减少双链RNA副产物形成的方法与流程

发明领域本发明涉及核酸生产，特别是体外rna转录的领域。更具体地说，本发明涉及在体外转录期间减少双链rna形成，更特别地通过在rna转录过程期间使用特定量的mg来减少双链rna形成的方法。本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的体外转录的rna组合物。发明背景体外转录(ivt)的一个突出用途是产生用于生物制药和治疗应用的mrna。该方法的简单性，即在体外合成类似于内源性mrna并编码目的蛋白的mrna，然后在体外或体内递送和表达其，使得该方法具有吸引力和广泛的适用性。用于(大规模)合成ivt rna的技术是稳健的和成熟的。一个重要的缺点是体外合成过程中存在或产生引发细胞免疫应答的某些副产物，包括双链rna(dsrna)。将ivt rna用作治疗剂的应用需要大量具有低免疫原性的功能性rna。因此，当合成用于寻求最小化细胞免疫应答的体内应用的mrna时，从mrna制品中消除这些dsrna污染物或减少dsrna形成是至关重要的。已经描述了几种依赖于在ivt反应完成后除去副产物的方法，其中分析纯化诸如基于色谱的纯化方法是最主要的方法。尽管这种方法是高效的，但其导致了mrna合成工作流程中的额外步骤，涉及专门的仪器，通常与反应的加大规模不兼容，可能降低rna产率并妨碍该方法的成本效益。合成后纯化的另一种方法是通过改变ivt反应条件来防止ivt反应中dsrna副产物的形成。已经建议降低ivt反应中的镁水平来减少一些特定模板的dsrna副产物(由反义rna的合成形成)的形成(mu等人2018)；然而，降低反应中的镁浓度也会影响rna的总产率，这对于需要大量mrna的应用来说是不希望的。此外，mu等人，2018使用的dsrna检测方法(即天然凝胶电泳)偏向于dsrna的大片段，而使用该方法可能仍未检测到短的dsrna片段。因此，mu等人，2018的结果不允许得出关于反应中的dsrna总量的任何结论。本发明的发明人意外地发现，与mu等人2018相反，可通过在反应中升高镁浓度来在体外转录(ivt)期间减少dsrna副产物的形成。具体而言，本发明描述了与约19mm镁的常规浓度相比，在至少约35mm镁存在的情况下在体外转录期间减少双链rna(dsrna)形成的方法。这种产生ivt rna的方法的主要优点是总dsrna减少50-70％，同时所产生的rna的产率和完整性没有受损。另外，所描述的方法与不同种类的mrna的制备方法兼容，所述不同种类的mrna包括未加帽的rna、cap-0和cap-1加帽的rna、核苷被修饰的rna(例如n1-甲基假尿苷修饰的)、有和无polya尾的rna。最适于去除/防止dsrna污染物的方法将取决于最终应用和所需的rna产率规模。对于放大规模是先决条件的应用，合成后纯化步骤会妨碍最终结果。因此，本发明提供了在合成过程期间防止或至少减少dsrna副产物形成的解决方案。

背景技术：

技术实现思路

1、在第一方面，本发明提供了在体外转录(ivt)反应期间减少双链rna(dsrna)形成的方法，其包括在至少约35mm镁存在的情况下进行所述ivt反应。

2、在另外的实施方案中，在焦磷酸酶存在的情况下进行所述ivt反应。

3、在另一个实施方案中，通过添加金属螯合剂诸如edta来终止所述ivt转录反应。

4、在本发明的具体实施方案中，镁的浓度约为35mm以及介于35mm与约150mm之间，优选约为40mm以及介于40mm与约100mm之间，更优选约为45mm以及介于45mm与约75mm之间，最优选约为55mm。

5、在本发明方法的另一个具体实施方案中，焦磷酸酶的浓度约为0.01u/ml以及介于0.01u/ml与约40u/ml之间，优选约为0.1u/ml以及介于0.1u/ml与约20u/ml之间，更优选约为1u/ml以及介于1u/ml与约10u/ml之间，最优选约为5u/ml。

