预测分子的体内药代动力学的方法与流程

本发明涉及测定分子的体外药代动力学的方法、预测分子的体内药代动力学的方法、分子的筛选方法等。

背景技术：

1、在抗体药物等药物的开发过程中成为必要的药代动力学(pharmacokinetics；pk)的评价中，应用猴、小鼠等实验动物。但是，应用实验动物评价多数样本是困难的，预先锁定样本数后进行体内药代动力学的评价。此外，从伦理的观点看来，需要削减实验动物的使用数。从这些方面看来，基于体外分析的结果预测体内药代动力学的方法的重要性正在提高。

2、自以往，作为预测体内药代动力学的方法，已知利用应用细胞的体外分析的结果的方法(非专利文献1～3)。

3、grevys等公开了方法，其应用在人微小血管内皮细胞株(hmec1)中表达人胎儿性fc受体(fcrn)的细胞(hmec1-hfcrn)，通过命名为hera分析(基于人内皮细胞的再循环分析)的方法，在体外测定igg抗体经由fcrn向细胞外排出的量，预测转基因小鼠中的半衰期(非专利文献1)。

4、jaramillo等公开了，应用在madin-darby狗肾脏(mdck)细胞中表达人fcrn或大鼠fcrn的细胞，测定抗体经由fcrn透过该细胞的活性、即胞吞转运活性，由此进行抗体的体内清除率的分级(非专利文献2)。

5、chung等也公开了，与jaramillo等的方法同样地，应用在mdck细胞中表达人fcrn的细胞测定胞吞转运活性，观察到其测定结果与人中体内清除率之间存在相关关系(非专利文献3)。

6、现有技术文献

7、非专利文献

8、非专利文献1:grevys et al,nat commun.2018.vol.9:621

9、非专利文献2:jaramillo et al,mabs.2017.vol.9:781

10、非专利文献3:chung et al.j immunol方法s.2018.vol.462:101。

技术实现思路

0、发明概述

1、发明要解决的问题

2、基于应用细胞的体外分析的结果预测体内药代动力学的以往的方法的精度不充分。

3、例如，在grevys等的方法中，观察到从体外的测定结果算出的hera评分((r x/rwt)/(ra x/ra wt)：r表示在规定时间内在细胞中吸收的蛋白向细胞外放出的量，ra表示残存量，x表示目的蛋白(突变体)，wt表示结果的标准化中应用的亲本蛋白。)与体内药代动力学的相关性限于比较的抗体彼此的药代动力学的差异大的情形。此外，未显示能够预测具有如超过11天的长血中半衰期的抗体的体内药代动力学。

4、此外，在jaramillo等的方法中，在fc改变抗体的情形中，观察到在体外的胞吞转运活性(flux)的倒数和体内清除率之间存在相关关系，但在比较体内清除率的差异小的抗体彼此的情形中，未得到可以从体外的测定结果预测体内清除率的精度(参考非专利文献2的图6a)。此外，在对抗原不同的抗体进行分析的结果中，未观察到体外的数据和体内的数据之间存在相关关系(参考非专利文献2的图6b)。

5、在chung等的方法中，在比较体内清除率的差异小的抗体彼此的情形中，也未得到可以从体外的测定结果预测体内清除率的精度。

6、因此，本发明的目的是，提供基于体外药代动力学的测定结果，以比以往高的灵敏度，更准确地预测分子的体内药代动力学的方法等。

7、用于解决问题的手段

8、本发明人等对以往的方法中基于体外药代动力学的体内药代动力学的预测精度不充分的原因进行了深入研究。其结果发现，在以往的方法中，由于分子向细胞的吸收不充分而预测精度变低，通过增加分子向细胞的吸收量，预测精度提高。本发明人等基于这些知识通过进一步反复研究而完成了本发明。

9、即，本发明提供以下的发明。

10、[1]测定分子的体外药代动力学的方法，其包括以下的步骤：

11、(a)通过使分子与表达fcrn的细胞在水性介质中接触，以吸收量成为高于0.068pmol/2×10 5细胞的方式使前述分子吸收到前述细胞的步骤，该步骤具有选自下述(i)～(iii)的至少1个特征，

