ERT2突变体及其用途的制作方法

背景技术：

1、雌激素受体(er)是一种配体依赖性转录因子，它结合内源性激素配体(诸如雌激素和雌二醇)。结合至er的合成配体已经被开发用于治疗er阳性癌症(诸如er阳性乳腺癌)。例如，药物他莫昔芬的活性代谢物诱导er的核易位并且以组织选择性方式拮抗er。他莫昔芬及其活性代谢物也被用作研究环境中控制核定位的工具。例如，称为ert2的er配体结合结构域变体已经被广泛用作具有cre重组酶的融合蛋白，该cre重组酶调控动物模型系统中的基于cre重组酶的基因编辑。使用合成配体来操纵核定位的能力也可用于治疗应用，诸如用于治疗性基因的调控。因此，具有改善的针对合成配体的敏感性和/或选择性的基于ert2的系统可用于在临床环境中采用基于ert2的基因调控。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本文提供了具有改善的针对非内源性配体(诸如他莫昔芬及其代谢物)的敏感性和/或选择性的经修饰的雌激素受体配体结合结构域(er-lbd)。在一些实施方案中，本文还提供了包含如本文所述的经修饰的er-lbd的嵌合蛋白，基因开关，编码如本文所述的经修饰的er-lbd和嵌合蛋白的多核苷酸分子，编码如本文所述的多核苷酸分子或表达如本文所述的经修饰的er-lbd和嵌合蛋白的细胞，以及如本文所述的经修饰的er-lbd、嵌合蛋白、多核苷酸分子、基因开关或细胞的使用方法。

2、与ert2相比，本文所述的经修饰的er-lbd和嵌合蛋白具有更高的针对非内源性配体(例如，4-羟基他莫昔芬，也称为“4-oht”)的敏感性和/或选择性。ert2是er的配体结合结构域，它包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代和l544a氨基酸取代(参见seq id no:2)。除了g400v/m543a/l544a之外，ert2还可以包含v595a氨基酸取代(参见seq id no:3)。他莫昔芬的典型临床剂量后的平均峰值血浆浓度在纳摩尔范围内(例如，大约40ng/ml)。然而，野生型ert2对他莫昔芬代谢物(例如，因多昔芬和4-oht)的敏感性太低，无法用于在纳摩尔浓度的代谢物处调控基因表达。此外，ert2可以对内源性配体(诸如雌二醇)具有反应性。因此，具有改善的针对经修饰的er-lbd和包含经修饰的er-lbd的嵌合蛋白的非内源性配体的敏感性和/或选择性允许使用基于er的系统来控制基因调控。

3、本文提供了经修饰的雌激素受体配体结合结构域(er-lbd)，所述经修饰的er-lbd包含对应于seq id no:1的氨基酸282-595的氨基酸序列，其中所述经修饰的er-lbd包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代和l544a氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代，其中所述一个或多个另外的氨基酸取代在seq id no:1的区域内，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463和位置517-540以及位置547，并且其中与包含seq id no:2的氨基酸序列的er-lbd相比，或者由于一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的敏感性和/或选择性。在一些方面，经修饰的er-lbd还包含v595a氨基酸取代。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

4、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代处于seq id no:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。

5、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置343。在一些方面，seqid no:1的位置343处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m343f、m343i、m343l和m343v。

6、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置344。在一些方面，seqid no:1的位置344处的氨基酸取代是g344m。

7、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置345。在一些方面，seqid no:1的位置345处的氨基酸取代是l345s。

8、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置346。在一些方面，seqid no:1的位置346处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l346i、l346m、l346f和l346v。

9、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置347。在一些方面，seqid no:1的位置347处的氨基酸取代选自由以下组成的组：t347d、t347e、t347f、t347i、t347k、t347l、t347m、t347n、t347q、t347r、t347s和t347v。

10、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置348。在一些方面，seqid no:1的位置348处的氨基酸取代是n348k。