6、在另一个具体实施方案中，所述金属螯合剂的浓度约为10mm以及介于10mm与约50mm之间，优选约为20mm以及介于20mm与约30mm之间，更优选约为24mm。

7、在又一另外的实施方案中，镁可呈任何盐的形式，包括氯化镁(mgcl2)、乙酸镁(mgoac2)。

8、在特定实施方案中，所述体外转录反应中的rna还可包含以下各项的一种或多种：5'帽、一种或多种经修饰的核苷和/或poly(a)尾。

9、在另外的方面，本发明提供了至少约35mm镁在ivt反应中用于减少所述ivt反应期间双链rna(dsrna)的形成的用途。

10、附图简述

11、现在具体地参考附图，要强调的是，所示的细节是示例性的，并且仅用于说明性论述本发明的不同实施方案的目的。它们是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和最容易的描述而提出的。在这方面，除了对本发明的基本理解所必需的之外，没有试图更详细地示出本发明的结构细节。结合附图的描述使本领域技术人员清楚可以如何在实践中实施本发明的几种形式。

12、图1：未加帽的rna(图a)和有cleancap(cap-1)的rna(图b)在24mm对比55mm的镁的浓度下的体外转录后检测到的dsrna的量。

13、与使用24mm mg的反应相比，使用55mm mg使dsrna的量平均减少了62％(图a和图b的平均值)。条纹柱代表24mm的mg浓度，而实心柱代表55mm的mg浓度。相同的样品彼此相邻排列，但用不同量的mg处理(分别为24mm mg对比55mm mg)。所有五种测试的mrna都有不同的开放阅读框，并共享长度为120个核苷酸的统一的polya尾。

14、图2：在用24mm和55mm mg处理的体外转录反应后，利用样品的抗dsrna j2抗体进行的免疫印迹的显影带强度。

15、箭头表示相同的但用不同量的mg(分别为24mm mg对比55mm mg)处理的样品。

16、图3：未加帽的rna(图a)和有cleancap(cap1)的rna(图b)在24mm镁对比55mm镁的浓度下的体外转录反应产率(μg)。

17、条纹柱代表24mm mg浓度，而实心柱代表55mg浓度。相同的样品彼此相邻排列，但用不同量的mg处理(分别为24mm mg对比55mm mg)。

18、发明详述

19、现在将进一步描述本发明。在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指出相反的情况，否则可将如此定义的每个方面可以与任何其它方面组合。特别地，可将被指示为优选的或有利的任何特性与被指示为优选的或有利的任何其它特性组合。

20、如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。举例来说，“一种(a)化合物”是指一种化合物或不止一种化合物。

21、当涉及可测量值诸如参数、量、持续时间等时，本文所用的术语“约”或“大约”意指包括指定值的+/-10％或更小、优选+/-5％或更小、更优选+/-1％或更小、还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这些变化适于在所公开的发明中实施。应该理解的是，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也是具体地、优选地公开的。

22、本发明涉及在ivt反应期间减少dsrna形成的方法。本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的纯化的体外转录的rna组合物。本发明的发明人意外地发现：在反应中利用最佳镁浓度可以在ivt期间减少dsrna副产物的形成。特别地，本发明描述了与约19mm镁的常规浓度相比在至少约35mm镁存在的情况下，在体外转录期间减少dsrna形成的方法。这种产生ivt rna的方法的主要优点是dsrna减少了50-70％，同时产生的rna的产率和完整性没有受损。另外，所描述的方法与不同种类mrna的制备方法兼容，所述不同种类mrna包括未加帽的rna、cap-0和cap-1(cleancap)rna、核苷被修饰的rna(例如n1-甲基假尿苷)、rna或具有和不具有polya尾的rna。

