结合至CD20、NKP46、CD16并缀合至IL-2的多特异性抗体的制作方法

本公开涉及多特异性结合蛋白，其包含第一抗原结合结构域(abd)和第二抗原结合结构域、细胞因子部分以及免疫球蛋白fc区或其变体的全部或部分，其中第一abd特异性结合至人cd20并且第二abd特异性结合至人nkp46，并且任选地其中免疫球蛋白fc区或其变体的全部或部分结合至人cd16。本公开的多特异性结合蛋白可以有利地重定向效应细胞以经由多种受体裂解感兴趣的表达cd20的细胞。本公开还涉及制备所述结合蛋白的方法、其组合物以及它们的用途，包括治疗疾病，包括涉及表达cd20的细胞的疾病。

背景技术：

1、自然杀伤(nk)细胞是参与非常规免疫的淋巴细胞亚群。nk细胞提供了有效的免疫监视机制，通过该免疫监视机制可以消除不期望的细胞，诸如肿瘤或病毒感染的细胞。nk细胞的特征和生物学性质包括表面抗原(包括cd16、cd56和/或cd57)的表达、细胞表面上α/β或γ/δtcr复合物的缺失、以mhc-非限制性方式结合并杀伤细胞(特别是不能通过活化特异性溶细胞酶来表达“自身”mhc/hla抗原的细胞)的能力、杀伤表达nk活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞的能力，以及释放刺激免疫应答的称为细胞因子的蛋白质分子的能力。

2、由于自然杀伤(nk)细胞潜在的抗肿瘤性质，人们也对它们产生了兴趣。wo2017114694报道了nkp46结合蛋白的可变区，用于产生具有特异性地重定向nk细胞以裂解感兴趣的靶细胞的能力的多特异性蛋白质。然而，当il-2与ifn-α一起施用时，nk细胞已被证明通过它们的过度活化以及分泌多种炎性细胞因子而在小鼠中引起毒性(rothschilds等人，oncoimmunology.2019；8(5):)。此外，nk细胞还被证明引起细胞因子il-15的毒性，该细胞因子也通过il-2rβy进行传导信号(参见引用以下文献的wo2020247843：guo等人，j immunol.2015；195(5):2353-64)。

3、由细胞因子诸如il-2介导的免疫毒性的一个潜在解决方案是将该细胞因子与肿瘤特异性抗体融合或缔合。然而，据发现，虽然il-2与抗肿瘤抗体在体内抗肿瘤中确实有协同作用，但在相同分子中包含il-2和抗肿瘤抗原抗体没有呈现出疗效或毒性优势。il-2部分完全控制生物分布，这解释了以下观察结果：当与抗体组合时，识别无关抗原的免疫细胞因子的表现与肿瘤特异性免疫细胞因子相当(tzeng等人，proc natl acad sci usa.2015年3月17日；112(11):3320-332)。

4、关于细胞因子对nk细胞的影响的研究通常集中在单一细胞因子或简单的组合。最近，已经报道了单独和组合的il-15、il-18、il-21和ifn-α，以及它们与il-2协同作用的潜力，并且非常低浓度的先天性和适应性共同γ链细胞因子与同样低浓度的il-18协同作用以驱动快速和有效的nk细胞的cd25和ifn-γ表达(nielsen等人，front immunol.2016；7:101)。然而，向人类施用细胞因子涉及毒性，这使得与细胞因子的组合治疗具有挑战性。此外，对nk细胞中的细胞因子受体信号传导途径与其他活化受体之间的潜在协同作用或相互作用知之甚少。因此，需要在疾病、特别是癌症的治疗中动员nk细胞的新方法。

5、仍然迫切需要用于治疗或预防增生性病症诸如cd20阳性b-非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)或骨髓增生异常综合征(mds)的活性剂。

