具有酚基的葡糖醛酸聚合化合物、包含这种化合物的凝胶形成组合物及其产生方法

本发明整体涉及葡糖醛酸聚合化合物和此类化合物的水凝胶化方法。本发明还涉及通过这种方法获得的水凝胶结构(颗粒、膜或3d-结构)的用途，特别是作为三维细胞培养材料以支持用作活性成分、细胞定殖或用于组织再生的生物分子。

背景技术：

1、聚葡糖醛酸(polyglucuronic acid，pgu；也称为glucuronan)是由菌株苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)m5n1cs产生的由在c-3位和/或c-2位部分乙酰化的[→4)-β-d-glcpa-(1→]残基构成的葡糖醛酸的均聚物[1]。首先描述于鲁氏毛霉(mucorrouxii)的细胞壁中[2]，这些多糖醛酸自此已经从其他来源分离，诸如在绿藻的细胞壁中分离[3]。然而，通过根瘤菌(rhizobia)菌株获得描述最多的多糖。然而，通过2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基(tempo)试剂氧化伯羟基基团的最新进展允许大规模地从纤维素、黄原胶、凝胶多糖、硬葡聚糖、壳聚糖、淀粉、真菌α-(1,3)-葡聚糖等获得pgu模拟物衍生物，同时已经鉴定出能够降解这些多聚糖醛酸的新的多糖裂解酶家族[4]、[5]。

2、在多聚葡糖醛酸和低聚葡糖醛酸的领域中，这些化合物的不同应用，特别是法国专利fr2781673[6]和国际申请wo 1993/18174[7]教导了pgu的生物相容性及其在食品、农业、药物、化妆品或水纯化中的用途，特别是作为胶凝剂、增稠剂、水合剂、稳定剂、螯合剂或絮凝剂的用途。另一个应用涉及对人血单核细胞的免疫刺激特性，低分子量pgu增强了细胞因子il-1、il-6和tnf-α的产生[8]。lintner(1999)[9]要求保护pgu与从雨生红球藻(haematococcus pluvialis)中提取的藻类结合的化妆品应用，或者在wo2010/067327[10]中要求保护低聚pgu刺激真皮和表皮的弹性。也在大鼠的受伤的趾长伸肌(edl)肌肉的模型上研究了通过磺化改性的这些低分子量聚葡糖醛酸的生物活性，并且证明再生活性不仅由硫酸根基团的存在诱导，而且还由乙酰基基团诱导。细胞的更新过程由胞外基质的特定信号(或通讯肽，诸如生长因子)调节。这些信号被储存、保护和定位在称为硫酸乙酰肝素(hs)的大型多糖家族上。在受伤的情况下，特定的酶破坏hs，因而不再保护特定的信号。称为蛋白酶的其他酶随后与胞外基质的其他结构蛋白一起破坏特定的信号。由于它们对来自胞外基质的天然酶的抗性，可以解释这些经修饰的细菌多糖的生物效应[11]。

3、在此背景下，申请人最近发现了pgu或具有酚羟基部分的pgu衍生物(下文称为pgu-ph)的水凝胶化特性及其作为用于生物打印(bioprinting)的生物油墨(bioink)组分的潜力。因此，申请人已经进一步开发了用于水凝胶化这些pgu-ph化合物的方法，其中酚羟基部分允许通过辣根过氧化物酶(hrp)催化的交联快速形成稳定的水凝胶。

4、hrp辅助的水凝胶化是本领域技术人员已知的从天然和合成聚合物的多种衍生物诸如藻酸盐[12]、透明质酸[13]、明胶[14]、葡聚糖[15]和聚(乙烯醇)[16]获得负载细胞的水凝胶的有效方法。最近，hrp辅助的水凝胶化被应用于3d生物打印[17]、[18]，其中需要快速固化从针喷射的油墨以供制造对蓝图具有更高保真度的3d构造体。3d生物打印是基于数字蓝图制造负载细胞的构造体的已知技术。为了用于药物筛选和再生医学的伤口敷料和组织工程，制造所得负载细胞的构造体[19]、[20]。

5、申请人已经发现向pgu或其衍生物中添加ph簇允许使用特定(酶促)交联途径，该途径无需使用较慢且使所形成的结构模糊的无机交联剂。由此获得的水凝胶结构形成透明网络并且具有印刷形式的这种良好保留。

技术实现思路

1、因此，申请人开发了一种用于产生葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph(在下文中由首字母缩略词pgu-ph表示)的方法，所述方法包括以下步骤：

