β-葡聚糖测定用试剂、其制造方法及用途与流程

本发明涉及新型的β-葡聚糖测定用试剂的提供和用途。

背景技术：

1、真菌病是由真菌的感染而引起的疾病，已知有真菌在皮肤、粘膜等身体表面引起感染的浅表性真菌病、在肺、血液等身体的深部引起感染的深部性真菌病。构成真菌细胞壁的多糖的特征在于包含β-葡聚糖这一点。因此，作为真菌病(特别是深部性真菌病)的检查、诊断方法，利用β-葡聚糖检测。

2、已知鲎的血细胞提取物(amebocyte lysate)与β-葡聚糖反应而凝固，被用作β-葡聚糖测定用试剂。如果β-葡聚糖与血细胞提取物接触，则存在于血细胞提取物中的因子g被活化，生成具有丝氨酸蛋白酶活性的活性型因子g。该活性型因子g切断存在于血细胞提取物中的凝固酶原(proclotting enzyme)，生成具有丝氨酸蛋白酶活性的活性型凝固酶原(即，凝固酶(clotting enzyme))。该活性型凝固酶原切断存在于血细胞提取物中的凝固蛋白原，通过由此生成的凝固素的作用，血细胞提取物凝固(图1)。利用这一系列的级联反应，设计了包含测定用底物的β-葡聚糖测定用试剂，所述测定用底物包含基于活性型凝固酶原的切断序列。

3、使用重组技术等人工生产上述因子g、凝固酶原，尝试创造出不依赖于鲎血细胞提取物的β-葡聚糖测定用试剂。例如，在国际公开95/001432号(专利文献1)中记载了关于包含因子g的(1→3)-β-d-葡聚糖结合部位的多肽和编码其的cdna的发明。在国际公开2008/004674号(专利文献2)中，记载了涉及编码来自鲎的凝固酶原的核酸等的发明。在日本特开2006-271384号(专利文献3)中，记载了关于保持有编码源自鲎的因子g的α亚基的dna的病毒的发明。在国际公开2021/117841号(专利文献4)中记载了关于具有特定氨基酸序列的因子gα亚基与具有特定氨基酸序列的因子gβ亚基的组合的异二聚体的发明。在国际公开2021/117841号(专利文献4)中还记载了关于源自以昆虫细胞为宿主进行表达得到的美洲鲎的重组因子g的发明。

4、现有技术文献

5、专利文献

6、专利文献1：国际公开95/001432号

7、专利文献2：国际公开2008/004674号

8、专利文献3：日本特开2006-271384号

9、专利文献4：国际公开2021/117841号

技术实现思路

1、使用人工生产的因子g、凝固酶原的以往的β-葡聚糖测定用试剂的性能不充分。

2、例如，在专利文献2的实施例3中公开了使用重组因子g和重组凝固酶原确认基于β-葡聚糖的活性表达的结果。但是，在专利文献2记载的发明中，活性表达最低也需要1ng/ml的高浓度的β-葡聚糖。

3、在专利文献3中，相对于总容量125.1μl，即使使用0.25ng的β-葡聚糖(即，2ng/ml的β-葡聚糖)，反应也需要24小时的长时间，在诊断真菌病中不能令人满意。

4、另外，在专利文献4的实施例3中，记载了通过使用包含特定因子gα亚基和β亚基的共表达物的上清，可以确认到香菇多糖(β-葡聚糖的一种)的下限到0.35pg/ml为止可以显著检测。但是，专利文献4记载的发明也需要试剂与试样混合后200分钟的长时间的反应。

5、本发明的课题在于，提供一种高性能的β-葡聚糖测定用试剂、在该试剂的制造中有用的原料，其不需要鲎血细胞提取物。

6、用于解决技术问题的技术方案

7、根据本发明的一个方面，通过在β-葡聚糖与试剂的反应时使特定的成分共存，从而能够提供高性能的β-葡聚糖测定用试剂，其不需要鲎血细胞提取物。

8、根据本发明的另一方面，提供一种利用哺乳类细胞的基因重组因子g的高效率的生产方法。

9、即，本发明包含以下的方式。

10、[1-1]一种β-葡聚糖测定用试剂，其包含源自鲎的因子d、源自鲎的因子g、源自鲎的凝固酶原和测定用底物，

11、所述β-葡聚糖测定用试剂不含鲎血细胞提取物。

12、[1-2]根据[1-1]所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d、所述源自鲎的因子g和源自鲎的凝固酶原为重组蛋白。

13、[1-3]根据[1-1]或[1-2]所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，茯苓聚糖(pachyman)的检测极限值在60分钟以内的反应时间内为20pg/ml以下。

14、[1-4]根据[1-1]～[1-3]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，茯苓聚糖的检测极限值在40分钟以内的反应时间内为16pg/ml以下。

