使用天然或植物油制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法与流程

本发明总体上涉及通过使用天然或植物油将混合物乳化来制造适于用作色谱树脂(chromatographic resin)的琼脂或琼脂糖珠粒的方法。

背景技术：

1、用于分离目的的琼脂糖珠粒已经市售了五十年。通常，将热的琼脂糖溶液在与热水不混溶的溶剂中乳化以形成油包水(w/o)乳液，然后将乳液冷却至低于琼脂糖的胶凝温度从而形成珠粒，由此获得琼脂糖珠粒。然后在后续的分离步骤中收集这些珠粒。例如在porath j等人,journal of chromatography,vol.60,1971年1月1日、us2018071484和wo1989011493中已经描述了这种方法。

2、用作色谱树脂的琼脂糖珠粒的一个重要参数是它们的孔隙率。在生产过程中通过不同的参数控制孔隙率，然而，乳化溶液的冷却是最关键的一项。为了在珠粒中获得所需的孔隙率范围，在乳化混合物的冷却过程中控制冷却和温度梯度是必要的。

3、传统上，用作乳液连续相的与水不混溶的溶剂通常选自有机溶剂，例如甲苯。甲苯由于其低粘度提供了对冷却的良好控制，因此当生产具有受控孔隙率和尺寸的珠粒时是有利的。这种方法例如公开在wo2020221762中。然而，近年来日益增长的环境问题已经驱使工业开发避免使用有机溶剂的生产方法，并且用天然或植物替代物部分或完全替代这些方法。此外，诸如甲苯等有机溶剂的使用还引起其它问题，如爆炸的危险以及对工作健康和安全的关注。

4、琼脂由琼脂糖和琼脂胶组成，琼脂糖与琼脂胶的比例通常为90:10至70:30。琼脂糖和琼脂胶都是具有交替的脱水半乳糖和半乳糖亚基的多糖，即它们的多糖骨架是相同的。琼脂胶被显著硫酸化，因此带负电荷。此外，其也是甲基化的，意味着其含有甲氧基。琼脂糖本质上是不带电荷的并且没有硫酸根基团。琼脂，特别是脱硫酸化琼脂和琼脂糖最初都被建议作为制备交联分离凝胶的原料。参见例如us 3959251(porath等人)。然而，在这些年来，人们更多地聚焦于琼脂糖而非琼脂，这很可能是由于琼脂的硫酸根基团含量高(存在于琼脂胶中)以及在不负面影响琼脂基材质量的情况下除去硫酸根基团的问题。

5、先前已经表明，当用植物油生产琼脂糖珠粒时，可以替代在油包水乳液中作为连续相的有机溶剂，如在nicolas ionnidis等人,journal of colloid and interfacescience 367(2012)和chen等人,journal of separation science,vol 40,22/17中。然而，这些结果都是以实验室规模产生的，因此体积非常小。

6、由于植物油的粘度显著高于有机溶剂，因此更难以控制包含植物油作为连续相的乳液的冷却。当以较小的规模乳化时，由于处理的体积较小，故问题不大，因此反应器的夹套冷却是冷却包含高粘性连续相的乳液的适当选择。然而，这不是工业规模生产中的选择，因为夹套冷却与较高粘度的植物油结合将导致缓慢和不受控制的冷却，从而导致珠粒具有受损的形状、尺寸和孔隙率性质。缓慢冷却导致相对高的孔隙率。快速冷却导致更小的孔。

7、通过在工业上可行的过程中不使用诸如甲苯等有机溶剂的方法生产琼脂或琼脂糖珠粒将是有利的。此外，生产具有受控尺寸和/或孔隙率分布的琼脂或琼脂糖珠粒将是有利的。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是通过提供生产琼脂或琼脂糖珠粒的改进方法来减少或消除一个或多个上述缺点。

2、本发明的另一个目的是提供使用包含天然或植物油作为连续相(油相)的油包水(w/o)乳液制备琼脂或琼脂糖珠粒的方法。因此，实现了消除或减少低粘度有机溶剂的使用的方法。

