能够增强蛋白质表达的多核苷酸及其用途的制作方法

本pct申请要求2021年4月15日提交的美国临时申请第63/175,459号的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。对经由efs-web以电子方式提交的序列表的引用在本技术中提交的以电子方式提交的序列表(名称：4366_028pc01_seqlisting_st25.txt，大小：124,555字节；并且创建日期：2022年4月15日)的内容以引用的方式整体并入本文。本公开提供了能够诱导所编码蛋白质的增强表达的经修饰的多核苷酸，以及此类多核苷酸用于治疗各种疾病和病症的用途。

背景技术：

1、疫苗对世界卫生产生了深远的影响。例如，天花已经根除，并且小儿麻痹症也接近消除。尽管如此，正如最近的冠状病毒大流行所证明的那样，仍有许多人类病原体尚未被成功遏制。此外，常规疫苗接种策略通常涉及施用“活”(减毒)或“死”疫苗。此类疫苗通常具有不期望的副作用和风险(例如，减毒活疫苗可回复为致病性生物体)或具有有限的功效。

2、最近，人们对使用多核苷酸作为疫苗平台(例如，dna和mrna疫苗)产生了很大兴趣。与常规疫苗相比，基于多核苷酸的疫苗通常更安全，更容易制造，并且能够诱导更广泛的免疫反应。然而，通一般而言，此类疫苗具有有限的功效，特别是在人中。参见hobernik等人,int j mol sci 19(11):3605(2018年11月)。因此，迄今为止，仍然没有dna疫苗被批准用于人类使用。此外，只是由于最近的大流行，三种冠状病毒特异性mrna疫苗才获得批准。因此，仍然需要用于人类使用的具有更大效力的新的基于多核苷酸的疫苗。

技术实现思路

1、本文提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含开放阅读框(orf)和(i)流感血凝素(ha)蛋白的5'-非翻译区元件(5'-utr)、(ii)流感血凝素(ha)蛋白的3'-非翻译区元件(3'-utr)、或(i)和(ii)两者；其中所述orf编码与所述5'-utr、所述3'-utr或所述5'-utr和所述3'-utr两者异源的蛋白质。在一些方面中，分离的多核苷酸包含5'-utr和3'-utr两者。

2、在一些方面中，5'-utr包含seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaagcaacaaaa)中所示的核酸序列。在一些方面中，5'-utr由seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataaaa gcaacaaaa)中所示的核酸序列组成。在一些方面中，3'-utr包含seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaaaaacacc cttgtttctact)中所示的核酸序列。在一些方面中，3'-utr由seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaaaaacacccttgtttctact)中所示的核酸序列组成。

3、在一些方面中，与用不包含5'-utr和3'-utr两者的参考多核苷酸转染的细胞中的相应表达相比，当在细胞中转染时，5'-utr、3'-utr或5'-utr和3'-utr两者能够增加由orf编码的异源蛋白质的表达。

4、在一些方面中，本公开的分离的多核苷酸还包含5'-帽、poly(a)尾、至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微小rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'加尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节因子或它们的组合。

5、在一些方面中，5’-帽包括m2 7,2′-ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m2(7,3′-o)gpppg、m2(7,2′-o)gppspg(d1)、m2(7,2′-o)gppspg(d2)、m27,3’-ogppp(m12’-o)apg、(m7g-3′mppp-g；其可等效地指定为3′o-me-m7g(5′)ppp(5′)g)、n7,2′-o-二甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-g(5′)ppp(5′)g、n7-(4-氯苯氧基乙基)-m3′-og(5′)ppp(5′)g、7mg(5′)ppp(5′)n,pn2p、7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp、7mg(5′)-ppp(5′)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2′)apm(2′)apm(2′)cpm(2)(3,2′)up、肌苷、n1-甲基-鸟苷、2′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg或它们的组合。在一些方面中，连接的核苷的3'加尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。

6、在一些方面中，本公开的分离的多核苷酸包含至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸。在某些方面中，至少一个经修饰的或非天然存在的核苷酸包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并-胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘代-胞苷或它们的组合。

7、在一些方面中，由本文所述的分离的多核苷酸的orf编码的异源蛋白质包含冠状病毒蛋白。在一些方面中，冠状病毒蛋白包括sars-cov-2刺突蛋白。

8、在一些方面中，由本文所述的分离的多核苷酸的orf编码的异源蛋白质包含流感蛋白。在某些方面中，流感蛋白包括ha蛋白、神经氨酸酶(na)蛋白、核蛋白(np)、基质1(m1)蛋白、基质2(m2)蛋白、非结构蛋白1(ns1)、非结构蛋白2(ns2)、聚合酶酸性(pa)蛋白、聚合酶碱性1(pb1)蛋白、pb1-f2蛋白、聚合酶碱性2(pb2)蛋白或它们的任何组合。