6、还需要具有治疗效果的新型nk接合剂。

7、还需要更容易制造和/或施用、没有副作用或副作用减少的新化合物。具体地，需要在患者中没有细胞因子释放综合征或降低细胞因子释放综合征风险的新化合物。

8、nk细胞具有介导抗肿瘤免疫的潜力。

技术实现思路

1、本发明源于功能性多特异性结合蛋白的发现，所述功能性多特异性结合蛋白结合至nk细胞上的nkp46和细胞因子受体(例如cd122)，任选地进一步结合nk细胞上的cd16a，并且还结合至靶细胞上的肿瘤抗原cd20，其中多特异性蛋白质能够增加nk细胞对表达感兴趣的抗原的靶细胞(例如导致疾病的细胞、癌细胞)的细胞毒性。

2、在一个实施方案中，本公开涉及包含seq id no:1的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列的多肽。该多肽可以与一个或两个另外的多肽缔合(例如二聚化或组合)以形成特异性结合至人cd20、人nkp46、人cd122和任选的人cd16的结合蛋白(例如多聚体结合蛋白)。还提供了包含这样的一个、两个或三个多肽或多肽链的多聚体(例如二聚体、三聚体)结合蛋白，以及产生多聚体(例如二聚体、三聚体)结合蛋白的方法。

3、在一个实施方案中，本公开涉及特异性结合至人cd20、人nkp46、人cd122和任选的人cd16的结合蛋白(例如多聚体蛋白质)，其中所述蛋白包含具有seq id no:1的氨基酸序列的第一(i)多肽和具有seq id no:70的氨基酸序列的第二(ii)多肽。

4、在一个实施方案中，本公开涉及特异性结合至人cd20、人nkp46、人cd122和任选的人cd16的多聚体结合蛋白，其中所述蛋白包含具有seq id no:1的氨基酸序列的第一(i)多肽链、具有seq id no:9的氨基酸序列的第二(ii)多肽链和具有seq id no:17的氨基酸序列的第三(iii)多肽链。

5、在一个实施方案中，本公开涉及特异性结合至人cd20、人nkp46、人cd122和任选的人cd16的多聚体结合蛋白，其中所述蛋白包含具有seq id no:1的氨基酸序列的第一(i)多肽链、具有seq id no:73的氨基酸序列的第二(ii)多肽链和具有seq id no:74的氨基酸序列的第三(iii)多肽链。

6、在一个实施方案中，本公开涉及特异性结合至人cd20、人nkp46、人cd122和任选的人cd16的多聚体结合蛋白，其中所述蛋白包含具有seq id no:66的氨基酸序列的第一(i)多肽链、具有seq id no:67的氨基酸序列的第二(ii)多肽链和具有seq id no:17的氨基酸序列的第三(iii)多肽链。

7、在一个实施方案中，提供了结合蛋白(例如本公开的多聚体蛋白质)，该结合蛋白包含具有与seq id no:1或66的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的第一(i)多肽、具有与seq id no:6、67、70或73的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的第二(ii)多肽，以及任选地具有与seq id no:17或74的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的第三(iii)多肽。

8、在一个实施方案中，提供了一种多聚体结合蛋白(例如，本公开的蛋白)，该多聚体结合蛋白包含第一抗原结合结构域(abd)和第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域包含免疫球蛋白重链可变结构域(vh)和免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)，其中每个vh和vl包含三个互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)；并且其中

9、(i)所述第一抗原结合结构域(abd)特异性结合至人cd20并且包含：

10、-包含对应于seq id no:29(hcdr1)、seq id no:32(hcdr2)、seq id no:35(hcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vh1，以及

11、-包含对应于seq id no:38(lcdr1)、seq id no:41(lcdr2)、seq id no:44(lcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vl1；

12、(ii)所述第二抗原结合结构域(abd)特异性结合至人nkp46并且包含：

13、-包含对应于seq id no:47(hcdr1)、seq id no:50(hcdr2)、seq id no:53(hcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vh2，以及

14、-包含对应于seq id no:56(lcdr1)、seq id no:59(lcdr2)、seq id no:62(lcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vl2。

15、在一个具体实施方案中，根据本公开的多聚体结合蛋白包含变体il-2多肽，所述变体il-2包含seq id no:65的氨基酸序列。

16、在一个具体实施方案中，本公开的多聚体结合蛋白包含结合至人fc-y受体的免疫球蛋白fc区或其变体的全部或部分，所述免疫球蛋白fc区的全部或部分包含与seq id no:6或14的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的ch2-ch3结构域。