3、本发明的另一个目的是提供制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法，其包括适于在工业规模生产中使用的冷却步骤。

4、本发明的另一个目的是提供制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法，其中所述方法产生具有受控大小分布和形状的琼脂或琼脂糖珠粒。

5、本发明的另一个目的是提供制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法，其中所述方法产生具有受控孔隙率的琼脂或琼脂糖珠粒。

6、本发明的另一个目的是提供制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法，其中所述方法减少或消除珠粒中的油内含物。

7、本发明的另一个目的是提供适合用作色谱树脂的琼脂或琼脂糖珠粒。

8、在本发明的一个一般实施方式中，提供了用于制造琼脂或琼脂糖珠粒的方法，所述方法包括以下步骤：

9、i)在高于琼脂或琼脂糖的水溶液的胶凝温度的温度下提供包含所述水溶液的水相；

10、ii)在高于步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度的温度下提供包含天然或植物油的油相；

11、iii)将步骤i)中提供的水相与步骤ii)中提供的油相在反应器中合并，并加入乳化剂；

12、iv)将步骤iii)中获得的混合物乳化，优选通过搅拌混合物来进行，从而产生乳液；

13、v)进行逐步冷却，其包括将步骤iv)中获得的乳液冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度高0.1-30℃的温度的第一冷却步骤，随后是将乳液从反应器中排空并使乳液通过热交换器的第二冷却步骤，由此使得将所述乳液冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度低的温度；和

14、vi)从所述乳液中回收琼脂或琼脂糖珠粒。

15、通过本发明的方法，实现了更受控的粒度分布和孔隙率。不受理论的束缚，据信通过使乳液经历逐步冷却，由此首先使乳液达到接近但仍高于琼脂或琼脂糖水溶液的胶凝温度的温度，导致冷却开始和胶凝点(即“粘性”珠粒转变成胶凝(即固体)珠粒的温度)之间的粘度差减小。在珠粒仍处于其粘性形式的起始温度和低于胶凝温度的温度(即珠粒将处于其胶凝(即固化)形式)之间的这种降低的温度和粘度差异使得更容易控制温度梯度。这继而使得更好地控制受温度影响的参数，例如尺寸分布和孔隙率，其受冷却速率的高度影响。当具有包含展现出较高粘度的连续相的乳液时，控制冷却是至关重要的，因此与常规有机溶剂相比，在冷却过程中更具有挑战性的温度控制。

16、通过使乳液经过热交换器进行最终冷却，实现了具有受控温度梯度的快速冷却。这使得可以控制胶凝的温度分布并因此控制所得珠粒的尺寸分布和孔隙率。此外，通过实现快速和受控的冷却，即使在油包水(w/o)乳液中使用高粘性连续相，也可以在工业规模生产中使用该方法。

17、包含琼脂或琼脂糖的水溶液的水相可以是天然琼脂、天然琼脂糖或者琼脂或琼脂糖的衍生物，如例如wo2008136742和us6602990中所述，其全部内容通过引用并入本文。

18、琼脂或琼脂糖溶液的胶凝温度通常高于40℃。然而，根据溶液中存在的琼脂的量和纯度，该值发生较小的变化。然而，预期技术人员了解这些并理解存在这样的变化。在本发明的一个实施方式中，在高于40℃的温度下，优选在40-99℃，优选40.1-99.9℃，甚至更优选41-95℃的温度下提供包含琼脂或琼脂糖水溶液的水相。

19、在本发明的一个实施方式中，油相在高于40℃的温度下提供，优选在40-99℃的温度下提供，优选在40.1-99.9℃的温度下提供，甚至更优选在41℃-95℃的温度下提供。

20、在一个实施方式中，在水相和油相已经合并之后将乳化剂加入到合并的溶液中。优选地，在将水相加入油相之后加入乳化剂。

21、在一个实施方式中，将混合物乳化的步骤iv)可以通过技术人员已知的任何常规乳化方法进行。

22、用于冷却步骤iv)中获得的乳液的第一冷却步骤将乳液冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度高0.1-30℃的温度。在一个实施方式中，第一冷却步骤将乳液冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度高0.5-15℃的温度，优选冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度高0.5-10℃的温度，甚至更优选冷却至比步骤i)中提供的水溶液的胶凝温度高0.5-5℃的温度。在一个实施方式中，第一冷却步骤将乳液冷却至40.5-49℃的温度，优选冷却至41-45℃的温度。