9、在一些方面中，由orf编码的异源蛋白质包含肿瘤抗原。在一些方面中，肿瘤抗原包括甲胎蛋白(afp)、b细胞成熟抗原(bcma)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(mage；例如，magea3)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、前列腺特异性膜抗原(psma)、tag-72、人表皮生长因子受体2(her2)、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、癌症-睾丸抗原(例如，纽约食管鳞状细胞癌1(ny-eso-1)、mart-1gp100、ror1、ror2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、tnf相关细胞凋亡诱导配体或它们的组合。

10、在一些方面中，由本文所述的分离的多核苷酸的orf编码的异源蛋白质包含与遗传病症相关的蛋白质。在某些方面中，遗传病症包括亨特综合征。

11、本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸从5'至3'包含：(a)流感血凝素(ha)蛋白的5'-非翻译区元件(5'-utr)，所述5'-utr包含seq id no:13(agcaaaagcaggggaaaataa aagcaacaaaa)中所示的核酸序列；(b)开放阅读框(orf)；以及(c)流感血凝素(ha)蛋白的3'-非翻译区元件(3'-utr)，所述3'-utr包含seq id no:14(cattaggatttcagaagcatgagaaaaa cacccttgtttctact)中所示的核酸序列；其中所述orf编码与所述5'-utr和所述3'-utr两者异源的蛋白质。

12、本公开还提供了一种载体，所述载体包含本文所述的分离的多核苷酸中的任一者。本文还提供了一种细胞，所述细胞包含本文所述的分离的多核苷酸或载体中的任一者。

13、本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本文所述的分离的多核苷酸、载体或细胞中的任一者；和(ii)药学上可接受的赋形剂。本文还提供了一种药盒，所述药盒包括(i)本文所述的分离的多核苷酸、载体或细胞中的任一者；和(ii)使用说明书。

14、本文还提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的分离的多核苷酸中的任一者。在一些方面中，可治疗的疾病或病症包括病毒感染、癌症、遗传病症或它们的组合。在一些方面中，病毒感染包括冠状病毒感染、流感病毒感染或两者。在一些方面中，癌症包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(胃)癌、胃肠癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。在某些方面中，遗传病症包括亨特综合征。

15、本文还提供了一种增加蛋白质的表达的方法，所述方法包括使细胞与本公开的分离的多核苷酸中的任一者接触。在一些方面中，接触在体内发生。在一些方面中，接触离体发生。在一些方面中，与在与不包含5'-utr和3'-utr两者的参考多核苷酸接触的细胞中蛋白质的表达相比，蛋白质的表达增加至少约0.5倍、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍或约50倍。

16、在一些方面中，本文提供的分离的多核苷酸例如在递送剂中递送至受试者。在某些方面中，递送剂包括胶束、外泌体、类脂质、脂质体、脂质复合物、脂质纳米颗粒、细胞外囊泡、合成囊泡、聚合化合物、肽、蛋白质、细胞、纳米颗粒模拟物、纳米管、缀合物、病毒载体或它们的组合。

17、在一些方面中，递送剂包含阳离子载体单元，所述阳离子载体单元包含：

18、[wp]-l1-[cc]-l2-[am](式i)

19、或

20、[wp]-l1-[am]-l2-[cc](式ii)，

21、其中

22、wp是水溶性生物聚合物部分；

23、cc是阳离子载体部分；

24、am是佐剂部分；并且，

25、l1和l2独立地为任选的接头。

26、在一些方面中，当混合在一起时，阳离子载体单元和分离的多核苷酸能够彼此缔合以形成胶束。在一些方面中，缔合是通过共价键。在一些方面中，缔合是通过非共价键。在一些方面中，非共价键包括离子键。

27、在一些方面中，阳离子载体单元的水溶性聚合物包括聚(亚烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟基烷基酯)、聚(糖类)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(“poz”)、聚(n-丙烯酰基吗啉)或它们的任何组合。在一些方面中，水溶性聚合物包括聚乙二醇(“peg”)、聚甘油或聚(丙二醇)(“ppg”)。

28、在一些方面中，水溶性聚合物包含：

29、

30、其中n是1-1000。

31、在一些方面中，n是至少约110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140或至少约141。在某些方面中，n是约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约140至约150或约150至约160。在一些方面中，n是约114。

32、在一些方面中，阳离子载体单元的水溶性聚合物为线性、分支或树枝状的。

33、在一些方面中，阳离子载体部分包含一个或多个碱性氨基酸。在一些方面中，阳离子载体部分包含至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约六个、至少约七个、至少约八个、至少约九个、至少约十个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个或至少约50个碱性氨基酸。在一些方面中，阳离子载体部分包含约60、约70、约80、约90或约100个碱性氨基酸。在一些方面中，阳离子载体部分包含约80个碱性氨基酸。

34、在一些方面中，碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些方面中，阳离子载体部分包含约80个赖氨酸单体。

35、在一些方面中，阳离子载体单元的佐剂部分能够调节免疫反应、炎症反应和/或组织微环境。在一些方面中，佐剂部分包含咪唑衍生物、氨基酸、维生素或它们的任何组合。在一些方面中，佐剂部分包含：