15、[1-5]根据[1-1]～[1-4]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

16、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

17、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

18、[1-6]根据[1-1]～[1-4]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

19、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

20、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

21、[1-7]根据[1-1]～[1-6]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

22、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

23、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

24、[1-8]根据[1-1]～[1-6]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

25、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

26、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

27、[1-9]根据[1-1]～[1-8]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

28、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

29、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

30、[1-10]根据[1-1]～[1-8]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

31、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

32、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33中的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

33、[1-11]根据[1-1]～[1-10]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

34、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

35、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

36、[1-12]根据[1-1]～[1-10]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

37、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

38、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

39、[1-13]根据[1-1]～[1-12]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎、美洲鲎、圆尾鲎、或南方鲎。

40、[1-14]根据[1-1]～[1-12]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎或美洲鲎。

41、[1-15]根据[1-1]～[1-14]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述测定用底物由通式y-x-z表示：

42、其中，上述通式中，y为氢原子或保护基，x为包含所述源自鲎的凝固酶原的底物序列的肽，z为标记物。

43、[1-16]根据[1-15]所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述标记物为光学标记物。

44、[1-17]根据[1-1]～[1-16]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的因子g源自中华鲎或美洲鲎。

45、[1-18]根据[1-1]～[1-17]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂，其中，所述源自鲎的凝固酶原源自中华鲎或美洲鲎。

46、[2-1]一种β-葡聚糖测定用试剂的制备方法，其包括以下工序，

47、人工生产源自鲎的因子d的工序，以及

48、将所述人工生产的源自鲎的因子d至少与源自鲎的因子g、源自鲎的凝固酶原和测定用底物一起进行试剂盒化的工序。

49、[2-2]根据[2-1]所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d的人工生产为使用宿主细胞的重组生产。

50、[2-3]根据[2-1]或[2-2]所述的制造方法，其中，利用所述β-葡聚糖测定用试剂的茯苓聚糖的检测极限值在60分钟以内的反应时间内为20pg/ml以下。

51、[2-4]根据[2-1]～[2-3]中任一项所述的制造方法，其中，利用所述β-葡聚糖测定用试剂的茯苓聚糖的检测极限值在40分钟以内的反应时间内为16pg/ml以下。

52、[2-5]根据[2-1]～[2-4]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

53、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

54、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

55、[2-6]根据[2-1]～[2-4]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

56、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

57、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

58、[2-7]根据[2-1]～[2-6]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

59、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

60、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

61、[2-8]根据[2-1]～[2-6]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

62、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

63、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

64、[2-9]根据[2-1]～[2-8]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

65、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

66、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

67、[2-10]根据[2-1]～[2-8]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

68、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

69、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33中的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

70、[2-11]根据[2-1]～[2-10]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

71、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

72、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

73、[2-12]根据[2-1]～[2-10]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

74、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

75、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

76、[2-13]根据[2-1]～[2-12]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎、美洲鲎、圆尾鲎、或南方鲎。

77、[2-14]根据[2-1]～[2-12]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎或美洲鲎。

78、[2-15]根据[2-1]～[2-14]中任一项所述的制造方法，其中，所述测定用底物由通式y-x-z表示：

79、其中，上述通式中，y为氢原子或保护基，x为包含所述源自鲎的凝固酶原的底物序列的肽，z为标记物。

80、[2-16]根据[2-15]所述的制造方法，其中，所述标记物为光学标记物。

81、[2-17]根据[2-1]～[2-16]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的因子g源自中华鲎或美洲鲎。

82、[2-18]根据[2-1]～[2-17]中任一项所述的制造方法，其中，所述源自鲎的凝固酶原源自中华鲎或美洲鲎。

83、[3-1]一种β-葡聚糖的检测方法，其包括以下工序，使用[1-1]～[1-18]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂、或通过[2-1]～[2-18]中任一项所述的制造方法制造得到的β-葡聚糖测定用试剂，测定试样中的β-葡聚糖的工序。

84、[3-2]一种β-葡聚糖的检测方法，其包括以下工序，使用[1-1]～[1-13]中任一项所述的β-葡聚糖测定用试剂、或通过[2-1]～[2-13]中任一项所述的制造方法制造得到的β-葡聚糖测定用试剂，测定试样中的β-葡聚糖的工序。