11、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置349。在一些方面，seqid no:1的位置349处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l349i、l349m、l349f和l349v。

12、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置350。在一些方面，seqid no:1的位置350处的氨基酸取代选自由以下组成的组：a350f、a350i、a350l、a350m和a350v。

13、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置351。在一些方面，seqid no:1的位置351处的氨基酸取代选自由以下组成的组：d351e、d351f、d351i、d351l、d351m、d351n、d351q和d351v。

14、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置352。在一些方面，seqid no:1的位置352处的氨基酸取代是r352k。

15、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置354。在一些方面，seqid no:1的位置354处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l354i、l354m、l354f和l354v。

16、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置380。在一些方面，seqid no:1的位置380处的氨基酸取代是e380q。

17、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置384。在一些方面，seqid no:1的位置384处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l384i、l384m、l384f和l384v。

18、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置386。在一些方面，seqid no:1的位置386处的氨基酸取代是i386v。

19、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置387。在一些方面，seqid no:1的位置387处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l387i、l387m、l387f和l387v。

20、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置388。在一些方面，seqid no:1的位置388处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m388i、m388l和m388f。

21、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置389。在一些方面，seqid no:1的位置389处的氨基酸取代是i389m。

22、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置391。在一些方面，seqid no:1的位置391处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l391i、l391m、l391f和l391v。

23、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置392。在一些方面，seqid no:1的位置392处的氨基酸取代是v392m。

24、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置404。在一些方面，seqid no:1的位置404处的氨基酸取代选自由以下组成的组：f404i、f404l、f404m和f404v。

25、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置407。在一些方面，seqid no:1的位置407处的氨基酸取代是n407d。

26、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置409。在一些方面，seqid no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v。

27、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置413。在一些方面，seqid no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d。

28、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置414。在一些方面，seqid no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e。

29、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置417。在一些方面，seqid no:1的位置417处的氨基酸取代是c417s。

30、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置418。在一些方面，seqid no:1的位置418处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v418i、v418l、v418m和v418f。

31、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置420。在一些方面，seqid no:1的位置420处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g420i、g420m、g420f和g420v。

32、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置421。在一些方面，seqid no:1的位置421处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m421i、m421l、m421f和m421v。

33、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置422。在一些方面，seqid no:1的位置422处的氨基酸取代是v422i。

34、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置424。在一些方面，seqid no:1的位置424处的氨基酸取代选自由以下组成的组：i424l、i424m、i424f和i424v。

35、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置428。在一些方面，seqid no:1的位置428处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l428i、l428m、l428f和l428v。

36、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置463。在一些方面，seqid no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p。

37、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置517。在一些方面，seqid no:1的位置517处的氨基酸取代是m517a。

38、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置521。在一些方面，seqid no:1的位置521处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g521a、g521f、g521i、g521l、g521m和g521v。

39、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置522。在一些方面，seqid no:1的位置522处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m522i、m522l和m522v。

40、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置524。在一些方面，seqid no:1的位置524处的氨基酸取代选自由以下组成的组：h524a、h524i、h524l、h524f和h524v。

41、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置525。在一些方面，seqid no:1的位置525处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l525f、l525i、l525m、l525n、l525q、l525s、l525t和l525v。

42、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置526。在一些方面，seqid no:1的位置526处的氨基酸取代是y526l。

43、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置527。在一些方面，seqid no:1的位置527处的氨基酸取代是s527n。

44、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置528。在一些方面，seqid no:1的位置528处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m528f、m528i和m528v。

45、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置533。在一些方面，seqid no:1的位置533处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v533f和v533w。

46、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置534。在一些方面，seqid no:1的位置534处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v534q和v534r。

47、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置536。在一些方面，seqid no:1的位置536处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l536f和l536m、l536r和l536y。

48、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置537。在一些方面，seqid no:1的位置537处的氨基酸取代选自由以下组成的组：y537e和y537s。