23、在第一方面，本发明提供了用于在体外转录(ivt)反应期间减少双链rna(dsrna)形成的方法，其包括在至少约35mm镁存在的情况下进行所述ivt反应。

24、在本发明的说明书中，术语‘减少(reducing)’或者可选地‘以减少(to reduce)’意指‘缩减(lessen)’、‘减少(decrease)’、‘最少化(minimize)’或‘减少(diminish)’dsrna的形成。因此，当样品在体外转录后在正常情况下含有特定量的dsrna时，术语“减少”意指当将所述样品经历本发明的方法时，所述dsrna的量较低。特别地，当与正常情况相比时，dsrna的量优选减少至少10％，诸如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％。

25、在本发明的说明书中，术语“形成”意指在所述体外转录反应中dsrna的“出现”、“发生”、“起源”或“产生”。具体而言，体外转录后获得的分子通常包含dsrna，而我们已经确定反应中存在升高的镁会导致这种dsrna的形成减少。

26、在本发明的说明书中，术语“rna”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-d-呋喃核糖基的2′-位具有羟基的核苷酸。特别地，该术语指双链rna，但也可以指单链rna、分离的rna诸如部分纯化的rna、基本上纯的rna、合成的rna、重组产生的rna，以及与天然存在的rna相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变的经修饰的rna。此类改变可包括非核苷酸物质诸如向rna的一个或多个末端或内部(例如在rna的一个或多个核苷酸处)的添加。rna分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的rna可被称为天然存在的rna的类似物。

27、根据本发明，术语“rna”包括并优选涉及意指“信使rna”的“mrna”以及涉及可使用dna作为模板产生并编码肽或蛋白质的“转录物”。mrna通常包含5'非翻译区(5'-utr)、蛋白质或肽编码区和3′非翻译区(3′-utr)。mrna在细胞和体外具有有限的半衰期。

28、术语“经修饰的mrna分子”意指含有一个或多个经修饰的核苷的mrna分子(称为“经修饰的核酸”)，其具有有用的特性，诸如基本上不诱导对引入该mrna的细胞的先天免疫应答。这些经修饰的核酸提高了蛋白质生产的效率、核酸的细胞内滞留和接触的细胞的存活力，并具有降低的免疫原性。示例性合适的经修饰的核苷可以是例如n1-甲基假尿苷。

29、为了清楚起见，mrna包括任何编码rna分子，其可以被真核宿主翻译成蛋白质。

30、优选地，使用dna模板通过体外转录产生mrna。在本发明的一个实施方案中，通过体外转录获得rna。体外转录方法是技术人员已知的，并且可包含含有启动子的纯化的线性dna模板、核糖核苷酸三磷酸、含有二硫苏糖醇(dtt)和镁离子的缓冲系统、亚精胺和合适的rna聚合酶，诸如t7 rna聚合酶。转录反应中使用的确切条件取决于特定应用所需的rna量。存在多种商购可得的体外转录试剂盒。

31、在本发明的说明书中，术语“双链rna”或“dsrna”是指具有足够的内部同源性以形成显著的二级结构诸如发夹的任何rna分子，所述二级结构的形成是由于内部互补序列通过互补序列内的核苷酸碱基的watson-cr ick碱基配对而彼此杂交导致的。重要的二级结构通常涉及同源性大于约9个碱基的区段，但确切的长度在一定程度上取决于上下文和此类二级结构是否赋予分子任何生物学功能。特别地，体外转录后获得的分子通常包含具有两条独立互补链的dsrna，并且大小可以变化，例如从20个核苷酸变化至200个核苷酸或者甚至超过500个核苷酸。