85、[3-3]一种真菌病检测方法，其包括以下工序，

86、进行[3-1]中所述的β-葡聚糖的检测方法的工序，

87、所述试样是源自被怀疑患有真菌病的检测对象的生物试样。

88、[3-4]一种真菌病检测方法，其包括以下工序，

89、进行[3-2]中所述的β-葡聚糖的检测方法的工序，

90、所述试样是源自被怀疑患有真菌病的检测对象的生物试样。

91、[3-5]一种用于诊断真菌病的数据获得方法，其包括以下工序，

92、通过进行[3-1]中所述的β-葡聚糖的检测方法，获得用于诊断检测对象是否患有真菌病的数据的工序，

93、所述试样为源自该检测对象的生物试样。

94、[3-6]一种用于诊断真菌病的数据获得方法，其包括以下工序，

95、通过进行[3-2]中所述的β-葡聚糖的检测方法，获得用于诊断检测对象是否患有真菌病的数据的工序，

96、所述试样为源自该检测对象的生物试样。

97、[4-1]一种β-葡聚糖测定用试剂的活性增强方法，其中，所述β-葡聚糖测定用试剂包含源自鲎的因子g、源自鲎的凝固酶原和测定用底物，

98、所述β-葡聚糖测定用试剂的活性增强方法包括以下工序，使源自鲎的因子d与所述β-葡聚糖测定用试剂共存的工序。

99、[4-2]根据[4-1]所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为重组蛋白。

100、[4-3]根据[4-1]或[4-2]所述的方法，其中，利用活性增强的所述β-葡聚糖测定用试剂的茯苓聚糖的检测极限值在60分钟以内的反应时间内为20pg/ml以下。

101、[4-4]根据[4-1]～[4-3]中任一项所述的方法，其中，利用活性增强的所述β-葡聚糖测定用试剂的茯苓聚糖的检测极限值在40分钟以内的反应时间内为16pg/ml以下。

102、[4-5]根据[4-1]～[4-4]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

103、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

104、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

105、[4-6]根据[4-1]～[4-4]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

106、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

107、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

108、[4-7]根据[4-1]～[4-6]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

109、(1)包含序列号1～12、32、33和67～70中的任一个氨基酸序列；

110、(2)具有相对于序列号1～12、32、33和67～70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

111、[4-8]根据[4-1]～[4-6]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1)或(2)的蛋白质：

112、(1)包含序列号1～12、32和33中的任一个氨基酸序列；

113、(2)具有相对于序列号1～12、32和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

114、[4-9]根据[4-1]～[4-8]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

115、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

116、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

117、[4-10]根据[4-1]～[4-8]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

118、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

119、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33中的至少一个氨基酸序列一致性为约85％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

120、[4-11]根据[4-1]～[4-10]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

121、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70中的任一个氨基酸序列；

122、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12、33、68和70的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

123、[4-12]根据[4-1]～[4-10]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d为下述(1’)或(2’)的蛋白质：

124、(1')包含序列号2、4、6、8、10、12和33中的任一个氨基酸序列；

125、(2')具有相对于序列号2、4、6、8、10、12和33的至少一个氨基酸序列一致性为约90％以上的氨基酸序列，且具有因子d的功能。

126、[4-13]根据[4-1]～[4-12]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎、美洲鲎、圆尾鲎、或南方鲎。

127、[4-14]根据[4-1]～[4-12]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子d源自中华鲎或美洲鲎。

128、[4-15]根据[4-1]～[4-14]中任一项所述的方法，其中，所述测定用底物由通式y-x-z表示：

129、其中，上述通式中，y为氢原子或保护基，x为包含所述源自鲎的凝固酶原的底物序列的肽，z为标记物。

130、[4-16]根据[4-15]所述的方法，其中，所述标记物为光学标记物。

131、[4-17]根据[4-1]～[4-16]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的因子g源自中华鲎或美洲鲎。

132、[4-18]根据[4-1]～[4-17]中任一项所述的方法，其中，所述源自鲎的凝固酶原源自中华鲎或美洲鲎。

133、[5-1]一种β-葡聚糖测定用试剂的原料的制造方法，其包括以下工序，培养利用分别编码源自中华鲎的因子g的α亚基和β亚基的dna这两者进行转化得到的哺乳类细胞的工序；以及回收培养后的培养上清的工序。

134、[5-2]根据[5-1]所述的制造方法，其中，还包括以下工序，在所述培养上清中共存源自美洲鲎的凝固酶原的工序。

135、[5-3]根据[5-1]或[5-2]所述的制造方法，其中，所述哺乳类细胞为cho细胞，优选为cho dg44细胞。

136、[6-1]一种哺乳类细胞的培养上清，所述哺乳类细胞利用分别编码源自中华鲎的因子g的α亚基和β亚基的dna这两者进行转化得到。

137、[6-2]根据[6-1]所述的培养上清，其中，还含有源自美洲鲎的凝固酶原。

138、[6-3]根据[6-1]或[6-2]所述的培养上清，其中，所述哺乳类细胞为cho细胞，优选为cho dg44细胞。

139、[6-4]一种β-葡聚糖测定用试剂的原料，其包含[6-1]～[6-3]中任一项所述的培养上清。