用于破坏自身耐受的疫苗组合物的制作方法

本发明涉及用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受，特别是用于破坏针对内源性细胞因子的自身耐受的疫苗组合物，所述内源性细胞因子包括哺乳动物宿主中衍生自il-4、il-5、il-13、il-31、il-33和tnf-α蛋白的细胞因子，并且特别是包含内源性il-31蛋白的细胞因子组合。本发明进一步涉及疫苗组合物用于预防和/或治疗疾病，包括预防和/或治疗瘙痒状况和/或过敏状况的用途。本发明进一步涉及多蛋白，其衍生自自身蛋白质并用作疫苗组合物中的免疫原。在另一个方面，本发明提供了用于检测针对自身蛋白质的自身抗体的存在的方法，所述自身抗体可以用本发明的疫苗组合物生成。

背景技术：

1、疫苗对于预防和/或治疗传染病是至关重要的。然而，疫苗技术对于预防和/或治疗非传染性，经常为慢性的疾病，例如过敏、自身免疫性疾病和癌症也变得越来越重要。关于这些疾病的靶一般而言不是外来分子，而是自身蛋白质或其它自身抗原。由于免疫系统已进化为确保对于所有自身蛋白质和自身抗原的耐受，因此针对自身蛋白质的疫苗接种是非常困难的。本发明的基础研究旨在寻找规避或破坏自身耐受的方式。

2、自身反应性b细胞可能以低水平存在于循环中，但它们并不扩增或造成任何伤害，这主要是由于缺乏t细胞的帮助。相比之下，存在的任何自身反应性t细胞或在胸腺中被克隆删除，或在外周被免疫去势(anergized)。然而，已知的是如果自身抗原与外来(非自身)蛋白质或其部分共价偶联，意味着提供了包含自身和非自身蛋白质或蛋白质部分的融合蛋白，则对于非自身蛋白质(部分)特异性的t细胞被召募并激活。

3、平行地，自身反应性b细胞可以选择性地摄取含有自身和非自身蛋白质/蛋白质部分的融合蛋白，并且因此将自身肽和外来肽两者均呈递在mhc ii类分子上。然后，通过自身反应性b细胞呈递的非自身肽被激活的t细胞识别，所述激活的t细胞刺激自身反应性b细胞扩增并启动针对自身蛋白质/自身抗原的免疫应答。如果免疫应答足够强，则这些自身产生的抗体具有降低靶自身蛋白质的水平的能力。如果选择负责或促成疾病的自身蛋白质作为靶，则体内生成的自身抗体可以通过中和靶自身蛋白质而充当治疗性抗体。然而，此类稳固的免疫应答很难获得。

4、在包括过敏、自身免疫、癌症和aids的各种病理状况中，细胞因子的异常释放促成发病机制和/或疾病进展。通常，多种不同的细胞因子涉及病理状况。

5、例如，特应性皮炎是一种频繁的过敏性皮肤病症，其特征在于异常和过度的th2细胞和ilc2激活，伴随2型细胞因子包括白细胞介素(il)-4、il-5、il-13和il-31的稳固表达，以及其它细胞因子特别是il-22和il-33，以及il-17、il-9和ifn-γ的可变激活(moyle等人(2019)experimental dermatology，28：756-768；renert-yuval&guttman-yassky(2019)dermatol clin 37：205-213)。特应性皮炎是不仅在人中，而且在动物特别是犬中的频繁病症。事实上，特应性皮炎是犬中最常见的过敏，并且影响了大约10％的犬群，导致单独在欧洲和美国1500万至2000万只犬患有该疾病(griffin等人(2001)，“the acvd task forceon canine atopic dermatitis(xiv)：clinical manifestations of canine atopicdermatitis”，veterinary immunology and immunopathology，81(3-4)，255-269)。由这种过敏性皮肤病引起的发痒或瘙痒通常是复发性或慢性的。它深深地影响了犬及其饲主两者的生活质量。

6、特别地，内源性致痒原(pruritogen)白细胞介素31(il-31)似乎在特应性瘙痒中起关键作用。由于il-31似乎是人和犬中的特应性皮炎中的瘙痒的关键调节因子(sonkoly等人，″il-31：a new link between t cells and pruritus in atopic skininflammation″，journal of allergy and clinical immunology 117.2(2006)：411-417；furue等人，＂emerging role of interleukin-31 and interleukin-31receptor inpruritus in atopic dermatitis″，allergy 73.1(2018)：29-36；gonzales等人，″interleukin-31：its role in canine pruritus and naturally occurring canineatopic dermatitis.″veterinary dermatology 24.1(2013)：48-e12)，因此il-31本身及其受体结合一直是特应性皮炎背景下用于药理学干预发痒的主要焦点。