32、在本发明的说明书中，dsrna是作为ivt反应中鉴定的副产物形成的，其可由t7rna依赖性rna聚合酶活性产生。特别地，ivt反应中三种主要类型的副产物可导致dsrna分子的形成。第一种是通过与流失转录物(run-off transcript)的体中的互补序列顺式(通过折叠回同一rna分子上)或反式(与第二rna分子退火)退火的流失产物(run-offproduct)的3'-延伸(以形成延伸的双链体)形成的。第二种类型的dsrna分子是通过反义rna分子与流失转录物杂交而形成的。据报道，反义rna分子是以不依赖于启动子和不依赖于流失转录物的方式形成的。或者，全长反义rna的不依赖于启动子的转录也被报道为在t7rnapol驱动的ivt反应中产生dsrna的新型机制。dsrna的第三种形式由无效转录物(abort ive transcr ipt)的顺式(即在同一分子内)或反式(在两个不同分子之间)随机配对产生。根据本发明，dsrna包括ivt反应中任何种类的所述rna副产物。

33、检测dsrna的方法基本上依赖于免疫学方法，诸如免疫荧光、elisa、免疫印迹以及不依赖于抗体的方法诸如核酸荧光原位杂交(fish)或基于纤维素的dsrna分离，也已用于dsrna检测。如本文中所用以及如实施例中所述，免疫学方法诸如抗dsrna j2抗体免疫印迹法使用抗体作为特异性识别dsrna所采用的a-螺旋结构的结构探针。商购可得的j2抗dsrnaigg2a(以及在较小程度上的igg2a k1和igm k2 mab或9d5 mab)已经成为dsrna检测中的金标准。此外，完整的质谱可用于定量不同3′-末端延伸的dsrna种类的丰度和长度。

34、如本文中所用，除非另有说明，否则术语“镁”或“mg”应理解为所有已知活生物体的所有细胞的基本核酸化学所必需的化学元素。超过300种酶的催化作用需要镁离子，包括使用或合成atp的酶和使用其它核苷酸合成dna和/或rna的酶。根据本发明，mg2+离子由任何所述的镁形式提供，并被需要来催化由例如rna聚合酶诸如t3、t7、sp6、焦磷酸酶和dna酶i驱动的反应。因此，该组分需要在整个反应中提供，并对酶具有特定功能，因此影响ivt产率。特别地发现，当与正常情况相比时，向ivt反应中加入高浓度的mg(优选约为35mm以及介于35mm与约150mm之间，优选约为40mm以及介于40mm与约100mm之间，更优选约为45mm以及介于45mm与约75mm之间，最优选约为55mm)导致dsrna的形成减少，优选减少至少10％，诸如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％。

35、特别地，镁与ntp的比率是通过t7聚合酶的催化活性影响高效ivt的关键参数。例如，10mm的每种ntp与75mm的镁阴离子的组合产生最好的ivt rna产率，而5mm的每种ntp为一半好，20mm的每种ntp太多。

36、在特定实施方案中，当与正常环境相比时，ivt反应后的产率未受损害或优选增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％、至少200％或甚至更多。特别地，发现较高量的镁显著增加了ivt反应的rna产率。

37、在具体实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应后rna的完整性没有受损或优选增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至更高。rna的完整性可以通过任何合适的方法，诸如通过毛细管电泳峰分布图测量，所述毛细管电泳峰分布图可在生物分析仪上获得。具体而言，在本文进行的实验中未观察到明显的降解，并且对于使用24mm镁对比55mm镁的条件，峰分布图几乎相同。

38、在本发明的具体实施方案中，镁的浓度约为35mm以及介于35mm与约150mm之间，优选约为40mm以及介于40mm与约100mm之间，更优选约为45mm以及介于45mm与约75mm之间，最优选约为55mm。

39、在一些实施方案中，所述镁浓度可以是至少约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70mm。在特定实施方案中，存在的镁的浓度优选为约35mm、约45mm或约55mm。

40、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约35mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

41、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约40mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

42、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约45mm镁的存在将dsrna的形成减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。

43、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约50mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

44、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约55mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

45、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约60mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

46、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约65mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

47、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约70mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

48、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约75mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

49、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约80mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

50、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约85mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

51、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约90mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

52、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约95mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

53、在一些实施方案中，当与正常情况相比时，ivt反应中约100mm镁的存在将dsrna的形成减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。