49、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置538。在一些方面，seqid no:1的位置538处的氨基酸取代选自由以下组成的组：d538g和d538k。

50、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置539。在一些方面，seqid no:1的位置539处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l539a和l539r。

51、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置540。在一些方面，seqid no:1的位置540处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l540a和l540f。

52、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置547。在一些方面，seqid no:1的位置547处的氨基酸取代是h547a。

53、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是两个氨基酸取代。在一些方面，所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置345和348，并且其中seq id no:1的位置345处的氨基酸取代是l345s，并且其中seq id no:1的位置348处的氨基酸取代是n348k。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384和389，并且其中seqid no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，并且其中seq id no:1的位置389处的氨基酸取代是i389m。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置421和392，并且其中seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421i，并且其中seq id no:1的位置392处的氨基酸取代是v392m。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和391，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，并且其中seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和384，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和387，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，并且其中seqid no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于位置387和391，并且其中seq id no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m，并且其中seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384和387，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，并且其中seqid no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m。在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq idno:1的位置384和391，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，并且其中seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。

54、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是三个氨基酸取代。在一些方面，所述三个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、414、418、463、521、524和525。在一些方面，所述三个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384和391，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，并且seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。在一些方面，所述三个氨基酸取代处于seq id no:1的位置414、463和524，并且其中seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。

55、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是四个氨基酸取代。在一些方面，所述四个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、384、388、391、404、413、418、463、521、524和525。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384、391和418，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f，并且seq id no:1的位置418处的氨基酸取代是v418i。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置343、388、521和404，并且其中seq id no:1的位置343处的氨基酸取代是m343i，seq id no:1的位置388处的氨基酸取代是m388i，seq id no:1的位置521处的氨基酸取代是g521i，并且seq id no:1的位置404处的氨基酸取代是f404l。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置524、347、351和525，并且其中seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524v，seq id no:1的位置347处的氨基酸取代是t347r，seq id no:1的位置351处的氨基酸取代是d351q，并且seq id no:1的位置525处的氨基酸取代是l525n。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384、391和463，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，并且seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p。在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384、391、413和524，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。

56、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是五个氨基酸取代。在一些方面，所述五个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524，在一些方面，所述五个氨基酸取代处于seqid no:1的位置384、409、413、463和524，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于seq id no:1的位置391、413、414、463和524，并且其中seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq idno:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于seq id no:1的位置391、414、421、463和524，并且其中seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、409、413、421和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。在一些方面，所述五个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、409、421、463和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq idno:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。

57、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是六个氨基酸取代。在一些方面，所述六个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463和524。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于seqid no:1的位置384、391、413、421、463和524，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于seq id no:1的位置409、413、414、421、463和524，并且其中seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。在一些方面，所述六个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、391、409、413、414和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。

58、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是七个氨基酸取代。在一些方面，所述七个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：354、384、391、409、413、414、421、463、517和524。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384、409、413、421、463和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq idno:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、391、413、421、463、517和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq idno:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，seq id no:1的位置517处的氨基酸取代是m517a，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524l。在一些方面，所述七个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、391、413、414、421、517和524，并且其中seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置414处的氨基酸取代是q414e，seq idno:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置517处的氨基酸取代是m517a，并且seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。

59、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代是八个氨基酸取代。在一些方面，所述八个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384、391、409、413、421、463、517和524，并且其中seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391v，seq id no:1的位置409处的氨基酸取代是l409v，seq id no:1的位置413处的氨基酸取代是n413d，seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421l，seq id no:1的位置463处的氨基酸取代是s463p，seq id no:1的位置517处的氨基酸取代是m517a，并且seqid no:1的位置524处的氨基酸取代是h524f。