36、

37、其中g1和g2各自是h、芳族环或1-10烷基，或者g1和g2一起形成芳族环，并且其中n是1-10。

38、在一些方面中，佐剂部分包含硝基咪唑。在一些方面中，佐剂部分包含甲硝唑、替硝唑、尼莫唑、地美硝唑、普瑞玛尼、奥硝唑、美格唑、阿扎硝唑、苄硝唑或它们的任何组合。

39、在一些方面中，佐剂部分包含氨基酸。在一些方面中，佐剂部分包含

40、

41、其中ar是并且

42、其中z1和z2各自是h或oh。

43、在一些方面中，佐剂部分包含维生素。在一些方面中，维生素包含环状环或环状杂原子环和羧基或羟基。在一些方面中，维生素包含：

44、

45、其中y1和y2各自是c、n、o或s，并且其中n是1或2。

46、在一些方面中，维生素选自由以下组成的组：维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b6、维生素b7、维生素b9、维生素b12、维生素c、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素m、维生素h以及它们的任何组合。

47、在一些方面中，维生素是维生素b3。在一些方面中，佐剂部分包含至少约两个、至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约六个、至少约七个、至少约八个、至少约九个、至少约十个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个或至少约50个维生素b3。在一些方面中，佐剂部分包含约35个维生素b3。

48、在一些方面中，递送剂包含具有约120至约130个peg单元的水溶性生物聚合物部分、包含具有约80个赖氨酸的聚赖氨酸的阳离子载体部分和具有约35个维生素b3的佐剂部分。

49、在一些方面中，递送剂包含阳离子载体单元，所述阳离子载体单元包含：

50、[cc]-l1-[cm]-l2-[hm](图式i)；

51、[cc]-l1-[hm]-l2-[cm](图式ii)；

52、[hm]-l1-[cm]-l2-[cc](图式iii)；

53、[hm]-l1-[cc]-l2-[cm](图式iv)；

54、[cm]-l1-[cc]-l2-[hm](图式v)；或

55、[cm]-l1-[hm]-l2-[cc](图式vi)；

56、其中

57、cc是带正电荷的载体部分；

58、cm是交联部分；

59、hm是疏水性部分；并且，

60、l1和l2独立地为任选的接头，并且

61、其中hm的数目相对于[cc]和[cm]少于40％。

62、在一些方面中，hm的数目相对于[cc]和[cm]少于39％、少于约35％、少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或约1％。在一些方面中，阳离子载体单元能够与本文所述的分离的多核苷酸中的任一者相互作用。

63、在一些方面中，阳离子载体部分包含至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约六个、至少约七个、至少约八个、至少约九个、至少约十个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个、至少约50个、至少约51个、至少约52个、至少约53个、至少约54个、至少约55个、至少约56个、至少约57个、至少约58个、至少约59个、至少约60个、至少约61个、至少约62个、至少约63个、至少约64个、至少约65个、至少约66个、至少约67个、至少约68个、至少约69个、至少约70个、至少约71个、至少约72个、至少约73个、至少约74个、至少约75个、至少约76个、至少约77个、至少约78个、至少约79个或至少约80个氨基酸。在一些方面中，阳离子载体部分包含80个氨基酸。

64、在一些方面中，氨基酸包括赖氨酸。

65、在一些方面中，疏水性部分包含至少约两个、至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约六个、至少约七个、至少约八个、至少约九个、至少约十个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个或至少约32个氨基酸，所述氨基酸各自连接至维生素。在一些方面中，疏水性部分包含约两个维生素b3、约三个维生素b3、约四个维生素b3、约五个维生素b3、约六个维生素b3、约七个维生素b3、约八个维生素b3、约九个维生素b3、约十个维生素b3、约11个维生素b3、约12个维生素b3、约13个维生素b3、约14个维生素b3、约15个维生素b3、约16个维生素b3、约17个维生素b3、约18个维生素b3、约19个维生素b3、约20个维生素b3、约21个维生素b3、约22个维生素b3、约23个维生素b3、约24个维生素b3、约25个维生素b3、约26个维生素b3、约27个维生素b3、约28个维生素b3、约29个维生素b3、约维生素b3、约31个维生素b3、约32个维生素b3、约33个维生素b3、约34个维生素b3或约35个维生素b3。

66、在一些方面中，本文所述的递送剂的阳离子载体部分包含约35至约45个赖氨酸，交联部分包含约5至约40个赖氨酸-硫醇，并且疏水性部分包含约1至约50个赖氨酸-维生素b3。在某些方面中，阳离子载体部分包含约40个赖氨酸，交联部分包含约5个赖氨酸-硫醇，并且疏水性部分包含约35个赖氨酸-维生素b3。在一些方面中，水溶性生物聚合物部分包含约114个peg单元。

67、在一些方面中，本文所述的分离的多核苷酸中的任一者例如经肠胃外、肌内、皮下、眼部、静脉内、腹膜内、皮内、眶内、鼻内、脑内、颅内、脑室内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、肿瘤内、局部或它们的任何组合施用于受试者。