12、(i)前述分子与前述细胞的接触时间是5小时以上，

13、(ii)不在酸性条件下洗涤与前述分子接触后的前述细胞，和

14、(iii)前述细胞在细胞表面表达前述分子的靶标，以及

15、(b)测定前述分子的体外药代动力学的步骤，

16、其中前述分子包含fcrn结合结构域。

17、[2][1]中记载的方法，其中分子是包含fcrn结合结构域和靶标结合结构域的抗体。

18、[3][1]或[2]中记载的方法，其中前述细胞是以表达fcrn的方式转化的细胞。

19、[4][1]～[3]的任一项中记载的方法，其中前述细胞是以在细胞表面表达前述分子的靶标的方式转化的细胞。

20、[5][3]或[4]中记载的方法，其中前述细胞是cho细胞、hek293细胞、cos-1细胞、cos-7细胞、mdck细胞、hmec1细胞、hela细胞、hepg2细胞、或baf细胞。

21、[6][1]或[2]中记载的方法，其中前述细胞是肝脏实质细胞、肝脏非实质细胞、肝窦内皮细胞、kupffer细胞、人脐静脉内皮细胞、外周血单核细胞pbmc、巨噬细胞、单核细胞、b细胞、t细胞、血小板、nk细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、粒细胞、或树突细胞。

22、[7][1]～[6]的任一项中记载的方法，其中以吸收量成为高于0.10pmol/2×105细胞的方式使前述分子吸收到前述细胞。

23、[8][1]～[7]的任一项中记载的方法，其中体外药代动力学是从细胞内向培养液中的排出量、从细胞内向培养液中的排出速度、内化速度、胞吞转运量、kp值、细胞内分子减少速度、与fcrn或靶标的结合速度、或从fcrn或靶标的解离速度。

24、[9][1]～[8]的任一项中记载的方法，其中fcrn是人fcrn、猴fcrn、迷你猪fcrn、大鼠fcrn、小鼠fcrn、兔fcrn、狗fcrn、或豚鼠fcrn。

25、[10][1]～[9]的任一项中记载的方法，其进一步包括以下的步骤：

26、(c)从步骤(b)中得到的测定结果，算出体外评价参数的步骤。

27、[11][10]中记载的方法，其中体外评价参数是清除指数或hera评分。

28、[12][1]～[11]的任一项中记载的方法，其用于包含前述分子的药物的品质确保或药效的预测。

29、[13][1]～[12]的任一项中记载的方法，其中前述分子的靶标是膜蛋白。

30、[14][13]中记载的方法，其中前述分子的靶标是人il6受体。

31、[15]预测分子的体内药代动力学的方法，其包括：

32、(a’)通过[1]～[14]的任一项中记载的方法，测定体外药代动力学的步骤，和

33、(b’)从步骤(a’)中得到的测定值或体外评价参数，预测将前述分子施用于生物体的情形中的体内药代动力学的步骤。

34、[16][15]中记载的方法，其中体内药代动力学是生物利用度、分布容积、血中非结合型分数、清除率、尿中排泄率、血中浓度半衰期、或平均滞留时间。

35、[17][15]或[16]中记载的方法，其中生物体是人、猴、迷你猪、大鼠、小鼠、兔、狗、或豚鼠。

36、[18][15]～[17]的任一项中记载的方法，其作为应用动物的药代动力学试验的替代使用。

37、[19]分子的筛选方法，其包括：

38、(a”)准备与同一靶标结合的不同的2个以上分子的步骤，

39、(b”)分别对步骤(a”)中准备的2个以上分子，通过[1]～[14]的任一项中记载的方法，测定体外药代动力学的步骤，和

40、(c”)将步骤(b”)中得到的2个以上分子各自的测定值或体外评价参数相互比较，选择显示期望的值的分子的步骤。

41、发明效果

42、根据本发明，基于体外药代动力学的测定结果，能够以比以往高的灵敏度，更准确地预测分子的体内药代动力学。因此，在药物的开发阶段初期，可简便地以高精度预测多个候选物质的体内药代动力学。

43、此外，本发明通过削减体内药代动力学试验的次数，可以有助于实验动物的使用数削减。

44、进一步，本发明通过提供高效筛选具有期望的药代动力学的药剂的方法，可以有助于药理效果更高的药物的开发。