60、本文还提供了包含融合至如本文所述的经修饰的er-lbd的所关注的多肽的嵌合蛋白。在一些方面，所关注的多肽包含核酸结合结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指结构域。在一些方面，锌指结构域包含序列msrpgerpfqcricmrnfsnmsnltrhtrthtgekpfqcricmrnfsdrsvlrrhlrthtgsqkpfqcricmrnfsdpsnlarhtrthtgekpfqcricmrnfsdrsslrrhlrthtgsqkpfqcricmrnfsqsgtlhrhtrthtgekpfqcricmrnfsqrpnltrhlrthlrgs(seq id no:62)。在一些方面，嵌合蛋白包含嵌合转录因子，并且其中所关注的多肽包含核酸结合结构域和转录调控子结构域。在一些方面，转录模块结构域是转录激活因子。在一些方面，转录激活因子选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒蛋白16(vp16)激活结构域；包含vp16的四个串联拷贝的激活结构域；vp64激活结构域；nfκb的p65激活结构域(p65)；爱泼斯坦-巴尔病毒r反式激活因子(rta)激活结构域；包含vp64、p65和rta激活结构域(vpr激活结构域)的三元激活因子；包含vp64、p65和hsf1激活结构域(vph激活结构域)的三元激活因子；和人e1a相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶核心结构域(p300 hat核心激活结构域)。在一些方面，转录模块结构域是p65转录激活因子，所述p65转录激活因子包含氨基酸序列defptmvfpsgqisqasalapappqvlpqapapapapamvsalaqapapvpvlapgppqavappapkptqagegtlseallqlqfddedlgallgnstdpavftdlasvdnsefqqllnqgipvaphttepmlmeypeaitrlvtgaqrppdpapaplgapglpngllsgdedfssiadmdfsallsqiss(seq id no:64)。

61、本文还提供了分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码如本文所述的经修饰的er-lbd或编码如本文所述的嵌合蛋白的核苷酸序列。

62、本文还提供了异源性构建体，所述异源性构建体包含可操作地连接至如本文所述的多核苷酸分子的启动子。

63、本文还提供了包含如本文所述的异源性构建体的质粒。

64、本文还提供了包含如本文所述的异源性构建体或如本文所述的质粒的细胞。

65、本文还提供了用于调控所关注的基因的转录的基因开关，所述基因开关包含：(a)如本文所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白结合至嵌合转录因子响应性(ctf响应性)启动子，所述启动子可操作地连接至所关注的基因；和(b)非内源性配体，其中所述非内源性配体与经修饰的er-lbd的结合诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。

66、在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

67、在一些方面，所关注的基因编码选自由以下组成的组的多肽：细胞因子、趋化因子、归巢分子、生长因子、细胞死亡调控因子、共活化分子、肿瘤微环境调节物a、受体、配体、抗体、多核苷酸、肽和酶。

68、在一些方面，所关注的基因编码选自由以下组成的组的细胞因子：il1-β、il-2、il4、il6、il7、il10、il12、il12p70融合蛋白、il15、il17a、il18、il21、il22、i型干扰素、干扰素-γ和tnf-α；和/或

69、在一些方面，所关注的基因编码il12p70融合蛋白，所述il12p70融合蛋白包含氨基酸序列mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcsgggsgggsgggsgggsrnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnas(seq id no:58)。

70、本文还提供了一种调控所关注的基因的转录的方法，所述方法包括：用(i)编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含嵌合转录因子响应性(ctf响应性)启动子的靶标表达盒来转化细胞，所述启动子可操作地连接至所关注的基因，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。在一些方面，所述方法还包括在诱导嵌合蛋白调控转录之前在适合于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞。在一些方面，调控转录包括活化所关注的基因的转录。在一些方面，靶标表达盒由编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体编码，或者靶标表达盒由第二异源性构建体编码。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

71、本文还提供了一种调控嵌合蛋白的定位的方法，所述方法包括用编码如本文所述的嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，以及通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白的核定位。在一些方面，所述方法还包括在诱导核定位之前在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞。在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

72、在一些方面，经转化的细胞在人或动物中，并且其中使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的配体施用于人或动物。

