结合并中和委内瑞拉马脑炎病毒的单结构域抗体的制作方法

背景技术：

1、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus，veev)，披膜病毒科(togaviridae)甲病毒属的一员，是人类和马中一种重要的蚊媒病原体。veev感染主要针对中枢神经系统和淋巴组织，从而在马中导致严重的脑炎，以及一系列人类疾病(包括从不明原因或亚临床感染到急性脑炎)。4-14％的病例是神经系统疾病。在马流行病期间，人类感染的发生率可能高达30％。与儿童脑炎相关的死亡率高达35％。1995年，委内瑞拉和哥伦比亚爆发疫情，造成大约10万的人类病例，其中超过300例为致命脑炎。此外，veev通过气溶胶吸入在人类和其他动物中具有高度传染性。

2、不认为任何抗病毒药物已显示出对veev有效。虽然已经有两种试验性的新药veev疫苗形式可供人类和兽医使用，但其远不能令人满意。例如，大约20％接受一种疫苗的接受者无法产生中和性抗体(ab)，而另有20％表现出反应原性，而且该疫苗可以恢复为野生型。另一种疫苗需要多次免疫接种，定期加强，在一些啮齿动物模型中无法提供保护抵御气溶胶攻击。

3、与其他甲病毒类似，veev是一种包膜病毒，具有三种结构蛋白质：一个封装病毒rna基因组的衣壳，以及两种包膜糖蛋白e1和e2。e1和e2形成异二聚体，其可作为三聚体刺突从病毒包膜中突出。刺突上的表位是中和性抗体的靶标。研究已表明，病毒中和表位主要位于e2蛋白上，并且e2c表位似乎是中和表位的枢纽。鼠单克隆抗体抗体(mab)1a4a114对e2c具有特异性。该mab已显示出在保护动物免受剧毒veev的致命外周攻击方面是有效的。然而，鼠mab作为人类治疗剂具有严重的缺点。例如，与在人类中使用鼠mab相关的其中一个问题是其会诱导抗鼠ab反应。此外，重复施用鼠mab会导致鼠mab被快速清除和产生过敏反应，这有时可以是致命性的。人源化鼠mab已被提出以降低抗体在人类中的免疫原性。然而，这些抗体仍然是较大的复杂分子，生产成本昂贵，保质期短，需要维持冷链。此外，由于其尺寸，其无法穿过血脑屏障，因此对治疗脑炎感染无效，并且生物工程师很难使其具有额外的所需性能。

4、对于检测应用，许多免疫测定依赖于源自小鼠、兔、山羊或绵羊的单克隆或多克隆抗体(igg)作为识别元件。功能性igg包括四条多肽链，两条相同的重(h)链和两条相同的轻(l)链，通过二硫键连接。每个抗体具有两个通过来自h链和l链的相邻可变(v)结构域的相互作用形成的抗原结合结构域。抗原结合表面由六个互补决定区(cdr)构成，各有三个位于vh和vl蛋白质结构域中。这六个尺寸和序列各异的cdr环的相互作用使得能够形成具有拓扑结构的多样化抗原结合表面以识别各种抗原靶标。虽然常规抗体具有敏感性和特异性，但开发起来耗时且昂贵，并且稳定性有限。图1示出了igg以及克隆结合衍生物的示意性图示。仅包含vh和vl结构域以形成最小抗原结合构建体的常规igg的克隆衍生物已经用作识别元件以用于生物传感器应用。这些单链抗体(scfv)可以在细菌中表达，并且可以通过蛋白质工程化修饰以调整抗体片段的功能性和特性。然而，scfv通常不如亲本全长抗体稳定，并且就像全长抗体一样，由于其双结构域结构，其在高温下会不可逆地聚集。理想地，开发能够进行抗原结合的单结构域结构将避免加热时聚集，并将有助于在高温环境下或长时间连续使用生物传感器。

5、某些动物，如骆驼科(即骆驼、美洲驼)和鲨鱼，具有一类由重链同源二聚体组成的免疫球蛋白，其中抗原结合通过单v结构域介导。这些v结构域在克隆为单结构域抗体(sdab，也称为纳米抗体或vhh)时包含已知的最小抗原结合片段(12-15kda)，大约是常规抗体尺寸的十分之一。这能够使他们实现和识别常规抗体无法识别的相对难以接近的表位。尽管sdab尺寸小，但是其展示出对其抗原具有高水平的特异性和亲和力，并且已显示出对半抗原和蛋白质具有纳摩尔亲和力。其可以在化学或热变性后重新折叠以结合抗原，从而使其能够在暴露于高温后保持结合抗原的能力。多项研究已发现，sdab具有固有的热稳定性，表明其在高温下能够进行抗原结合，这说明其将非常适合长期现场应用，其中冷藏通常是不可能的。基于sdab的识别元件应提供常规抗体的特异性，并具有在高温下使用和存储以及传感器表面再生的潜力。sdab的序列通常由三个不同的称为cdr1、cdr2和cdr3的互补决定区(cdr)和四个更加保守的框架区(fr)构成。具体的sdab的表位结合主要由cdr决定，cdr3是抗原识别的主要贡献者。

6、sdab还具有多种有吸引力的特征以用于治疗应用。同样，其稳定性使其在室温下稳定，而大部分的抗体治疗需要冷藏。其尺寸小意指相同重量的蛋白质将具有更高的比活性且在整个组织中扩散得更快。其缺少fc结构域还有利于veev治疗，其中fc介导的免疫反应效果似乎更多是造成veev感染的长期负面影响(即多发性关节炎)的原因。

技术实现思路

1、在一个实施方案中，一种针对委内瑞拉马脑炎病毒(veev)的骆驼重链抗体(vhh)的分离的可变结构域，也称为单结构域抗体(sdab)或纳米抗体，包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与选自由seq id no：1-8组成的组的序列具有至少70％的总氨基酸序列同一性，并且在cdr1、cdr2和cdr3区域中具有至少75％的氨基酸序列同一性。

2、第二实施方案是第一实施方案的sdab，其与选自由seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5组成的组的序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的总氨基酸序列同一性。

3、第三实施方案是第一或第二实施方案的sdab，其中在cdr1、cdr2和cdr3的每个中的氨基酸序列同一性为大于75％，例如76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

4、在另一个实施方案中，分离的抗体包含通过肽接头连接在一起的上述sdab中的两个。

5、另一个实施方案是包含根据上述任一个实施方案中的sdab的多肽，包括被配置为提供所需功能的额外的氨基酸序列。

6、在另一个实施方案中，一种检测veev的方法包括在允许与抗原结合的条件下将已知或疑似含有veev的样本与结合或固定化的前述实施方案的抗体接触；以及冲洗抗体以去除未结合的组分，其中样本中的任何veev的至少一部分保持与抗体结合，从而根据需要进行附加步骤以产生指示样本中是否存在veev的反应。在另一个方面，样本来自患者，并且如果在样本中检测到veev，则为患者提供针对veev感染的适当治疗。

7、另一个实施方案是一种药物，包含一种或多种如上所述的抗体以及药学上可接受的载体。

8、另一个实施方案是一种治疗方法，包括向有需要的个体施用药物实施方案。