54、在又一另外的实施方案中，镁呈选自包括氯化镁(mgcl2)、乙酸镁(mgoac2)的组的形式。

55、在特定实施方案中，镁的形式选自包括以下物质的组：氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氢氧化镁、氧化镁、葡萄糖酸镁、苹果酸镁、乳清酸镁、甘氨酸镁、抗坏血酸镁、柠檬酸镁、硼酸镁、水杨酸镁、溴化镁、硬脂酸镁、碳酸镁或其任意组合。

56、特别地，在体外转录(ivt)反应期间，镁以氯化镁的形式存在。

57、在另外的实施方案中，在焦磷酸酶存在的情况下进行所述ivt反应。

58、在本发明方法的另一个具体实施方案中，焦磷酸酶的浓度约为0.01u/ml以及介于0.01u/ml与约40u/ml之间，优选约为0.1u/ml以及介于0.1u/ml与约20u/ml之间，更优选约为1u/ml以及介于1u/ml与约10u/ml之间，最优选约为5u/ml。

59、在一些实施方案中，所述焦磷酸酶的浓度可以是至少约0.01u/ml。在特定实施方案中，存在的焦磷酸酶的浓度优选为约5u/ml。

60、如本文中所用，术语“焦磷酸酶”，也称为二磷酸酶，应被理解为作用于二磷酸键的酸酐水解酶。该术语优选涉及无机焦磷酸酶，其催化无机焦磷酸盐水解形成正磷酸盐。当核苷三磷酸被掺入/聚合到生长链中时，无机焦磷酸被释放出来。焦磷酸是rna聚合的抑制剂，因此，去除焦磷酸导致ivt中rna产率的增加。mg离子对于结晶焦磷酸酶的催化活性是必需的。

61、另一方面，焦磷酸酶也可选自包括以下物质的列表：烟草酸焦磷酸酶(其催化磷酸酯的水解)、各种有机焦磷酸酶(其作用于具有焦磷酸基团的有机分子)(但不包括作用于最终键的三磷酸酶)、硫胺素焦磷酸酶。

62、在本发明的具体实施方案中，通过添加诸如选自包括以下物质的列表的金属螯合剂来终止所述ivt转录反应：bapta(1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n，n，n′，n′-四乙酸)、dfoa(甲磺酸去铁胺)、二甲氧基硝基苯胺(1-(2-硝基-4，5-二甲氧基苯基)-1，2-二氨基乙烷-n，n，n′，n′-四乙酸)、edta(乙二胺四乙酸)、egta(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n，n，n′，n′-四乙酸)、cdta(1，2-环己二腈)四乙酸)、dpta(二亚乙基三胺五乙酸)、pih(吡哆醛异烟酰腙)、tpen(n′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)。

63、在具体实施方案中，通过添加金属螯合剂诸如edta来终止所述ivt转录反应。

64、如本文中所用，术语“edta”应理解为充当金属离子的清除剂的氨基多羧酸。这导致金属依赖性酶的失活，或者作为其反应性的测定，或者抑制对dna、蛋白质和多糖的损伤。除了金属离子螯合之外，edta还作为针对dntp水解酶诸如taq聚合酶、dutp酶、mutt等的选择性抑制剂。

65、特别地，如本发明中所用，edta螯合二价阳离子诸如镁，并且是保护rna在酶失活过程中不被降解所必需的。核酸酶活性，特别是rna核酸酶高度依赖于二价阳离子镁的浓度。特别地，已知一分子金属螯合剂诸如edta能够螯合一个金属离子。因此，添加金属螯合剂可能有两个益处。一方面，其将停止需要作为辅因子的金属离子存在的酶促反应，其次，其将螯合金属离子，从而防止聚集体的形成。

66、在另一个具体实施方案中，所述金属螯合剂的浓度约为10mm以及介于10mm与约50mm之间，优选约为20mm以及介于20mm与约30mm之间，更优选约为24mm。

