氮化钠的pbs)洗涤一次，并在细胞染色介质中用表面抗体染色30分钟。表面抗体染色后，用冰冷的100％甲醇(thermofisher，分类号a412-4)使细胞透化，洗涤，并用细胞内抗体染色60分钟。细胞内染色后，洗涤细胞，并将其重悬于含有铱嵌入剂(fluidigm，分类号201192b)和1.6％多聚甲醛(thermofisher，分类号50-980-487)的溶液中。在质谱细胞测量仪上进行样品分析之前，将样品洗涤并重悬于1x四元素标准化珠(140/142ce、151/153eu、165ho、175/176lu)(fluidigm，分类号201078)中。将收集的数据在所有条形码样品中进行标准化，并按先前所述进行解条形码40。inducetcellimmunity.emboj40,e106228(2021).[0236]mu,j.,etal.sars-cov-2nproteinantagonizestypeiinterferonsignalingbysuppressingphosphorylationandnucleartranslocationofstat1andstat2.celldiscov6,65(2020).[0237]weck,m.m.,etal.tlrligandsdifferentiallyaffectuptakeandpresentationofcellularantigens.blood109,3890-3894(2007).[0238]oberhardt,v.,etal.rapidandstablemobilizationofcd8+tcellsbysars-cov-2mrnavaccine.nature(2021).[0239]jia,x.,etal.highexpressionofcd38andmhcclassiioncd8(+)tcellsduringsevereinfluenzadiseasereflectsbystanderactivationandtrogocytosis.clintranslimmunology10,e1336(2021).[0240]bange,e.m.,etal.cd8(+)tcellscontributetosurvivalinpatientswithcovid-19andhematologiccancer.natmed27,1280-1289(2021).[0241]shomuradova,a.s.,etal.sars-cov-2epitopesarerecognizedbyapublicanddiverserepertoireofhumantcellreceptors.immunity53,1245-1257e1245(2020).[0242]snyder,t.m.,etal.magnitudeanddynamicsofthet-cellresponsetosars-cov-2infectionatbothindividualandpopulationlevels.medrxiv,2020.2007.2031.20165647(2020).[0243]johnson,s.,etal.protectiveefficacyofindividualcd8+tcellspecificitiesinchronicviralinfection.jimmunol194,1755-1762(2015).[0244]dasilvaantunes,r.,etal.differentialtcellreactivitytoseasonalcoronavirusesandsars-cov-2incommunityandhealthcareworkers.medrxiv(2021).[0245]tarke,a.,etal.comprehensiveanalysisoftcellimmunodominanceandimmunoprevalenceofsars-cov-2epitopesincovid-19cases.cellrepmed2,100204(2021).[0246]alter,g.,etal.immunogenicityofad26.cov2.svaccineagainstsars-cov-2variantsinhumans.nature596,268-272(2021).[0247]tarke,a.,etal.negligibleimpactofsars-cov-2variantsoncd4(+)andcd8(+)[0248]wyllie,d.,etal.sars-cov-2responsivetcellnumbersandanti-spikeigglevelsarebothassociatedwithprotectionfromcovid-19:aprospectivecohortstudyinkeyworkers.medrxiv,2020.2011.2002.20222778(2021).[0249]gilbert,p.b.,etal.immunecorrelatesanalysisofthemrna-1273covid-19vaccineefficacytrial.medrxiv(2021).[0250]kalimuddin,s.,etal.earlytcellandbindingantibodyresponsesareassociatedwithcovid-19rnavaccineefficacyonset.med(ny)2,682-688e684(2021).[0251]meyts,i.,etal.coronavirusdisease2019inpatientswithinbornerrorsofimmunity:aninternationalstudy.jallergyclinimmunol147,520-531(2021).[0252]huang,a.,etal.cd8tcellscompensateforimpairedhumoralimmunityincovid-19patientswithhematologiccancer.ressq(2021).[0253]barros-martins,j.,etal.immuneresponsesagainstsars-cov-2variantsafterheterologousandhomologouschadox1ncov-19/bnt162b2vaccination.natmed27,1525-1529(2021).