17、还提供了一种结合蛋白，该结合蛋白包含第一抗原结合结构域(abd)和第二抗原结合结构域、细胞因子部分以及免疫球蛋白fc区或其变体的全部或部分，其中该第一abd具有fab结构并且包含免疫球蛋白重链(vh)和免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)，其中每个vh和vl包含三个互补决定区(cdr1、cdr2、cdr3)；并且其中：

18、(i)所述第一abd特异性结合至人cd20并且包含：

19、-包含对应于seq id no:29(hcdr1)、seq id no:32(hcdr2)、seq id no:35(hcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vh1，以及

20、-包含对应于seq id no:38(lcdr1)、seq id no:41(lcdr2)、seq id no:44(lcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vl1；

21、(ii)所述第二abd特异性结合至人nkp46并且包含：

22、-包含对应于seq id no:47(hcdr1)、seq id no:50(hcdr2)、seq id no:53(hcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vh2，以及

23、-包含对应于seq id no:56(lcdr1)、seq id no:59(lcdr2)、seq id no:62(lcdr3)的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3的vl2；

24、并且其中免疫球蛋白fc区或其变体的全部或部分结合至人fc-γ受体。

25、在一个实施方案中，细胞因子部分是变体il-2。

26、在一个实施方案中，结合蛋白的第一abd和第二abd具有fab结构。在一个实施方案中，结合蛋白的第一abd具有fab结构并且结合蛋白的第二abd具有scfv结构。

27、在一个实施方案中，根据本公开的结合蛋白包含形成如上定义的两种abd的三条多肽链(i)、(ii)和(iii)：

28、v1a-c1a-铰链1-(fc结构域)a                   (i)

29、v1b-c1b-铰链2-(fc结构域)b-l1-v2a-c2a         (ii)

30、v2b-c2b-铰链3-l2-il-2                        (iii)

31、其中：

32、v1a和v1b形成所述第一abd的结合对v1(vh1/vl1)；

33、v2a和v2b形成所述第二abd的结合对v2(vh2/vl2)；

34、c1a和c1b形成对c1(ch1/cl)，并且c2a和c2b形成对c2(ch1/cl)，其中ch1是免疫球蛋白重链恒定结构域1，并且cl是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

35、铰链1、铰链2和铰链3相同或不同，并且对应于免疫球蛋白铰链区的全部或部分；

36、(fc结构域)a和(fc结构域)b相同或不同，并且包含ch2-ch3结构域；

37、l1和l2是氨基酸接头，其中l1和l2能够不同或相同；

38、il-2是结合至nk细胞上存在的cd122的变体人白介素-2多肽或其部分。

39、在另一个实施方案中，根据本公开的结合蛋白包含形成如上定义的两种abd的两条多肽链(i)和(ii)：

40、v1a-c1a-铰链1-(fc结构域)a                         (i)

41、v1b-c1b-铰链2-(fc结构域)b-l1-v2a-l2-v2b-l3-il-2      (ii)

42、其中：

43、v1a和v1b形成所述第一abd的结合对v1(vh1/vl1)；

44、v2a和v2b形成所述第二abd的结合对v2(vh2/vl2)；

45、c1a和c1b形成对c1(ch1/cl)，其中ch1是免疫球蛋白重链恒定结构域1，并且cl是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

46、铰链1和铰链2相同或不同，并且对应于免疫球蛋白铰链区的全部或部分；

47、(fc结构域)a和(fc结构域)b相同或不同，并且包含ch2-ch3结构域；

48、l1、l2和l3是氨基酸接头，其中l1、l2和l3能够不同或相同；

49、il-2是结合至nk细胞上存在的cd122的变体人白介素-2多肽或其部分。

50、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的ch1结构域是包含seq id no:12的氨基酸序列的免疫球蛋白重链恒定结构域1。

51、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的ck结构域是包含seq id no:4的氨基酸序列的免疫球蛋白κ轻链恒定结构域(ck)。

52、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的(fc结构域)a包含对应于seq id no:6的氨基酸序列的ch2-ch3结构域。