67、在特定实施方案中，所述体外转录反应中的rna可以是加帽和未加帽的rna、经修饰和未经修饰的rna、或者有和无poly(a)尾的rna、或其任意组合。准备好被核糖体高效翻译的成熟mrna包含两种主要修饰：5'帽结构和poly(a)尾。此外，使用大量镁的ivt反应不会损害短或长rna分子，即其对小和长的模板同样有效。

68、根据本发明，rna分子，诸如信使rna(或mrna)，包括以下类型：无poly(a)尾的未加帽的未经修饰的rna、具有poly(a)尾的未加帽的未经修饰的rna、无poly(a)尾的未加帽的经修饰的rna、具有poly(a)尾的未加帽的经修饰的rna、无poly(a)尾的加帽的未经修饰的rna、具有poly(a)尾的加帽的未经修饰的rna、无poly(a)尾的加帽的经修饰的rna、具有poly(a)尾的加帽的经修饰的rna。

69、在本发明的说明书中，术语“加帽的rna”应理解为其5'末端通过5'至5'三磷酸键联或类似物与鸟苷或经修饰的鸟苷(优选为7-甲基鸟苷(n7-甲基鸟苷或m7g))连接的rna分子。rna结构的“加帽”在多种细胞过程中起着至关重要的作用，所述细胞过程包括翻译起始、剪接、细胞内运输和周转(turnover)。加帽的mrna的体外合成通过噬菌体rna聚合酶(t7、sp6或t3)介导的体外转录来进行，所述体外转录在转录物的5'末端共转录掺入帽类似物。或者，转录后酶促加帽也可用于给ivt产生的rna分子添加5'帽。

70、如本文中所用，“帽类似物”是在生物学上等同于7-甲基鸟苷(m7g)的帽，并且包括常规类似物，诸如g(5')ppp(5')g、m7g(5')ppp(5')g或m2，2，7g(5')ppp(5')g，以及抗反向帽类似物(ant i-reverse cap ana log)(arca)3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)g、未甲基化的帽类似物g(5′)ppp(5′)g、a+1位点的甲基化的帽类似物m7g(5′)ppp(5′)a；a+1位点的未甲基化的帽类似物g(5′)ppp(5′)a。抗反向帽类似物(arca)是其中3′oh基团(更接近m7g)被-och3替代(这迫使arca以正确的方向掺入，随后产生可翻译的mrna群)的经修饰的帽类似物。

71、在一些优选实施方案中，本发明的方法中使用的mrna具有5'帽结构(其具有所谓的cap-1结构(cleancap))，这意味着相对于帽核苷酸倒数第二个核苷酸中核糖的2′羟基被甲基化，诸如下面所示的：

72、

73、在本发明的说明书中，术语“未加帽的rna”应理解为不包含定义“加帽的rna”中所定义的帽的任何rna分子。因此，在特定实施方案中，“未加帽的mrna”可以指其5'末端没有通过5'至5'三磷酸键联或先前定义的类似物与7-甲基鸟苷连接的mrna。

74、在本发明的说明书中，术语“经修饰的rna”应理解为含有至少一个经修饰的核苷酸、核苷或碱基，诸如经修饰的嘌呤或经修饰的嘧啶的rna分子。经修饰的核苷或碱基可以是非a、u、c或g(对于核苷分别是腺苷、尿苷、胞苷或鸟苷；当仅指糖部分时是腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤)的任何核苷或碱基。

75、在本发明的说明书中，术语“未经修饰的rna”应理解为不包含定义“经修饰的rna”中所定义的修饰的任何rna分子。

76、如本文中所用，术语“poly(a)尾”应理解为包含多个单磷酸腺苷的部分，并且是本领域众所周知的。poly(a)尾通常在称为多腺苷酸化的步骤中产生，所述多腺苷酸化是翻译后修饰中的一种，通常发生在成熟信使rna的产生过程中；这种poly(a)尾有助于所述mrna的稳定性和半衰期，并且长度可变。特别地，poly(a)尾可以等于或长于10个腺苷核苷酸，其包括等于或长于20个腺苷核苷酸，其包括等于或长于100个腺苷核苷酸，例如约120个腺苷核苷酸。