73、在一些方面，非内源性配体以非内源性配体对seq id no:1的野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。

74、本文提供了经修饰的er-lbd，所述经修饰的er-lbd包含对应于seq id no:1的氨基酸282-595的氨基酸序列和在seq id no:1的区域内的一个或多个另外的氨基酸取代，所述区域选自由以下组成的组：位置343-354、位置380-392、位置404-463、位置517-540和位置547。在一些方面，如本文所述的经修饰的er-lbd还包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代和l544a氨基酸取代。在一些方面，经修饰的er-lbd还包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代、l544a和v595a氨基酸取代。

75、在一些方面，经修饰的er-lbd包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代和l544a氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代。在一些方面，与包含seq id no:2的氨基酸序列的er-lbd相比，经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些方面，与包含seq id no:2的氨基酸序列的er-lbd相比，经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的选择性。

76、在一些方面，经修饰的er-lbd包含g400v氨基酸取代、m543a氨基酸取代、l544a氨基酸取代和v595a氨基酸取代以及一个或多个另外的氨基酸取代。在一些方面，与包含seqid no:3的氨基酸序列的er-lbd相比，经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的敏感性。在一些方面，与包含seq id no:3的氨基酸序列的er-lbd相比，经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的选择性。

77、在一些方面，由于一个或多个另外的氨基酸取代，与内源性配体相比，本公开的经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的敏感性。

78、在一些方面，与包含seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列的er-lbd相比，本公开的经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的敏感性。

79、在一些方面，与包含seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列的er-lbd相比，本公开的经修饰的er-lbd具有更高的针对非内源性配体的选择性。

80、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代处于seq id no:1的一个或多个位置，所述一个或多个位置选自由以下组成的组：343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、354、380、384、386、387、388、389、391、392、404、407、409、413、414、417、418、420、421、422、424、428、463、517、521、522、524、525、526、527、528、533、534、536、537、538、539、540和547。

81、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置343。在一些方面，位置343处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m343f、m343i、m343l和m343v。

82、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置344。在一些方面，位置344处的氨基酸取代是g344m。

83、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置345。在一些方面，位置345处的氨基酸取代是l345s。

84、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置346。在一些方面，位置346处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l346i、l346m、l346f和l346v。

85、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置347。在一些方面，位置347处的氨基酸取代选自由以下组成的组：t347d、t347e、t347f、t347i、t347k、t347l、t347m、t347n、t347q、t347r、t347s和t347v。

86、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置348。在一些方面，位置348处的氨基酸取代是n348k。

87、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置349。在一些方面，位置349处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l349i、l349m、l349f和l349v。

88、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置350。在一些方面，位置350处的氨基酸取代选自由以下组成的组：a350f、a350i、a350l、a350m和a350v。

89、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置351。在一些方面，位置351处的氨基酸取代选自由以下组成的组：d351e、d351f、d351i、d351l、d351m、d351n、d351q和d351v。

90、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置352。在一些方面，位置352处的氨基酸取代是r352k。

91、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置354。在一些方面，位置354处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l354i、l354m、l354f和l354v。

92、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置380。在一些方面，位置380处的氨基酸取代是e380q。

93、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置384。在一些方面，位置384处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l384i、l384m、l384f和l384v。

94、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置386。在一些方面，位置386处的氨基酸取代是i386v。

95、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置387。在一些方面，位置387处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l387i、l387m、l387f和l387v。

96、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置388。在一些方面，位置388处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m388i、m388l和m388f。

97、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置389。在一些方面，位置389处的氨基酸取代是i389m。

98、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置391。在一些方面，位置391处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l391i、l391m、l391f和l391v。

99、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置392。在一些方面，位置392处的氨基酸取代是v392m。

100、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置404。在一些方面，位置404处的氨基酸取代选自由以下组成的组：f404i、f404l、f404m和f404v。

101、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置407。在一些方面，位置407处的氨基酸取代是n407d。