实施例8[0254]为了测试n蛋白是否能够增强t细胞反应，在小鼠中进行实验。本研究中使用了两种疫苗构建体：jl82是一种pad5载体，包含e1/e3缺失的完整5型腺病毒基因组，并在dele1位置中包含位于cmv启动子/增强子控制下的转基因盒，以及随后的牛生长激素聚腺苷酸化信号。转基因插入物编码作为融合蛋白表达的hpv16e6/e7转基因。为了产生表达hpv16e6/e7和n蛋白的ed107.58，将没有终止密码子的来自jl82的e6/e7的转基因序列经由t2a序列(doi:10.1038/s41598-017-02460-2)连接到全长sars-cov-2n基因(genbank登录号mn908947.3)。针对在智人中表达对hpv16和sars-cov-2序列进行密码子优化。在内部合成完整的插入序列，并经由重组克隆到pad中。参见seqidnos:21-24。[0255]将15周龄雌性c57bl/6j小鼠经由鼻内途径接种疫苗。接种疫苗后7天，处死小鼠，并从脾脏红分离细胞。然后用来源于hpve6和e7蛋白的15mer重叠肽库刺激脾细胞约18小时。约18h后，经由elispot测量干扰素γ的释放，作为t细胞功能的测量。[0256]响应于hpv16e6和e7肽，与jl82相比，来自接种ed107疫苗的小鼠的分泌的干扰素γ出现增加(图14)。这表明我们的疫苗构建体中存在的sars-cov-2n蛋白增强了t细胞响应hpv16的能力。实施例9[0257]本实施例提供的数据表明，表达s和n的构建体引发的细胞毒性抗刺突t细胞反应高于仅表达s的相应疫苗。[0258]用表达s和n(ed88)或仅s(ed90)的构建体经鼻内对非洲绿猴接种疫苗。为了测量来自这些猴子的t细胞的反应，我们在疫苗接种前一天和疫苗接种后7天采集了pbmcs。然后在golgi阻断试剂存在下，利用来自sars-cov-2刺突蛋白的15mer重叠肽库刺激pbmcs5小时。作为细胞毒性功能的度量，测量了cd8t细胞的ifn-γ释放。[0259]响应于来自接种ed88疫苗的猴的刺突肽，观察到相比ed90，来自cd8t细胞的ifn-γ显著增加(图15)。只有1只接种ed90疫苗的猴显示ifn-γ超过接种疫苗前水平的增加，而所有5只接种疫苗ed88的猴均显示ifn-γ超过基线的增加。在未接种疫苗的组中，4只猴子中有2只具有超过基线的应答，其低于接种ed88疫苗的猴的均值。我们可以从这些数据中得出结论，即表达n和s蛋白的疫苗ed88具有比仅表达s的疫苗更高的细胞毒性抗刺突t细胞反应。[0260]图15显示响应于刺突肽，接种ifn-γ阳性疫苗后第8天的cd8t细胞的百分比超过基线接种疫苗前样品。[0261]应当理解，本文所描述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或改变将被提议给本领域技术人员，并且将被包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用整体并入本文中，用于所有目的。序列表seqidno:1：sars-cov-2s蛋白(表面糖蛋白)氨基酸序列mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt*seqidno:2：sars-cov-2n蛋白(核衣壳磷蛋白)氨基酸序列msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa*seqidno:3：sars-cov-2s蛋白(表面糖蛋白)核酸序列ggtaccgccaccatgtttgtttttctcgtactcctgcccctggtttcctcccaatgtgtcaatctgactacccggacccaacttcctcccgcctacaccaattcctttacccgaggtgtttactacccagacaaagtgttcaggtcatccgtcctccatagtacccaagacctcttcctcccttttttttctaacgttacctggtttcacgctattcacgttagcggcaccaacggcaccaaaagattcgataaccccgtactgccgttcaacgacggggtatattttgcctctactgaaaaatcaaacatcatacgcggatggatctttgggactaccctggactcaaaaactcagtccctgctgattgtgaataacgctaccaacgtggtgatcaaagtctgtgaattccagttttgcaacgatccttttctcggcgtttattatcacaaaaataacaaatcctggatggagagcgagttccgggtgtactcctccgcgaataattgcaccttcgaatatgtgtctcagccattcctcatggacctcgaggggaagcagggcaattttaagaatctgcgagaattcgtgttcaagaatatagacggttacttcaagatttactccaaacacaccccgattaacctggttagggacttgcctcagggcttttctgcattggagcccctcgtggacctcccaatcggcataaacattacaagatttcagactttgcttgcattgcacaggagctatttgacacccggcgattcttcttccggatggaccgctggagcagctgcttattacgtgggctatctgcagcctcgaacctttcttttgaagtacaacgaaaatggaactatcaccgatgcagttgactgcgccctggaccccctgtccgaaactaagtgcacgctcaaaagtttcacagtagagaaggggatataccagactagcaatttccgcgttcagccaaccgaaagtatagtgcgctttcctaatataactaacctgtgtcctttcggggaagtgtttaacgccactagattcgcttccgtctacgcctggaatagaaagaggatctcaaattgcgttgctgactatagtgttttgtacaattccgcctctttctcaaccttcaaatgttacggggtgagccctaccaaactgaacgacctgtgctttacaaacgtatacgccgacagctttgttatcagaggagacgaggttcgccagattgctccgggtcagacaggcaagattgctgattataattacaaactgcccgacgactttacaggatgtgtgatcgcgtggaacagtaacaatcttgactcaaaggttgggggtaattataattatctttaccggctgttcagaaaaagcaatttgaaacccttcgaaagggacatatccaccgagatctatcaggccgggtccactccatgcaatggtgtggaaggttttaattgctacttcccattgcagtcttatggattccaaccaaccaatggcgtaggctaccagccgtatcgcgttgtcgtgctcagcttcgagctgctccacgcccccgcgaccgtatgcggtcctaagaagtccaccaatcttgttaagaacaagtgtgtaaactttaactttaacgggctgaccgggaccggcgttctgactgaatctaacaaaaaattcctgcctttccagcagttcggccgcgatattgctgacaccactgacgctgtaagagaccctcagacccttgaaattctcgatatcacaccttgcagctttgggggcgtgtccgtcatcactccaggaactaacacaagcaaccaggtggcagtgttgtaccaggatgttaattgtaccgaggtgccagtggccatccacgccgatcaattgacacctacctggagggtttacagcacagggtccaatgtttttcagacaagagccggatgtctgatcggtgccgagcatgtcaacaattcctacgagtgtgatatccccattggtgcgggaatttgtgcatcatatcagacccagactaatagcccaagaagagctagatccgtcgctagtcaatccatcattgcatatacaatgtccctgggagctgagaattcagtcgcgtattcaaacaattccattgctattcctactaatttcactatctccgtcacgaccgagatcctgccagtttccatgactaagacttctgttgactgcaccatgtatatctgtggcgatagcaccgagtgcagtaatctgcttctgcagtacggctccttctgcacacaactcaatcgagcactgaccggtattgcagttgagcaggacaagaacacacaggaggtctttgcacaggtcaaacaaatttacaaaaccccccccataaaagactttggtgggttcaacttcagccaaatcctcccagatcccagcaagccctccaaaagatccttcatcgaagaccttttgttcaataaggtaaccctggccgacgcaggcttcatcaaacaatatggcgattgccttggagacattgctgcgcgcgatttgatctgtgctcagaaatttaacggtttgaccgtgctgcccccacttctgactgatgagatgatagcacagtatacttctgctcttctggcaggaacaatcacttccgggtggacctttggcgctggtgcagcactgcaaatccccttcgcaatgcaaatggcctaccgattcaatggtattggtgttacccagaacgtgctctatgagaatcagaaactcatcgccaatcagttcaatagcgctattggcaagattcaggattccctcagctctaccgccagcgctctggggaagctccaggacgtggtgaaccaaaatgctcaagcgctcaatacccttgtgaaacagctcagctccaattttggcgcaattagcagcgttctgaatgatattctgtcccggctggacaaggtagaagcagaagtccagatcgacaggctgatcaccgggcggttgcagagtctccagacctatgtcacacaacagctgatccgcgccgccgagatcagggcttccgctaacctggccgccactaagatgtccgaatgcgtgttggggcagagtaagcgggtcgacttttgcgggaagggataccatctgatgagcttccctcagtctgcaccccacggagtagtgttcctccacgtcacatatgtgcccgctcaggaaaagaatttcacaaccgcacctgctatctgtcacgacggcaaggcccactttcctagagaaggagttttcgtatctaacggcacccactggttcgtgacacagcggaacttttacgagcctcagattataactacggacaacactttcgtgtcaggcaactgtgacgtggtgattgggatcgtgaacaacacagtctacgacccattgcagcccgagttggactccttcaaagaggagcttgataagtatttcaagaaccatacctctcccgacgtggacctgggggacattagcggcatcaatgcatccgttgtgaatatccagaaagaaatcgataggctgaatgaggtcgcaaaaaatcttaatgagtcactgattgatctgcaggaactcggcaaatatgagcagtatattaagtggccgtggtacatatggctcggctttatcgccggtctgattgccatcgtgatggtgaccattatgctgtgttgtatgacaagctgctgttcatgtctcaaaggatgctgctcctgcggtagctgctgtaagttcgatgaagacgacagtgagcccgtgctcaaaggagtgaaactc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