2、-提供葡糖醛酸聚合化合物(pgu)；

3、-使所述葡糖醛酸聚合化合物(pgu)与酚类化合物反应，以便通过自由基聚合或通过将酚基化学区域选择性接枝到葡糖醛酸的羧基上而形成包含至少一个酚基的葡糖醛酸聚合化合物(pgu-ph)。

4、根据本发明的第一个实施方案(下文称为通过将酚基团化学区域选择性接枝到葡糖醛酸的羧基上来产生pgu-ph的第一种方法)，所述方法包括以下步骤：

5、-提供如上所定义的式(a)或(b)的葡糖醛酸聚合化合物(在下文中由首字母缩略词pgu表示)；

6、-将pgu溶解在酸缓冲溶液中以供形成pgu的溶液，优选在1w/v％的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲溶液(ph6.0，100mm)中；

7、-在所述pgu的溶液中依次添加x-(y-氨基-z-羟基烷基)-n-羟基-苯酚或其盐衍生物(诸如盐酸盐)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(wscd)，以供形成反应介质的最终组合物；

8、-在室温下(即20℃与25℃之间)搅拌所述最终组合物(优选至少4小时(并且优选20小时))直至获得由包含至少一个酚羟基部分的葡糖醛酸聚合化合物组成的所得聚合物。

9、搅拌的最后步骤之后可以是在丙酮中沉淀所述所得聚合物的步骤，然后用90％乙醇+10％水洗涤它直至归因于x-(y-氨基-z-羟基烷基)-n-羟基-苯酚的存在而在275nm处的吸光度变得在洗涤溶液中不可检测，如实施例1中所示。

10、优选地，在根据本发明的第一实施方案的用于产生葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph的方法中，x-(y-氨基-z-羟基烷基)-n-羟基-苯酚可选自由以下构成的组：酪胺、多巴胺和章鱼胺，并且甚至更优选为酪胺。

11、申请人还开发了用于产生根据本发明的葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph的方法的另一个实施方案(下文称为通过自由基聚合产生pgu-ph的第二种方法)，所述方法包括以下步骤：

12、-提供式(c)的葡糖醛酸聚合化合物的基团

13、

14、-使所述式(c)的基团与式(i)(见上文)或(d)的酚类化合物

15、

16、通过自由基偶合反应，以便分别获得式(e)或(f)的葡糖醛酸聚合化合物

17、

18、优选地，在根据本发明第二实施方案的用于产生葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph的方法中，式(d)的酚类化合物可以选自由以下构成的组：酪胺、多巴胺和章鱼胺，并且优选为酪胺。但是有可能使用任何酚类化合物。

19、本发明的另一个目标是一种包含本发明的葡糖醛酸聚合化合物(典型地为0.5w/v％至8w/v％)的水性溶液，所述水性溶液可以通过根据第一实施方案和第二实施方案产生此类聚合化合物的任何方法获得。一旦涂覆在平坦表面上，干燥此类溶液会产生pgu-ph的水溶性未胶凝膜(其只是被干燥，但没有交联)。可使用由二价离子(m2+，诸如优选为ca2+或mg2+)构成的经典交联剂溶液在干燥膜上产生交联过程。pgu-ph溶液的网状化可使用以下进行：

20、(1)由二价阳离子(m2+)(诸如ca2+、mg2+等)组成的交联催化剂，或

21、(2)在可见光和/或uv光下使用光引发剂(诸如核黄素、三联吡啶氯化钌ii([ru(bpy)3]2+)或它们的衍生物)的光凝胶化工艺。

22、本发明的另一个目标是一种凝胶形成组合物，所述凝胶形成组合物包含：

23、-根据本发明的或能够通过根据本发明的第一实施方案和第二实施方案的方法获得的葡糖醛酸聚合化合物，和

24、-由氧化酶或含有h2o2或能够原位产生h2o2的化合物(液体或气体形式)组成的交联催化剂(例如用于还原分子，诸如葡萄糖、果糖或半乳糖(单糖)，或乳糖和麦芽糖(二糖))。

25、在这种凝胶形成组合物中，如果含有h2o2或能够生成h2o2的化合物为葡萄糖(或果糖或半乳糖)，则交联催化剂还可以含有葡萄糖氧化酶(或果糖氧化酶或半乳糖氧化酶)，从而更迅速地生成h2o2。

26、根据本发明的凝胶形成组合物的第一实施方案，葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph可以与作为交联催化剂的氧化酶缔合，所述氧化酶选自由以下项组成的组：氧化还原酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶、酪氨酸酶和/或单糖氧化酶，以及它们的混合物。