102、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置409。在一些方面，位置409处的氨基酸取代是l409v。

103、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置413。在一些方面，位置413处的氨基酸取代是n413d。

104、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置414。在一些方面，位置414处的氨基酸取代是q414e。

105、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置417。在一些方面，位置417处的氨基酸取代是c417s。

106、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置418。在一些方面，位置418处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v418i、v418l、v418m和v418f。

107、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置420。在一些方面，位置420处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g420i、g420m、g420f和g420v。

108、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置421。在一些方面，位置421处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m421i、m421l、m421f和m421v。

109、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置422。在一些方面，位置422处的氨基酸取代是v422i。

110、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置424。在一些方面，位置424处的氨基酸取代选自由以下组成的组：i424l、i424m、i424f和i424v。

111、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置428。在一些方面，位置428处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l428i、l428m、l428f和l428v。

112、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置463。在一些方面，位置463处的氨基酸取代是s463p。

113、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置517。在一些方面，位置517处的氨基酸取代是m517a。

114、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置521。在一些方面，位置521处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g521a、g521f、g521i、g521l、g521m和g521v。

115、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置522。在一些方面，位置522处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m522i、m522l和m522v。

116、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置524。在一些方面，位置524处的氨基酸取代选自由以下组成的组：h524a、h524i、h524l、h524f和h524v。

117、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置525。在一些方面，位置525处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l525f、l525i、l525m、l525n、l525q、l525s、l525t和l525v。

118、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置526。在一些方面，位置526处的氨基酸取代是y526l。

119、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置527。在一些方面，位置527处的氨基酸取代是s527n。

120、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置528。在一些方面，位置528处的氨基酸取代选自由以下组成的组：m528f、m528i和m528v。

121、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置533。在一些方面，位置533处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v533f和v533w。

122、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置534。在一些方面，位置534处的氨基酸取代选自由以下组成的组：v534q和v534r。

123、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置536。在一些方面，位置536处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l536f和l536m、l536r和l536y。

124、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置537。在一些方面，位置537处的氨基酸取代选自由以下组成的组：y537e和y537s。

125、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置538。在一些方面，位置538处的氨基酸取代选自由以下组成的组：d538g和d538k。

126、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置539。在一些方面，位置539处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l539a和l539r。

127、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置540。在一些方面，位置540处的氨基酸取代选自由以下组成的组：l540a和l540f。

128、在一些方面，所述一个或多个位置包括seq id no:1的位置547。在一些方面，位置547处的氨基酸取代是h547a。

129、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括两个氨基酸取代。在一些方面，所述两个氨基酸取代中的每个氨基酸取代处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：343、345、347、348、351、354、384、387、388、389、391、392、404、418、421、521、524和525。

130、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置345和348。在一些方面，在seq id no:1的位置345处的氨基酸取代是l345s并且在seq id no:1的位置348处的氨基酸取代是n348k。

131、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384和389。在一些方面，在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m并且在seq id no:1的位置389处的氨基酸取代是i389m。

132、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置421和392。在一些方面，在seq id no:1的位置421处的氨基酸取代是m421i并且在seq id no:1的位置392处的氨基酸取代是v392m。

133、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和391。在一些方面，在seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i并且在seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。

134、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和384。在一些方面，在seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i并且在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m。

135、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354和387。在一些方面，在seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i并且在seq id no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m。

136、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于位置387和391。在一些方面，在seq id no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m并且在seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。

137、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384和387。在一些方面，在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m并且在seq id no:1的位置387处的氨基酸取代是l387m。

138、在一些方面，所述两个氨基酸取代处于seq id no:1的位置384和391。在一些方面，在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m并且在seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。

139、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括三个氨基酸取代。在一些方面，所述三个氨基酸取代各自处于seq id no:1的选自由以下组成的组的位置：343、347、351、354、388、391、404、418、521、524和525。

140、在一些方面，所述三个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384和391。在一些方面，在seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，并且在seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f。