53、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的(fc结构域)b包含对应于seq id no:14的氨基酸序列的ch2-ch3结构域。

54、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的铰链1结构域具有seq id no:5的氨基酸序列。

55、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的铰链2结构域具有seq id no:13的氨基酸序列。

56、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的铰链3结构域具有seq id no:19的氨基酸序列。

57、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的接头l1具有seq id no:15的氨基酸序列。

58、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的接头l2具有seq id no:20-23中任一个的氨基酸序列。

59、在一个具体实施方案中，本公开的结合蛋白具有根据kabat编号的fc结构域或其变体的残基n297，其包含n-连接的糖基化。优选地，本公开的结合蛋白的fc结构域或其变体结合至人cd16a(fcγriii)多肽。

60、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含通过至少一个二硫桥连接的至少两条多肽链。优选地，本公开的结合蛋白的多肽链(i)和(ii)通过c1a与铰链2之间的一个二硫桥、铰链1与铰链2之间的两个二硫桥连接，并且其中多肽链(ii)和(iii)通过铰链3与c2b之间的一个二硫桥连接。

61、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的v1a结构域是vl1并且v1b结构域是vh1。

62、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的v2a结构域是vh2并且v2b结构域是vl2。

63、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的c1a结构域是ck并且c1b结构域是ch1。

64、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的c2a结构域是ck并且c2b结构域是ch1。

65、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白的c2a结构域是ch1并且c2b结构域是ck。

66、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

67、(a)vh1和vl1分别对应于seq id no:11和3的氨基酸序列，

68、并且/或者

69、(b)vh2和vl2分别对应于seq id no:93和95的氨基酸序列。

70、在一个实施方案中，与野生型人il-2多肽相比，本公开的结合蛋白的变体il-2显示出与cd25的结合降低。

71、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的结合变体il-2包含与选自seq id no:24-28和65的序列或与其至少40、50、60、70、80或100个氨基酸残基的连续序列至少90％相同的氨基酸序列。

72、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

73、-由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽(i)；

74、-由seq id no:9的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

75、-由seq id no:17的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

76、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

77、-由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽(i)；

78、-由seq id no:73的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

79、-由seq id no:74的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

80、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的fc结构域包含突变的n297残基(根据kabat编号)以防止所述残基被糖基化。优选地，所述突变是n297s取代。在一个优选的实施方案中，这种突变基本上消除了本公开的结合蛋白的cd16a结合。

81、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

82、-由seq id no:66的氨基酸序列组成的多肽(i)；

83、-由seq id no:67的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

84、-由seq id no:17的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

85、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

86、-由seq id no:66的氨基酸序列组成的多肽(i)；

87、-由seq id no:75的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

88、-由seq id no:74的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

89、在另一个实施方案中，本公开的结合蛋白的fc结构域包含根据kabat编号的l234a、l235e、g237a、a330s和/或p331s取代。

90、因此，本公开的一种结合蛋白包含：

91、-由seq id no:68的氨基酸序列组成的多肽(i)；

92、-由seq id no:69的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

93、-由seq id no:17的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

94、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

95、-由seq id no:68的氨基酸序列组成的多肽(i)；

96、-由seq id no:76的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

97、-由seq id no:74的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

98、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白的结合至cd20的第一abd是fab，并且结合至nkp46的第二abd是scfv。

99、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白的第一abd是vh/vl对。

100、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

101、-由seq id no:77的氨基酸序列组成的多肽(i)；

102、-由seq id no:78的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

103、-由seq id no:74的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

104、在一个另选的实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

105、-由seq id no:77的氨基酸序列组成的多肽(i)；

106、-由seq id no:79的氨基酸序列组成的多肽(ii)；以及

107、-由seq id no:17的氨基酸序列组成的多肽(iii)。

108、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的第二abd以及细胞因子部分具有以下排列：

109、-l1-v2a-l2-v2b-l3-il-2，

110、其中v2a和v2b形成所述第二abd的结合对v2(vh2/vl2)；

111、l1、l2和l3是氨基酸接头，其中l1、l2和l3能够不同或相同；

112、il-2是结合至nk细胞上存在的cd122的变体人白介素-2多肽或其部分。

113、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的v2a结构域是vh2并且v2b结构域是vl2。