27、优选地，氧化酶可以是辣根过氧化物酶(在下文中由首字母缩略词hrp表示)，其在组合物中含有至少0.1u/ml，优选地在0.1u/ml与20u/ml之间的量的酶，以供有效和快速的交联，并且甚至更好地约5u/ml。低于0.1u/ml，胶凝非常慢，并且高于200u/ml，胶凝太快并且难以控制。酶的单位(u)定义如下：一个连苯三酚(pyrogallol)单位将在20秒内在ph 6.0和20℃下由连苯三酚形成1.0mg红棓酚(purpurogallin)。

28、根据本发明的凝胶形成组合物的第二个实施方案，葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph可以与含有在0.05mmol/l与1mmol/l之间的量的h2o2的化合物缔合，这在hrp存在下导致良好控制的胶凝，胶凝时间为2秒至5秒。在这个范围之外，特别是从0.01mmol/l至0.05mmol/l和高于1mmol/l，胶凝慢得多(胶凝时间为15秒数量级)；但这种量的含有h2o2的化合物对于需要处理时间的应用(例如水凝胶薄膜制造和/或可注射水凝胶)可能是令人感兴趣的。

29、对于本发明的凝胶形成组合物的第一个实施方案或第二个实施方案，葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph的量可以为0.01w/v％至8w/v％，并且优选为0.1w/v％至2w/v％。如果葡糖醛酸聚合化合物pgu-ph的量为0.01w/v％，则胶凝是可行的，但是非常慢。高于8w/v％的葡糖醛酸聚合化合物，本发明的凝胶形成组合物非常粘稠并且难以使用。此外，交联剂难以渗透到组合物中。

30、根据可应用于两个实施方案的本发明的凝胶形成的组合物的第一变体，本发明的凝胶形成组合物还可以包含另一种活性可生物降解聚合物。有利地，可生物降解的聚合物可以是多糖(诸如糖胺聚糖)，或选自由胶原、粘附素、明胶及它们的混合物组成的组的蛋白质。优选地，可生物降解的聚合物可以是包含酚羟基部分的明胶衍生物(明胶-ph)。

31、根据也可应用于两个实施方案的本发明的凝胶形成组合物的第二变体，本发明的凝胶形成组合物还可包含动物、细菌或植物来源的悬浮细胞。这些细胞可以是10t1/2细胞或hepg2细胞，以3.105个细胞/毫升范围内的浓度存在于所述组合物中。

32、本发明的另一个目标是一种用于制造水凝胶结构的方法(在下文中称为用于制造水凝胶结构的第一种方法)，所述方法包括以下步骤：

33、-提供根据第一变体的凝胶形成组合物，

34、-通过以下方式水凝胶化所述凝胶形成组合物：

35、○如果所述凝胶形成组合物包含氧化酶，则与含有h2o2的流体或气体介质接触；

36、○或者如果所述凝胶形成组合物包含含有h2o2或能够原位产生h2o2的化合物，则与氧化酶接触。

37、本发明的再一个目标是制造水凝胶结构的另一种方法(下文称为制造水凝胶结构的第二种方法)，所述方法包括以下步骤：

38、-提供根据第二变体的凝胶形成组合物，

39、-通过以下方式水凝胶化所述凝胶形成组合物：

40、○如果所述凝胶形成组合物包含氧化酶，则与含有h2o2的流体或气体介质接触；

41、○或者如果所述凝胶形成组合物包含含有h2o2或能够原位产生h2o2的化合物，则与氧化酶接触。

42、这两种方法可以由生物打印工艺组成，以供用于制造：

43、-一维水凝胶结构，诸如颗粒(微米颗粒纳米颗粒)：例如，通过使用各种工艺(胶束溶液，在交联溶液中一滴一滴地)；或者

44、-二维水凝胶结构，诸如晶格/膜：例如，通过使用经典的成形工艺(旋涂、流延等)；或者

45、-三维水凝胶结构，例如通过使用三维生物打印，优选选自由以下项组成的组的工艺：喷墨生物打印、挤出生物打印、立体平版印刷生物打印和激光辅助生物打印。

46、这些示例决不是穷举性的，而仅仅是借助于示例给出的。

47、本发明的另一个目标是能够通过用于制造水凝胶结构的第一种方法获得的水凝胶，而不管所使用的生物打印工艺。所获得的水凝胶结构可用作细胞培养材料以支持细胞定殖(3d应用)或用作贴片或膏药(2d应用)。

48、本发明的再一个目标是能够通过用于制造水凝胶结构的第二种方法获得的水凝胶结构，而不管所使用的生物打印工艺。由此获得的水凝胶结构可用于组织再生。