23、通过根据本发明以逐步方式冷却，可以利用与有机溶剂相比更粘稠的油相，因为冷却将以快速、受控和方便的方式进行。

24、可以通过技术人员已知的任何常规方法从形成的乳液中回收琼脂或琼脂糖珠粒。在一个实施方式中，在过量水和任选的表面活性剂的存在下使珠粒沉降以将珠粒与水相分离，从而回收珠粒。

25、在本发明的一个实施方式中，步骤iii)通过在反应器中将来自步骤i)的水溶液加入步骤ii)中提供的油相中来进行，优选通过将来自步骤i)的水溶液倒入含有来自步骤ii)的油相的反应器中来进行。本发明人惊奇地发现，添加方法高度影响乳液中珠粒的形成。传统上，当使用低粘度溶剂如甲苯进行乳化时，将甲苯加入到水相中。然而，如果该添加方法用于更粘稠的油如植物油，则随后形成的珠粒将显示出损害质量的油内含物。发明人通过改为将水相加入油相中而解决了该问题。优选地，将水相加入油相中是以受控的方式进行的，例如通过倾倒或滴落，以便确保更均匀的分布并且避免絮凝。此外，当加入油相中时，水相的温度已显示出影响珠粒的最终性质。优选地，在高于70℃，优选高于80℃，优选高于90℃，甚至更优选高于95℃的温度下加入水相。

26、在本发明的一个实施方式中，步骤iii)和步骤iv)同时进行。在本发明的一个实施方式中，步骤iv)在已经将水相加入到油相中之后开始。

27、在本发明的一个实施方式中，所述第一冷却步骤通过将反应器中的乳液冷却至比40℃高0.1-20℃的温度，优选冷却至比40℃高1-10℃的温度，甚至更优选冷却至比40℃高1-5℃的温度来进行。如前文所述，将乳液冷却至接近琼脂或琼脂糖溶液的水溶液(即水相)的胶凝温度的温度，降低了冷却开始和珠粒的胶凝温度之间的粘度差距。这继而产生更受控的温度梯度和受控的参数，例如珠粒的孔隙率和尺寸分布。

28、在本发明的一个实施方式中，所述第二冷却步骤使得将乳液冷却至低于30℃，优选低于25℃的温度。通过冷却至低于琼脂或琼脂糖溶液的水溶液(即水相)的胶凝温度的温度，获得珠粒。

29、天然油可以是从含油植物的不同部分获得的油，例如来自种子、果实、叶、花、茎、树皮或根的油。在本发明的一个实施方式中，植物油选自菜籽油、玉米油、葵花油、花生油或其它植物基油。优选地，植物油是菜籽油。已表明菜籽油展现出最佳的粘度特性以确保乳液的受控冷却。

30、在本发明的一个实施方式中，步骤iv)中的搅拌通过顶置式混合器进行，其优选以1000-2000rpm进行，甚至更优选以1250-1750rpm进行。传统上，当制造琼脂或琼脂糖珠粒时，使用高剪切混合器。然而，当使用具有比常规有机水不混溶性溶剂更高粘度的油时，高剪切混合导致油包含在珠粒中。不受理论束缚，据信与在低粘度油相中的相同方法相比，当混合时，增加的粘度导致对珠粒增加的机械冲击。然而，已经表明，通过使用高速的常规混合器，高粘度油相允许珠粒的良好颗粒分布。混合器的速度(每分钟转数或rpm)已显示对珠粒尺寸分布具有影响。增加的速度导致更强的剪切作用和降低的珠粒dv50值。dv50表示50％重量的产物低于特定的微米尺寸。高速也可能导致连续相(油相)被迫在形成的乳液球内，从而导致在所述乳液内的乳液，这将损害所得珠粒的性质。太低的速度将不会产生乳液。