114、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

115、-由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽(i)；以及

116、-由seq id no:70的氨基酸序列组成的多肽(ii)。

117、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白的fc结构域包含突变的n297残基(根据kabat编号)以防止所述残基被糖基化。优选地，所述突变是n297s取代。在一个优选的实施方案中，这种突变基本上消除了本公开的结合蛋白的cd16a结合。

118、在一个实施方案中，本公开的结合蛋白包含：

119、-由seq id no:66的氨基酸序列组成的多肽(i)；

120、-由seq id no:71的氨基酸序列组成的多肽(ii)。

121、在另一个实施方案中，本公开的结合蛋白的fc结构域包含根据kabat编号的l234a、l235e、g237a、a330s和/或p331s取代。

122、因此，本公开的一种结合蛋白包含：

123、-由seq id no:68的氨基酸序列组成的多肽(i)；

124、-由seq id no:72的氨基酸序列组成的多肽(ii)。

125、提供了一种包含本公开的结合蛋白以及药学上可接受的载剂的药物组合物。

126、还提供了一种分离的核酸序列，其包含编码本公开的结合蛋白或其多肽链的核苷酸序列。

127、提供了一种包含本公开的核酸的表达载体，所述核酸序列包含编码本公开的结合蛋白或其多肽链的核苷酸序列。

128、提供了一种包含本公开的核酸的分离的细胞，所述核酸序列包含编码本公开的结合蛋白或其多肽链的核苷酸序列。

129、提供了一种包含本公开的表达载体的分离的细胞，所述表达载体包含本公开的核酸，所述核酸序列包含编码本公开的结合蛋白或其多肽链的核苷酸序列。

130、提供了一种作为药物使用的本公开的结合蛋白。

131、还提供了一种本公开的结合蛋白，该结合蛋白在治疗涉及或特征在于表达cd20的细胞的疾病中使用；并且还提供了一种治疗受试者的涉及或特征在于表达cd20的细胞为的疾病的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的结合蛋白。

132、在一个实施方案中，通过使用本公开的结合蛋白或本公开的治疗方法治疗的疾病是血液癌症，例如特征在于表达cd20的恶性细胞的血液癌症。

133、在另一个实施方案中，通过使用本公开的结合蛋白或本公开的治疗方法治疗的疾病选自由以下组成的组：b细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤、前体b细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤和成熟b细胞肿瘤，诸如b细胞慢性淋巴细胞白血病(cll)/小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘带b细胞淋巴瘤(malt型、结节型和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病症、华氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤(alcl)。

134、在另一个实施方案中，通过使用本公开的结合蛋白或本公开的治疗方法治疗的疾病(例如nhl、cll、sll)的特征在于在其表面表达低水平cd20的细胞(例如癌细胞)，或低数量的表达cd20的细胞。

135、在一个实施方案中，多特异性蛋白质每月施用1至4次，任选地每2周一次，任选地每3周一次，任选地每4周一次，任选地进一步地，其中治疗持续至少3个月、6个月或12个月的时间。

136、提供了一种用于制备本公开的结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

137、(a)在适于表达多种重组多肽的条件下培养宿主细胞，所述多种重组多肽包含(i)包含seq id no:1、66、68、77、91或92的氨基酸序列的多肽，以及(ii)包含seq id no:9、67、69、70、71、72、73、75、76、78或79的氨基酸序列的多肽，以及任选地(iii)包含seq id no:17或74的氨基酸序列的多肽；

138、(b)任选地回收所表达的重组多肽。

139、在一个实施方案中，用于制备本公开的结合蛋白的方法包括以下步骤：

140、(a)在适于表达多种重组多肽的条件下培养宿主细胞，所述多种重组多肽包含(i)包含seq id no:1的氨基酸的多肽，以及(ii)包含seq id no:70的氨基酸序列的多肽；

141、(b)任选地回收所表达的重组多肽。

142、本发明的这些和另外的有利方面和特征可在本文的其他地方进一步描述。