77、在本发明的说明书中，术语“无poly(a)尾”应理解为不包含定义“poly(a)尾”中所述的poly(a)尾的任何rna分子。

78、在本发明的意义上，术语“经修饰的和未经修饰的”被认为不同于“加帽的和未加帽的”，因为后者明确涉及rna分子的5'末端的碱基，也不同于“具有poly(a)尾和无poly(a)尾”。

79、在另外的方面，本发明提供了至少约35mm镁在ivt反应中用于减少所述ivt反应期间双链rna(dsrna)的形成的用途。

80、实施例

81、材料和方法

82、将ivt粗反应物或纯化的ivt rna样品点样在带正电荷的尼龙膜上(ζ-探针印迹膜，bio-rad)。将膜在5％(w/v)的于tbs-t缓冲液(20mm tris，ph 7.4，150mm nacl，0.05％(v/v)tween-20)中的脱脂奶粉中进行封闭。为了检测dsrna，将膜与j2抗dsrna抗体(1∶5000；scicons)在4℃孵育过夜。用针对ms igg2a，hrp的山羊pab(abcam)探测印迹。将dsrna标准稀释物(1000bp)用于生成线性标准曲线。

83、结果

84、dsrna减少

85、可通过提高反应中的镁浓度在体外转录(ivt)期间减少双链rna(dsrna)副产物的形成。对于未加帽的rna和cleancap rna，在24mm mgcl2下进行ivt反应与在ivt中利用55mmmg进行的反应相比都显示了更高的dsrna形成量(图1)。与利用24mm mgcl2的ivt反应相比，浓度为55mm的mgcl2使dsrna形成平均减少了62％。利用抗dsrnaj2抗体的免疫印迹证实了dsrna的减少(图2)。可在下表中找到对应于图2的所用组合物的细节和定量数据：

86、 1 2 3 a hucd70-24 e7-55 tr4-24(cc) b ctr e6-24 n/a c hucd70-55 e6-55 trl4-55(cc) d hucd40l-24 cd70-24(cc) ctr e hucd40l-55 cd70-55(cc) e7-24(cc) f tlr4-24 cd40l-24(cc) e7-55(cc) g tlr4-55 ctr e6-24(cc) h e7-24 cd40l-55(cc) e6-55(cc)

87、 1 2 3 a 74015 29905 31888 b 18792 46112 n/a c 25489 13479 17228 d 53154 39772 18061 e 19002 15740 36486 f 76535 34078 13644 g 23205 17787 11799 h 58633 12528 3820

88、rna产率和完整性

89、对于未加帽的rna以及cleancap rna两者，与利用24mm mgcl2的反应相比，在55mmmgcl2存在的情况下，ivt反应后的rna产率没有显著降低(图3，图a和图b)。另外，与利用24mm mgcl2的反应相比，当用55mm mgcl2进行ivt时，rna的完整性没有受损(数据未显示)。

90、滴定结果

91、进行进一步的滴定实验，其中使用递增浓度的镁。从下表可以明显看出，当使用递增浓度的镁时，dsrna浓度显著降低，其中与24mm镁相比，35mm镁使dsrna的量减少超过50％。

92、

93、结论

94、向体外转录混合物中加入高浓度的镁显著减少了双链rna的形成。例如，与利用24mm mgcl2的ivt反应相比，浓度为55mm的mgcl2使dsrna的形成平均减少了62％。所描述的方法与不同种类的mrna的制备方法兼容，所述不同种类的mrna包括未加帽的rna、cleancaprna、n1u修饰的rna、有和无polya尾的rna。主要的优点是可以使mrna合成工作流程至进一步纯化组合物的额外步骤减少至最少。

95、参考文献

96、mu x，greenwald e，ahmad s，hur s.an origin of the immunogenicity of invitro transcribed rna.nucleic acids res.2018 jun 1；46(10)：5239-5249.