7、哮喘是另一种高度流行的状况，其病理生理学与2型以及1型细胞因子两者的异常释放相联系。哮喘有关治疗研究的主要靶包括il-4、il-5、il-13以及il-33。

8、已采取了不同的策略来治疗与异常细胞因子产生相联系的状况。例如，在特应性皮炎中，策略之一已集中于使用例如激酶抑制剂来抑制下游信号转导。然而，该策略具有抑制剂必须在短时间间隔内重复给予人或动物患者的缺点。已广泛使用的另一种策略是开发针对特定感兴趣的细胞因子的中和性单克隆抗体，以便降低循环配体水平和/或以其它方式抑制其受体结合且因此抑制生物活性。例如，在特应性皮炎中，已开发了抗4抗体、抗5抗体、抗13抗体、抗17a抗体、抗17c抗体、抗22抗体、抗31抗体和抗33抗体来预防和/或治疗这种状况(moyle等人(2019)experimental dermatology，28：756-768；renert-yuval&guttman-yassky(2019)dermatol clin 37：205-213)。然而，由于昂贵的细胞培养中的抗体生产程序以及在短间隔内重复抗体治疗的需要，因此该策略具有高生产成本的缺点。该策略的另一个缺点在于通常在患者中发生针对单克隆治疗性抗体的渐进性免疫，使得最终，治疗性抗体治疗不再有效。

9、bachmann等人2018年尝试通过施用疫苗针对细胞因子il-31进行疫苗接种，所述疫苗含有与病毒样颗粒(vlp)化学偶联的天然全长il-31，所述病毒样颗粒衍生自黄瓜花叶病毒并含有通用t细胞表位(bachmann等人，″vaccination against il-31for thetreatment of atopic dermatitis in dogs″，，journal of allergy and clinicalimmunology 142.1(2018)：279-281)。天然il-31与vlp的化学偶联通过使il-31和vlp外壳蛋白衍生化来实现。il-31用n-丁二酸s-乙酰基巯基乙二醇酯进行衍生化，随后为脱乙酰化以将反应性sh基团引入il-31内。vlp外壳蛋白用琥珀酰亚胺基-6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯)进行衍生化，以引入sh反应性化学部分。il-31和vlp的衍生化制剂彼此反应并纯化。然而，该策略的缺点是il-31-vlp缀合物的生产是高度复杂且昂贵的，需要纯化的vlp和il-31，用于衍生化和化学偶联以及后续纯化的多重化学步骤。此外，通过该生产方法无法获得定义明确的化学产物。所获得的il-31-vlp缀合物还含有非天然组分和化学键合，其生物降解性可能是成问题的。

10、本发明的基础研究的一个目标是提供以治疗性疫苗形式的人和兽用药物，其可以刺激特别是针对有害细胞因子的免疫应答。

技术实现思路

1、针对上述背景，本发明的一个目的是提供与本领域已知的手段相比，抑制或扰乱导致疾病或促成疾病的靶自身蛋白质的功能的有效药理学手段。本发明的另一个目的是提供在宿主中诱导针对靶自身蛋白质的长期效应的药理学手段，使得该药理学手段仅在长时间间隔后才需要重新施用，所述长时间间隔优选在数周的范围内，最优选在数月的范围内。本发明的一个进一步目的是提供可以以经济的方式生产，并且在其组分方面是化学上定义明确的药理学手段。

2、与上述目的有关，本发明的另一个目的是提供一种简单且有效的方法，以调查本发明的药理学手段抑制或扰乱涉及涉及疾病或导致疾病的靶自身蛋白质的功能的效应。

3、这些目的通过根据权利要求1的疫苗组合物、根据权利要求17的多蛋白、根据权利要求18和19的用途以及根据权利要求23的方法来实现。

4、本发明提供了多蛋白、编码该多蛋白的dna和/或编码该多蛋白的rna，其用于疫苗组合物中以破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受，其中所述多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位。特别地，它包含衍生自宿主的一种自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段和衍生自同一宿主的另一种自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段，加上在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位。在本发明的一个优选实施方案中，多蛋白包含宿主的一种自身蛋白质的两个或三个拷贝、同一宿主的另一种自身蛋白质的两个或三个拷贝、以及在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位。