141、在一些方面，所述一个或多个另外的氨基酸取代包括四个氨基酸取代。

142、在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置354、384、391和418。在一些方面，在seq id no:1的位置354处的氨基酸取代是l354i，在seq id no:1的位置384处的氨基酸取代是l384m，在seq id no:1的位置391处的氨基酸取代是l391f，并且在seq idno:1的位置418处的氨基酸取代是v418i。

143、在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置343、388、521和404。在一些方面，在seq id no:1的位置343处的氨基酸取代是m343i，在seq id no:1的位置388处的氨基酸取代是m388i，在seq id no:1的位置521处的氨基酸取代是g521i，并且在seq idno:1的位置404处的氨基酸取代是f404l。

144、在一些方面，所述四个氨基酸取代处于seq id no:1的位置524、347、351和525。在一些方面，在seq id no:1的位置524处的氨基酸取代是h524v，在seq id no:1的位置347处的氨基酸取代是t347r，在seq id no:1的位置351处的氨基酸取代是d351q，并且在seq idno:1的位置525处的氨基酸取代是l525n

145、在一些方面，非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬(4-oht)、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

146、还提供了包含融合至如本文所述的经修饰的er-lbd的所关注的多肽的嵌合蛋白。在一些方面，所关注的多肽包含核酸结合结构域。在一些方面，核酸结合结构域包括锌指(zf)结构域。在一些方面，嵌合蛋白是转录因子，并且所关注的多肽包含转录调控子结构域。

147、还提供了编码如本文所述的经修饰的er-lbd或如本文所述的嵌合蛋白的分离的多核苷酸分子。

148、还提供了包含可操作地连接至编码如本文所述的经修饰的er-lbd或如本文所述的嵌合蛋白的多核苷酸分子的启动子的异源性构建体。

149、还提供了包含如本文所述的异源性构建体的质粒。

150、还提供了包含如本文所述的异源性构建体或如本文所述的质粒的细胞(诸如，分离的细胞或细胞群)。

151、还提供了用于调控所关注的基因的转录的基因开关。在一些方面，基因开关包括包含如本文所述的经修饰的er-lbd和转录调控子的嵌合蛋白，以及非内源性配体，其中非内源性配体与经修饰的er-lbd的结合诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。在一些方面，基因开关的非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬(4-oht)、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

152、本文还提供了一种调控所关注的基因的转录的方法。在一些方面，所述方法包括(a)用(i)编码包含经修饰的er-lbd和转录调控子结构域的嵌合蛋白的异源性构建体和(ii)包含所关注的基因的靶标表达盒来转化细胞；(b)在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及

153、(c)通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白调控所关注的基因的转录。

154、在一些方面，调控转录的方法是活化转录的方法。

155、在一些方面，调控转录的方法是抑制转录的方法。

156、在一些方面，靶标表达盒由编码嵌合体的异源性构建体编码。

157、在一些方面，靶标表达盒由与编码嵌合体的异源性构建体不同的异源性构建体编码。

158、还提供了一种调控所关注的多肽的定位的方法。在一些方面，所述方法包括(a)用编码嵌合蛋白的异源性构建体来转化细胞，所述嵌合蛋白包含融合至如本文所述的经修饰的er-lbd的所关注的多肽；(b)在适于嵌合蛋白的表达的条件下培养经转化的细胞；以及(c)通过使经转化的细胞与非内源性配体接触来诱导嵌合蛋白的核定位。

159、在一些方面，本文所述的方法中的任一种的经转化的细胞在人或动物中。在一些方面，使经转化的细胞与非内源性配体接触包括将药理学剂量的配体施用于人或动物。

160、在一些方面，前述方法的步骤(c)的非内源性配体选自由以下组成的组：4-羟基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、他莫昔芬-n-氧化物和因多昔芬。

161、在一些实施方案中，非内源性配体以非内源性配体对野生型雌激素受体α基本上无活性的浓度施用。