31、在本发明的一个实施方式中，第二冷却步骤包括使乳液通过一系列热交换器。通过使用一系列热交换器，可以提供不同的冷却设置，从而不同地控制冷却梯度。

32、在本发明的一个实施方式中，第二冷却步骤包括使乳液通过100-700kw热交换器，优选通过600-700kw热交换器。优选地，通过热交换器的水温为5-20℃，甚至更优选为7-15℃。

33、在本发明的一个实施方式中，水相和油相之间的体积比为1:9-1:1，优选1:4-1:1，优选2:5-5:8。相对于油相的体积，高体积的水相导致更高的dv50值。

34、在本发明的一个实施方式中，乳化剂是非离子表面活性剂，优选地，乳化剂是脱水山梨糖醇酯。在一个实施方式中，乳化剂选自span家族，优选地，乳化剂选自spantm80、spantm85或其混合物。乳化剂的类型影响珠粒尺寸以及珠粒的几何形状。不良选择的乳化剂可能导致珠粒絮凝和油内含物。乳化剂降低油相和水相之间的界面张力，以便于分成更小的液滴并使它们稳定。相互作用差通常导致畸形。为了在使用高粘度油相时获得球形琼脂或琼脂糖珠粒，选自脱水山梨糖醇酯(即span)的乳化剂已显示出产生最少量的变形珠粒并保持良好的尺寸分布。

35、乳化剂的特征在于其hlb值。hlb值是乳化剂增溶性能的指标，并表示乳化剂最适合的乳液类型(o/w或w/o)。在油包水(w/o)乳液中，低hlb是优选的，因为其意味着在连续相(油相)中较高的溶解度，与具有较高hlb值的乳化剂相比，这有助于使较大比例的珠粒在受控尺寸范围内。

36、在本发明的一个实施方式中，步骤iii)中获得的混合物包含的乳化剂的量为10-20g/l油相，优选12.5-17.5g/l油相。

37、在本发明的一个实施方式中，步骤iv)在60-95℃下进行。

38、在本发明的一个实施方式中，琼脂或琼脂糖的水溶液包含1-9重量％的琼脂或琼脂糖，优选3-8重量％的琼脂或琼脂糖，甚至更优选约7重量％的琼脂或琼脂糖。水溶液的琼脂或琼脂糖含量决定了乳液中水相的粘度。粘度对于确定相混合的好坏以及由此获得的乳液中珠粒的尺寸是至关重要的。增加的琼脂含量通常有助于具有较低孔隙率值的较大的致密珠粒。此外，高琼脂含量似乎减少了油内含物的量。较低的琼脂含量需要较少的能量输入来剪切并因此乳化混合物。

39、在本发明的一个实施方式中，水相和油相之间的体积比为2:8。

40、在本发明的一个实施方式中，水相还可包含至少一种盐。所述盐提高胶凝温度，同时降低粘度。在本发明的一个实施方式中，水相还可包含酸。较低的ph降低水相的粘度并影响凝胶强度。在本发明的一个实施方式中，油相还包含抑泡剂。

41、在本发明的第二个一般实施方式中，提供了通过根据前述实施方式中任一项的方法获得的琼脂或琼脂糖珠粒。所述珠粒展现出以kd甲状腺球蛋白测量的0.20-0.35的孔隙率，并且另外超过50％的珠粒展现出30-75μm的尺寸。

42、在本发明的一个实施方式中，超过55％的珠粒展现出30-75μm的尺寸。

43、在凝胶过滤中，特定化合物在内部和外部流动相之间的分布是其分子大小的函数，其由分布系数(kd)表示。通常从凝胶珠粒中排除较大分子，这种分子的kd值将为0。小于凝胶珠粒孔径的某些分子进入凝胶基质的孔中，因此它们的kd值为1。对于中等大小的分子，它们的kd值在0-1之间。kd值的这种类型的变化使得可以在较窄的分子大小范围内分离分子。