5、本发明的基础研究惊讶地发现了，包含自身蛋白质区段以及在这些自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主t细胞表位的多蛋白能够破坏或规避宿主针对多蛋白的自身蛋白质区段的自身耐受。本发明的多蛋白的设计不仅具有免疫学优点，而且允许特别是皮下施用大量本发明的多蛋白，而不产生由多蛋白中发挥其正常的生物学功能和/或致病功能的自身蛋白质区段引起的显著负面效应。这使得根据本发明的多蛋白成为用于疫苗组合物的特别合适的抗原。

6、本发明的疫苗组合物包含根据本发明的多蛋白、编码该多蛋白的dna和/或编码该多蛋白的rna。更准确地，本发明提供了用于破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的疫苗组合物，其中当将疫苗组合物施用于宿主时，所述疫苗组合物能够产生针对所述自身蛋白质的自身抗体。本发明的疫苗组合物包含：

7、a)多蛋白、编码该多蛋白的dna和/或编码该多蛋白的rna，其中所述多蛋白包含

8、-衍生自宿主的第一自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段；

9、-衍生自宿主的第二自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段；

10、-任选地衍生自宿主的第三自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段；和

11、-在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位；和

12、b)一种或多种免疫刺激性寡核苷酸。

13、发明人惊讶地发现了，包含与作为佐剂的一种或多种免疫刺激性寡核苷酸组合、含有自身蛋白质区段以及在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主t细胞表位的多蛋白的疫苗，能够在疫苗组合物施用于其的宿主中诱导针对多蛋白的自身蛋白质区段的有效免疫应答。宿主中的这种有效的免疫应答包括针对多蛋白的自身蛋白质区段的自身抗体的产生。发明人的实验显示了，在用根据本发明的疫苗组合物接种疫苗后产生的自身抗体也与自身蛋白质区段衍生自其的天然自身蛋白质结合。发明人进一步观察到所产生的自身抗体存在于宿主的循环系统中数周，并且可以扰乱或甚至中和所结合的自身蛋白质的功能。这不仅是当来自仅一种类型的自身蛋白质的两个或更多个区段包含在多蛋白中时的情况，而且也是当来自多于一种不同类型的自身蛋白质的两个或更多个区段包含在多蛋白中时的情况。因此，根据本发明的疫苗组合物允许在体内诱导持久的治疗性自身抗体应答。

14、重要的是，对于多蛋白中包含的每种自身蛋白质，存在至少两个区段(可与术语“自身蛋白质区段”互换使用)。这些区段通常具有高水平的序列同一性，并且最优选地是彼此的精确拷贝。然而，可能发生不同的剪接事件，导致较低的序列同一性，但并不影响区段或多蛋白整体的功能。在这个意义上，衍生自同一自身蛋白质的至少两个区段可以彼此具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。对于小于100％的序列同一性，序列同一性的差异应该允许两个区段在个别地，即不以多蛋白的形式测试时仍导致相似的生物活性。

15、本发明还涉及多蛋白破坏针对宿主的自身蛋白质的自身耐受的用途，其中当将所述多蛋白施用于宿主时，通过自身抗体的产生来破坏自身耐受，并且其中所述多蛋白包含至少两个自身蛋白质区段、以及在至少两个自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位；特别地，其中所述多蛋白包含衍生自宿主的一种自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段、衍生自同一宿主的另一种自身蛋白质的至少两个自身蛋白质区段、以及在自身蛋白质区段之间和/或与其邻近的非宿主起源的一个或多个t细胞表位。这种用途在预防性和治疗性医学应用中，且特别是其中多重自身蛋白质涉及病理状况的那些应用中特别相关。

16、进一步地，本发明涉及用于预防或治疗受试者中的疾病的方法中的根据本发明的疫苗组合物，其中所述方法包括向受试者施用疫苗的步骤。

17、最后，本发明涉及用于检测中和性自身抗体的酶联免疫吸附测定，其包括以下步骤：

18、a)将抗原吸附到测试表面上；

19、b)封闭测试表面上的游离结合位点；

20、c)使由抗原包被并封闭的测试表面与包含针对抗原的标记的中和抗体和针对抗原的待测试的中和性自身抗体的混合物一起温育；和

21、d)检测标记的中和抗体的结合。

22、根据本发明的测定允许特别是在用根据本发明的疫苗组合物对宿主接种疫苗后，以稳固且明确的方式确定针对感兴趣抗原的中和性自身抗体的存在。